周曉麗 譯

（北京屯玉種業(yè)有限責(zé)任公司，北京海淀 100193）

檢測分析

基于UPLC-Q-Exactive Orbitrap Mass技術(shù)的山羊奶、大豆奶、牛奶的脂質(zhì)組分析研究

周曉麗 譯

（北京屯玉種業(yè)有限責(zé)任公司，北京海淀 100193）

乳制品是不同種類脂質(zhì)的豐富來源，對人類健康至關(guān)重要。本研究基于UPLC-Q-Exactive Orbitrap Mass技術(shù)建立了不同類型乳制品 （包括山羊奶、大豆奶和牛奶）全面脂質(zhì)組分析的方法。研究表明：共5種神經(jīng)酰胺（Cer），9種鞘磷脂（SM），4種溶血磷脂酰膽堿（LPC），21種磷脂酰膽堿（PC），14種磷脂酰乙醇胺（PE），17種甘油二酯（DG），300種甘油三酯（TG），7種磷脂酸（PA），9種磷脂酰甘油（PG），20種磷脂酰肌醇（PI），14種磷脂酰絲氨酸（PS），4種溶血磷脂酰乙醇胺（LPE）和38種脂肪酸（FA）被檢出，并且其種類和含量在不同類型乳制品中的分布差異顯著。其中，大豆奶中富含磷脂（包括PC、PE、PS、PG），而山羊奶中富含中鏈甘油三酯（MCT）、不飽和脂肪酸（USFA）、ω-6 FA和ω-3 FA（尤其是EPA和DHA）。此外，本研究基于脂質(zhì)組分差異建立了PLS鑒別模型，并篩查出14類脂質(zhì)標(biāo)記物用來鑒別乳制品的類型，從而為乳制品真實性鑒別奠定基礎(chǔ)。

山羊奶；大豆奶；牛奶；UPLC-Q-Exactive Orbitrap Mass；脂質(zhì)組

乳制品是不同種類脂質(zhì)的豐富來源（Trenerry等，2013；Haug等，2007；German等，2006）。脂質(zhì)具有諸多生物活性，通常被分為8大類 （Fahy等，2005）。甘油三酯（TG）是乳脂肪的主要成分，含量占乳脂肪的98.3%，在乳制品質(zhì)地和風(fēng)味中起重要作用（MacGibbon和Taylor，2006）。然而，攝入過多的TG會導(dǎo)致肥胖，高血壓等（Unger等，2001；Han等，2000）。乳制品中還含有豐富的脂肪酸。脂肪酸與人類健康直接相關(guān)，例如，高濃度的飽和脂肪酸（SFA）可誘導(dǎo)心血管疾病，而多不飽和脂肪酸（PUFA）可以減少心血管疾病的發(fā)生，并增強(qiáng)機(jī)體免疫力（Abedi等，2014；Mori，2006）。此外，乳制品中還含有一定量的功能活性脂，如磷脂。磷脂是生物膜的重要組成部分，并具有諸多功能活性，如抗炎活性，且磷脂與降低心血管疾病風(fēng)險和機(jī)體對膽固醇的吸收有關(guān)（Küllenberg等，2012）。研究報道，不同種類的乳制品中脂質(zhì)的種類與含量分布不同，從而導(dǎo)致不同種類的乳制品營養(yǎng)價值各異（Liu等，2015；Donato等，2011）。因此，乳制品的脂質(zhì)成分分析對于評估乳制品的營養(yǎng)價值具有重要意義。此外，經(jīng)脂質(zhì)成分分析得到的乳制品的脂質(zhì)種類與含量數(shù)據(jù)還可用于乳制品的真實性鑒別，從而為乳制品的質(zhì)量安全提供保障。

為了實現(xiàn)乳制品的脂質(zhì)成分分析，近年來，已開發(fā)了諸多方法，例如，氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法（GC-MS）（Fontecha等，2005；Fontecha等，2000），和液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法 （LC-MS）（Gastaldi等，2011；Donato等，2011；Haddad等，2011；Kalo等，2004；Mottram和 Evershed，2001；Laakso和 Manninen，1997）。Trenerry等 （2013）還開發(fā)了一種UHPLC-ion trap-MS法來鑒別牛奶中的極性脂。Byrdwell等（2007）則開發(fā)了一種LC-APCI/ESIMS技術(shù)同時檢測牛奶中的鞘脂類成分。然而，仍缺少一種實現(xiàn)乳制品脂質(zhì)組全面分析的方法。QExactive Orbitrap MS是近年來新開發(fā)出的一種具有高分辨率、靈敏度、準(zhǔn)確度的技術(shù)，與普通質(zhì)譜相比，它呈現(xiàn)出了一種碎片離子掃描分析鑒別各種脂質(zhì)同分異構(gòu)體的超強(qiáng)能力 （Senyuva等，2015）。目前，該技術(shù)已成功應(yīng)用于牛奶和人奶的極性脂質(zhì)組分差異識別鑒定上（Liu等，2015）。

