于懷龍，黃小燕，羅瑩瑩，李 紅，伍國耀

（上海亙泰實業(yè)集團有限公司，上海 201015）

中國·豬營養(yǎng)國際論壇

基于主成分分析法對不同血漿蛋白粉IgG及氨基酸的檢測分析

于懷龍，黃小燕*，羅瑩瑩，李 紅，伍國耀

（上海亙泰實業(yè)集團有限公司，上海 201015）

中國豬營養(yǎng)國際論壇是由美國動物科學學會、上海亙泰實業(yè)集團和上海優(yōu)久生物科技有限公司聯(lián)合主辦，以“凝聚全球科研力量，驅(qū)動豬業(yè)創(chuàng)新思維”為宗旨，力邀全球一流的機構(gòu)、專家和學者，傾力打造一個動物營養(yǎng)領(lǐng)域具有國際性、前沿性和權(quán)威性的論壇。該論壇每兩年舉辦一屆，聚焦行業(yè)發(fā)展中的熱點、難點，通過專家學者和企業(yè)領(lǐng)導者之間進行開放建設性的學術(shù)探討、理論研究和實踐經(jīng)驗交流，整合全球動物營養(yǎng)領(lǐng)域最新的技術(shù)和研究成果，推動行業(yè)發(fā)展，創(chuàng)造和提升產(chǎn)業(yè)價值。 www.asaschina.org

本研究采用高效液相色譜法（HPLC）測定了10種市售血漿蛋白粉的IgG及氨基酸含量，并通過主成分分析法對血漿蛋白粉中粗蛋白質(zhì)、IgG及氨基酸進行分析，為血漿蛋白粉的評價與篩選提供了一種新方法。經(jīng)主成分分析，建立了血漿蛋白粉的綜合評價模型F=0.45F1+0.36F2+0.11F3+0.08F4，得到了血漿蛋白粉的綜合得分，由高到低依次為SUX9、SUX8、SUX7、SUX6、SUX4、SUX5、SUX3、SUX2、SUX10、SUX1。對前三個主成分進行可視化處理，10種血漿蛋白粉被分為5類，結(jié)合模型得分篩選出SUX8、SUX9為優(yōu)質(zhì)血漿蛋白粉。

血漿蛋白粉；氨基酸；免疫球蛋白G；高效液相色譜法；主成分分析

血漿蛋白粉是以健康動物新鮮血液為原料，經(jīng)離心、超微過濾及噴霧干燥等工藝加工而成的高品質(zhì)飼料蛋白原料，具有營養(yǎng)全面、消化率高、適口性好等優(yōu)點（胡奇?zhèn)ィ?005）。目前，市場上的血漿蛋白粉品類眾多，質(zhì)量各異，因此對血漿蛋白粉進行分類及評價，并篩選出優(yōu)質(zhì)血漿蛋白粉，對于養(yǎng)殖業(yè)具有重要意義。

主成分分析法（PCA）是一種通過降維把多個指標轉(zhuǎn)化為少數(shù)幾個綜合指標的多元分析方法，其目的是簡化數(shù)據(jù)和揭示變量間的關(guān)系，已廣泛用于產(chǎn)品類型的判別及篩選等方面。Tchabo等（2015）采用PCA分析了不同酶處理對桑椹汁理化指標及香氣成分的影響。Zou和Zhao（2008）基于PCA采用氣質(zhì)聯(lián)用及電子鼻技術(shù)建立了蘋果品種識別方法。

本研究采用高效液相色譜技術(shù)（HPLC）對市售不同血漿蛋白粉的免疫球蛋白G（IgG）及氨基酸進行分析測定，通過對粗蛋白質(zhì)、IgG及氨基酸的主成分分析區(qū)分不同的血漿蛋白粉，并建立血漿蛋白粉綜合品質(zhì)評價模型，旨在為不同血漿蛋白粉的區(qū)分與識別提供一種新思路，為血漿蛋白粉的篩選提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器 血漿蛋白粉：10種市售豬血漿蛋白粉，均由上海優(yōu)久生物科技有限公司提供，編號分別為SUXn（n=1～10）；IgG標準品（色譜純）、氨基酸混標 （色譜純），Sigma-aldrich公司；乙腈（色譜純），Tedia公司；甲醇（色譜純），江蘇永華精細化學品有限公司；異硫氰酸苯酯（色譜純），Alddin公司；磷酸二氫鉀、三乙胺、甘氨酸、氫氧化鈉，均為分析純，上海凌峰化學試劑有限公司。

高效液相色譜儀LC-20AD配SPD-20A紫外檢測器，日本島津公司；凱氏定氮儀KjeltecTM 8100，德國Foss公司；0.45 μm水相過濾膜、有機相過濾膜、親水PTFE針式濾器、有機相針式濾器（尼龍），上海安譜實驗科技股份有限公司；一次性無菌注射器，常州金龍醫(yī)用塑料器械有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 粗蛋白質(zhì)的測定方法 參照 GB/T 6432-1994《飼料中粗蛋白測定方法》。