本研究旨在建立一種基于UPLC-Q-Exactive Orbitrap Mass技術(shù)的山羊奶、大豆奶、牛奶的脂質(zhì)成分分析方法。為獲得山羊奶、大豆奶、牛奶中更全面的脂質(zhì)分布信息，篩查山羊奶、大豆奶、牛奶的差別表征因子提供技術(shù)支持，并為進(jìn)一步的乳制品摻假識別奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試劑 標(biāo)準(zhǔn)品包括LPC，PC，PE，PS，PG從美國Avanti公司購買，Cer，DG，TG，F(xiàn)A和醋酸銨從美國Sigma公司購買。氯仿從北京普昔宜康公司購買，HPLC級乙腈（ACN）、異丙醇（IPA）、甲醇從美國Fisher公司購買，超純水來自于Milli-Q超純水系統(tǒng)。

1.2 樣品前處理 超高溫滅菌（UHT）山羊奶，大豆奶，牛奶各10個品牌，分不同批次，歷時5個月，奶樣采購于中國10個地區(qū)的超市，以確保樣品具有代表性。

奶樣提脂是依據(jù)Folch和Bligh的方法（Bligh和Dyer，1959；Folch等，1957）：取0.2 mL奶樣，加入1 mL超純水和3 mL氯仿甲醇提取液 （CHCl3∶MeOH=2∶1，v/v），室溫混勻10 min后于2000 r/min下離心15 min。取下層氯仿層后氮吹干燥，并重溶于400 μL CHCl3∶MeOH（2∶1，v/v），待測。樣品重復(fù)試驗3次。

1.3 儀器參數(shù) 采用Thermo Fisher公司的UPLC-Q-Exactive Orbitrap Mass儀器進(jìn)行檢測，該儀器配備HESI探頭。分別選用Waters公司的CORTECS C18 100×2.1 mm 2.7 μm色譜柱和XSelect CSH C18 100×2.1 mm 2.5 μm色譜柱進(jìn)行正、負(fù)離子模式檢測。流動相A相為ACN∶H2O（60∶40，v/v，含10 mM醋酸銨），B相為IPA：CAN（90∶10，v/v，含10 mM醋酸銨）。流速設(shè)置為250 μL/min。洗脫梯度為：0～20 min流動相B由37%升至98%，之后為98%的流動相B洗脫6 min，再利用37%的流動相B平衡4 min。柱溫箱和樣品盤溫度分別設(shè)置為45、10℃。

正負(fù)離子模式下的質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集范圍分別為240～2000 m/z和200～2000 m/z。全掃描和碎片掃描分辨率分別為70000和17500。噴霧電壓為3000 v，碰撞溫度為320℃，加熱器溫度為300℃，鞘氣流速為35 Arb，輔助氣流速為10 Arb。數(shù)據(jù)分析采用軟件Lipidsearch 4.0（Thermo Fisher，CA）。定性是基于碎片離子信息（MS2）來實現(xiàn)的。該方法中，MS1的誤差＜5 mg/L，MS2的誤差＜8 mg/L。并且分析過程中將m得分＜10和峰面積＜1e5的值剔除。正離子模式下將奶樣的脂質(zhì)提取物稀釋20倍后進(jìn)樣1 μL；由于負(fù)離子模式靈敏度不如正離子模式高，因此是將奶樣的脂質(zhì)提取物稀釋2倍后進(jìn)樣1 μL。

1.4 統(tǒng)計分析 峰面積計算采用軟件Xcalibur 3.2.63（Thermo Fisher，USA）。最小二乘法判別分析（PLS-DA）采用軟件SIMCA-P 11.5，方差分析（ANOVA）采用軟件SPSS 21.0。置信區(qū)間為95%（Brown等，2005）。

2 結(jié)果與討論

2.1 方法驗證和脂質(zhì)分析 如圖1所示，為山羊奶、大豆奶、牛奶基于UPLC-Q-Exactive Orbitrap Mass技術(shù)分別在正離子模式和負(fù)離子模式下掃描得到的圖譜，表1顯示了山羊奶、大豆奶、牛奶的脂質(zhì)定性信息。其中，共有5種神經(jīng)酰胺（Cer），9種鞘磷脂 （SM），4種溶血磷脂酰膽堿（LPC），21種磷脂酰膽堿（PC），14種磷脂酰乙醇胺（PE），以及17種甘油二酯（DG）和300種甘油三酯（TG）由正離子模式掃描得到；共7種磷脂酸（PA），9種磷脂酰甘油（PG），20種磷脂酰肌醇（PI），14種磷脂酰絲氨酸 （PS），4種溶血磷脂酰乙醇胺 （LPE）和38種脂肪酸（FA）由負(fù)離子模式掃描得到。

圖1 利用UPLC-Q-Exactive orbitrap MS技術(shù)分別在正離子模式（a）和負(fù)離子模式（b）下的采集信息圖

經(jīng)外標(biāo)法定量，可獲得不同種類脂質(zhì)的線性定量方程（如表2所示）。依據(jù)Donato（2011）等人的研究結(jié)果，將3倍信噪比定為檢出限，10倍信噪比定為定量限，其中檢出限均≤0.004 μg/mL，定量限均≤0.02 μg/mL。此外，將奶樣加標(biāo)提取后定量獲得的脂質(zhì)含量與標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行比較，可確定其回收率。將空白奶樣提取后進(jìn)行加標(biāo)處理定量獲得的脂質(zhì)含量與標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行比較，可評價其基質(zhì)效應(yīng)。如表3所示，9類脂質(zhì)的回收率為80.54%～110.07%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差小于10%，并且無顯著的基質(zhì)干擾，由此可見，該方法具有較高的重復(fù)性和準(zhǔn)確性。

2.2 不同乳制品間脂質(zhì)組差異分析 經(jīng)定量分析發(fā)現(xiàn)，不同種類的乳制品中脂質(zhì)的種類與含量分布具有顯著性差異。其具有顯著性差異的脂質(zhì)如下所述：在正離子模式下，檢測到大豆奶中含有PC（16∶0/22∶6，含量為0.03～0.12 μg/mL），PE（16∶1/20∶4，含量為0.05～0.17 μg/mL），DG（18∶3/18∶3，含量為0.08～0.2 μg/mL）；牛奶中含有Cer（16∶0/22∶0，含量為0.2～1.0 ng/mL），Cer（16∶1/22∶0，含量為2.5～3.5 ng/mL）和Cer（18∶0/22∶0，含量為23.4～27.6 ng/mL）。在負(fù)離子模式下，檢測到大豆奶中含有7種PA（16∶0/18∶2，16∶0/18∶3，18∶0/18∶2，18∶0/ 18∶2，18∶2/18∶2，18∶3/18∶2，18∶3/18∶3），9種PG（16∶0/ 16∶0，18∶0/16∶0，16∶0/18∶1，16∶0/18∶2，16∶0/18∶3，18∶0/ 18∶2，18∶1/18∶2，18∶2/18∶2，18∶3/18∶2，總含量為22.66～25.41 μg/mL），以及4種PI（15∶0/18∶2，18∶3/ 18∶2，22∶0/18∶2，16∶0/18∶3）；在牛奶中檢測到PA（18∶ 2/18∶2），2種PG（16∶0/18∶1，18∶0/18∶2，總含量為0.026～0.035 μg/mL）和2種PI（18∶0/23∶0，18∶1/20∶4）；在山羊奶中檢測到4種PG（16∶0/18∶1，16∶0/18∶2，18∶0/18∶2，18∶1/18∶2，總含量為0.54～0.66 μg/mL）和3種PI（16∶0/18∶3，18∶0/23∶0，18∶1/20∶4）。

表1 脂質(zhì)定性信息表

（續(xù)表1）

經(jīng)方差分析（ANOVA）得出（如圖2所示），大豆奶富含磷脂，其中PE，PG，PS，PC的含量高于山羊奶和牛奶（P＜0.05）。與大豆奶和山羊奶相比，牛奶中含有較高的Cer和DG（P＜0.01）。此外，TG和中鏈甘油三酯 （MCT）的含量在牛奶中最高 （P＜0.001）。然而，MCT和TG的比值較山羊奶低，其中牛奶中MCT/TG為39%，山羊奶中MCT/TG為46%。據(jù)MosheRubin等（2000）和℃tavio等（2000）的研究表明，MCT更容易被人體吸收。因此，對于肥胖人群而言，攝入山羊奶要比牛奶更適合。