1.2.2 IgG的測定方法 色譜柱：Hi-Trap Protein G HP色譜柱（1 mL，GE Healthcare），測定方法參照GB/T 21033-2007《飼料中免疫球蛋白IgG的測定高效液相色譜法》；

1.2.3 氨基酸測定方法 樣品前處理：稱取0.1000 g樣品于16 mL消解管中，分別加入6 mL 6 M HCl（含0.2%苯酚），充氮氣60 s后蓋上蓋子，置于110℃烘箱中水解24 h，消化液冷卻后轉(zhuǎn)移至250 mL容量瓶中，并加入 8 mL 25% NaOH溶液，加水定容即得樣品溶液。

衍生方法：移取400 μL樣品溶液于2 mL離心管中，分別加入200 μL三乙胺乙腈溶液、異硫氰酸苯酯乙腈溶液，渦旋震蕩混勻后室溫放置1 h，加入800 μL正己烷，震蕩混勻后放置10 min，有機相針式過濾器過濾即可。

色譜條件：Sepax AA專用柱 （4.6×250 mm）；紫外檢測波長254 nm；柱溫40℃；流動相A，醋酸鈉∶乙腈=97∶3（V/V）；流動相B，乙腈∶水=4∶1；進樣量10 μL；流速1 mL/min；梯度洗脫：0～2 min，B為0；2～14 min，B為0%～7%；14～29 min，B為7%～30%；29～32 min，B為30%～50%；32.1～39 min，B為100%；39.1～45 min，B為0。

定量方法：采用外標法定量。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析 采用SPSS 17.0進行主成分分析，Origin 9.0進行圖像處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同血漿蛋白粉中粗蛋白質(zhì)的差異分析 血漿蛋白粉中蛋白質(zhì)含量豐富，主要是由纖維蛋白、球蛋白和白蛋白等構(gòu)成，粗蛋白質(zhì)含量一般在70%以上（黃百花等，2012）。粗蛋白質(zhì)含量是血漿蛋白粉品質(zhì)的重要指標，不同血漿蛋白粉中粗蛋白質(zhì)的含量如表1所示，SUX1與SUX10之間，SUX2與SUX3之間，SUX4與SUX7之間，SUX4、SUX5與SUX8之間，SUX5、SUX6、SUX8與SUX9之間粗蛋白質(zhì)含量差異不顯著（P＞0.05），而其他血漿蛋白粉之間粗蛋白質(zhì)含量差異顯著，其中 SUX5、SUX6、SUX8與SUX9含量最高（P＜0.05），不同血漿蛋白粉粗蛋白質(zhì)含量范圍為73.31%～79.43%。

表1 不同血漿蛋白粉中粗蛋白質(zhì)及IgG含量 %

2.2 不同血漿蛋白粉中IgG的差異分析 IgG是免疫球蛋白中的一種，能特異性地識別抗原，并與之結(jié)合形成復合物，復合物被吞噬細胞吞噬后使抗原失去毒性和致病性，因此IgG是表征血漿蛋白粉的主要成分之一 （廉婷婷，2013；Bruhns，2012）。不同血漿蛋白粉中IgG的含量如表1所示，SUX1、SUX3與SUX6之間，SUX，4、SUX5與SUX10之間IgG含量差異不顯著（P＞0.05），而其他血漿蛋白粉之間IgG含量差異顯著（P＜0.05），其中SUX8含量最高，不同血漿蛋白粉IgG含量為17.38%～30.78%。

2.3 不同血漿蛋白粉中氨基酸的檢測分析 氨基酸對動物的生長、神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育及動物體內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)的正常代謝都有重要的作用，氨基酸的種類和含量是評價飼料質(zhì)量的根本依據(jù) （岳田利等，2007）。不同血漿蛋白粉中氨基酸的檢測結(jié)果如表2所示，10種血漿蛋白粉中共檢測出17種氨基酸，不同血漿蛋白粉中同一種氨基酸含量存在著顯著差異。SUX1、SUX2、SUX3、SUX4、SUX5與SUX9之間，SUX1、SUX2、SUX8與SUX9之間，SUX1、SUX3、SUX4、SUX5、SUX6與SUX7之間賴氨酸含量差異不顯著（P＞0.05），而其他血漿蛋白粉之間賴氨酸含量差異顯著（P＜0.05），不同血漿蛋白粉賴氨酸含量為5.30%～6.81%。