表2 9類脂質(zhì)的定量方程及線性范圍、檢出限、定量限

表3 9類脂質(zhì)的基質(zhì)效應(yīng)和添加回收率

2.3 山羊奶、大豆奶和牛奶的脂肪酸定量分析如圖2所示，山羊奶、大豆奶、牛奶中單不飽和脂肪酸（MUFA），多不飽和脂肪酸（PUFA）和飽和脂肪酸（SFA）的含量差異顯著（P＜0.01）。其中，山羊奶中不飽和脂肪酸（USFA，i.e.MUFA+PUFA）的含量較大豆奶、牛奶較高（P＜0.001）。山羊奶、大豆奶、牛奶中SFA，MUFA和PUFA的含量之比分別為1∶0.7∶0.2，1∶0.8∶0.4和1∶0.6∶0.1。ω-6和ω-3型脂肪酸在不同種類乳制品中的含量差異顯著（P＜0.001），例如，LA含量在大豆奶中最高，山羊奶次之，牛奶最低；ARA的含量在山羊奶中最高，牛奶次之，大豆奶最低；ALA的含量在大豆奶中最高，山羊奶次之，牛奶最低；EPA和DHA的含量均在山羊奶中最高，牛奶次之，大豆奶最低。其中，山羊奶中EPA和DHA的含量分別為1.87～1.99 μg/mL和1.17～1.27 μg/mL。研究報道，EPA和DHA可以降低總膽固醇、低密度脂蛋白和甘油三酯的水平，并增加免疫系統(tǒng)的活性 （Van Valenberg等，2013；Swanson等，2012；Abeywardena，2011；Moghadasian等，2008；Ruxton等，2007；Calder，2006）。

圖2 脂質(zhì)含量在山羊奶、大豆奶、牛奶中的差異比較

2.4 PLS鑒別模型的建立 基于不同種類的乳制品中具有顯著性差異的脂質(zhì)數(shù)據(jù)，進(jìn)行偏最小二乘法判別分析（PLS-DA），可獲得不同種類乳制品的偏最小二乘法判別模型（如圖3a所示）。其中，前兩個主成分的方差累積貢獻(xiàn)率達(dá)86.9%，該模型可有效地進(jìn)行不同種類乳制品的真實性鑒別。此外，方差貢獻(xiàn)值（VIP）的大小可用于評估具有顯著性差異的脂質(zhì)對所建立的PLS-DA模型的貢獻(xiàn)率大小，從而篩選出可用于不同種類乳制品真實性鑒別的表征因子。如圖3b所示，總共14個變量（VIP＞1）被認(rèn)為具有顯著貢獻(xiàn)，且這些脂質(zhì)可用作山羊奶，大豆奶和牛奶真實性鑒別的表征因子。

圖3 偏最小二乘法判別分析（PLS-DA）得分圖（a）與方差貢獻(xiàn)因子柱形圖（b）

3 小結(jié)

本研究建立了一種基于UPLC-Q-Exactive Orbitrap MS技術(shù)進(jìn)行山羊奶、大豆奶、牛奶的脂質(zhì)成分分析的方法。試驗中比較了山羊奶、大豆奶、牛奶的脂質(zhì)種類與含量分布的顯著性差異，并利用具有顯著性差異的脂質(zhì)進(jìn)行PLS-DA模型建立，以進(jìn)行山羊奶、大豆奶、牛奶的真實性鑒別，并篩選出方差貢獻(xiàn)值較高的14類脂質(zhì)作為真實性鑒別的表征因子，為日后乳制品的質(zhì)量安全提供技術(shù)支撐。

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（譯自：Food Chemistry，2017，224：302～309.）

Lipids are very important for human health and milk is a rich dietary source of lipids.In this study，the lipid content in three types of milk（goat，soy and bovine）were determined by using UPLC-Q-Exactive Orbitrap Mass Spectrometry.A total of 13 classes of lipids（including Cer，SM，LPC，PC，PE，DG，TG，PA，PG，PI，PS，LPE，F(xiàn)A）were measured.Moreover，lipid profiles differed significantly between the different milk types.Soymilk is rich in phospholipids including PC，PE，PS，PG，while goat milk is rich in medium chain triglycerides（MCT），USFA，ω-6 FA and ω-3 FA，especially EPA and DHA.Furthermore，a PLS model was established for differentiation of milk types based on the lipid profiles. A total of 14 lipids were identified as biomarkers for differentiation of milk types，thus providing a basis for milk authentication and detection of adulteration.

goat milk；soymilk；bovine milk；UPLC-Q-Exactive Orbitrap Mass；lipidomics

S816.17

A

1004-3314（2017）10-0033-06

10.15906/j.cnki.cn11-2975/s.20171008

國家自然科學(xué)基金（31371779）；國家國際科技合作專項（2015DFG31890）