表2 不同血漿蛋白粉中氨基酸含量 %

不同血漿蛋白粉間總氨酸含量也存在較大差異，其中SUX1、SUX2與SUX3之間，SUX1、SUX2與SUX10之間，SUX2、SUX3、SUX4、SUX5與SUX6之間，SUX4、SUX5、SUX6、SUX7、SUX8與SUX9之間總氨酸含量差異不顯著（P＞0.05），而其他血漿蛋白粉之間總氨酸含量差異顯著（P＜0.05），不同血漿蛋白粉總氨酸含量為71.97%～78.77%。

2.4 不同血漿蛋白粉中粗蛋白質(zhì)、IgG及氨基酸的主成分分析 本研究以不同血漿蛋白粉中粗蛋白質(zhì)、IgG及氨基酸為研究對象，對其中20種成分進行主成分分析，得到主成分的特征值及貢獻率如表3所示，載荷矩陣與特征向量如表4所示。由表3可知，前4個主成分的的累計貢獻率為95.55%，因此可選用前4個主成分來評價不同血漿蛋白粉的綜合品質(zhì)（Holt等，2013）。

表3 主成分的特征值及貢獻率

選用F1、F2、F3、F44個指標來代替原來的20個指標對不同血漿蛋白粉綜合品質(zhì)進行分析，由表4中的特征向量得到前4個主成分得分的線性關(guān)系式分別為：

以每個主成分方差貢獻率占前4個主成分總貢獻率的百分數(shù)βi（i=1，2，3，4，5）作為加權(quán)系數(shù)，利用綜合評價函數(shù)F=建立血漿蛋白粉綜合品質(zhì)評價模型（鄧娜娜等，2014；岳田利等，2007），F(xiàn)= 0.45F1+0.36F2+0.11F3+0.08F4，其中F1、F2、F3、F4分別為前4個主成分的得分值。利用該評價模型計算不同血漿蛋白粉綜合品質(zhì)得分如表5所示。

由表5可知，不同血漿蛋白粉綜合得分由高到低依次為 SUX9、SUX8、SUX7、SUX6、SUX4、SUX5、SUX3、SUX2、SUX10、SUX1。

以不同血漿蛋白粉前3個主成分得分作圖，結(jié)果如圖1所示，10種血漿蛋白粉根據(jù)距離遠近分為 5類：SUX1、SUX2、SUX3為一類；SUX4、SUX5為一類；SUX6、SUX7為一類；SUX8、SUX9為一類；SUX10單獨為一類。結(jié)合表 5可知，SUX8、SUX9總得分最高，分別為2.31、2.32，因此可以篩選SUX8、SUX9為優(yōu)質(zhì)的血漿蛋白粉。

表4 主成分的特征向量與載荷矩陣

表5 不同血漿蛋白粉品質(zhì)評價

圖1 主成分分析對不同血漿蛋白粉成分得分散點圖

3 結(jié)論

本研究測定了10種血漿蛋白粉中粗蛋白質(zhì)、IgG及氨基酸的含量，并分析了各成分含量的差異。通過主成分分析，建立了血漿蛋白粉的綜合評價模型F=0.45F1+0.36F2+0.11F3+0.08F4，得到各血漿蛋白粉的綜合品質(zhì)得分，由高到低依次為SUX9、SUX8、SUX7、SUX6、SUX4、SUX5、SUX3、SUX2、SUX10、SUX1。以前3個主成分得分散點圖可以看出，10種血漿蛋白粉被分為5類，依次為SUX1、SUX2、SUX3；SUX4、SUX5；SUX6、SUX7；SUX8、SUX9；SUX10。根據(jù)評價模型得分篩選出SUX8、SUX9為優(yōu)質(zhì)血漿蛋白粉。本研究為血漿蛋白粉的評價與篩選提供了一種新方法。

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The method of high performance liquid chromatography（HPLC）was used to analyze immunoglobulin G（IgG）and amino acids in 10 commercially available spray dried porcine plasma（SDPP）products.Then principal component analysis（PCA）was adopted to investigate the content of crude protein，IgG and amino acid in SDPP.The study provides a new method for evaluation and selection of SDPP.An SDPP model（F=0.45F1+0.36F2+0.11F3+0.08F4）was established through PCA.The evaluation model showed that the ranking of integrative quality scores of SDPP products were SUX9（1st），SUX8（2nd），SUX7（3rd），SUX6（4th），SUX4（5th），SUX5（6th），SUX3（7th），SUX2（8th），SUX10（9th），and SUX1（10th）.The first three principal components were subjected to graphical analysis and 5 clusters were obtained.Combined with model evaluation，SUX8 and SUX9 were selected as high quality SDPP products.

spray dried porcine plasma；amino acid；immunoglobulin G；High performance liquid chromatography；principal component analysis

S816.17

A

1004-3314（2017）10-0039-04

10.15906/j.cnki.cn11-2975/s.20171009

*通訊作者