王姍姍 梁沛君 應(yīng)旭旻

槌果藤對體外誘導(dǎo)Th17細(xì)胞增殖及RORγt轉(zhuǎn)錄水平的影響

王姍姍1梁沛君2應(yīng)旭旻3

目的觀察槌果藤對體外誘導(dǎo)的TH17細(xì)胞增殖和分化的影響。方法將不同濃度的槌果藤乙醇提取物與Th17細(xì)胞共同培養(yǎng)，應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)（FCW）檢測空白對照組及槌果藤低、中、高劑量組（1、10、20μg/mL）TH17細(xì)胞分化水平；進(jìn)而以10μg/mL濃度為基礎(chǔ)藥物濃度，采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）檢測槌果藤對維甲酸相關(guān)孤兒受體γ（RORγt）轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)的影響。結(jié)果FCW檢測結(jié)果顯示，培養(yǎng)3天后，與空白對照組比較，槌果藤中、高劑量組Th17細(xì)胞分化比例明顯降低[（4.83±0.13）%、（4.99±0.38）%比（8.24±0.34）%，P<0.05]；低劑量組與對照組、中劑量與高劑量組Th17細(xì)胞分化比例比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。PCR檢測結(jié)果顯示，單純槌果藤組（10μg/mL）與對照組相比，RORγt轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平明顯降低[（0.66±0.25）比1，P<0.05]；單純槌果藤組與ERK抑制劑組相比，RORγt轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平明顯降低[（0.66±0.25）比（1.46±0.47），P<0.05）]。P38抑制劑組、JNK抑制劑組與單純槌果藤組相比，RORγt轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平無顯著差異（P>0.05）。結(jié)論槌果藤可抑制體外誘導(dǎo)Th17細(xì)胞的增殖、分化，其作用機(jī)制可能是通過ERK信號通路從而抑制RORγt轉(zhuǎn)錄。

槌果藤；Th17；RORγt；增殖；分化

T輔助細(xì)胞17（T helper 17 cell，Th17）是新近發(fā)現(xiàn)的一種由轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β）和白介素-6（IL-6）聯(lián)合誘導(dǎo)產(chǎn)生的能分泌IL-17A、IL-17F、IL-22等細(xì)胞因子的CD4+T細(xì)胞，它與調(diào)節(jié)性T細(xì)胞共同參與自身免疫疾病的過程，研究發(fā)現(xiàn)，自身免疫疾病的Th17細(xì)胞明顯升高，而其數(shù)量的升高與自身免疫病呈密切相關(guān)[1-2]，系統(tǒng)性紅斑狼瘡（systemic lupuserythematosus，SLE）患者外周血Th17細(xì)胞數(shù)量的升高與疾病活動度明顯相關(guān)[3]。既往研究[4]表明，槌果藤對局灶節(jié)段腎小球硬化（FSGS）小鼠模型可減少尿蛋白，起到免疫調(diào)節(jié)、抗氧化、抗纖維化作用，但其作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。本實(shí)驗(yàn)旨在研究槌果藤提取物對Th17細(xì)胞的增殖、分化的影響，并對其可能存在的作用機(jī)制進(jìn)行初步探討，為槌果藤治療自身免疫疾病提供更多的理論依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動物正常C57BL/6小鼠6只，鼠齡6～8周，購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動物中心，浙江中醫(yī)藥大學(xué)動物中心SPF級別飼養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)動物生產(chǎn)許可證：SCXK（滬）2012-0005。

1.2 藥品槌果藤來自浙江中醫(yī)藥大學(xué)門診部中藥房，稱取槌果藤干果切成小片，加95%乙醇于70℃水浴中加熱回流1h，重復(fù)2次，將2次煎煮液合并；于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上進(jìn)行真空濃縮至固態(tài)，用二甲基亞礬（DMSO）溶解成1mg/mL，過濾器過濾滅菌，-20℃保存?zhèn)溆?。使用時(shí)稀釋成藥物濃度為低（1μg/mL）、中（10μg/mL）、高（20μg/mL）劑量組，0μg/mL為空白對照組。

1.3 試劑和儀器轉(zhuǎn)化生長因子β（TGF-β）（美國R&D公司，NUQ1814072）；IL-6（美國R&D公司，NUQ1836152）；CD4+Tcell檢測盒（德國Miltenyi Biotec公司，批號：5140602356）；PMA（中國聯(lián)科，批號：5155205），BFA（中國聯(lián)科，批號：5155305）；IL-17檢測試劑盒（美國eBioscience公司，E00081-1635）；trizol（日本Takara公司，v201204Da-2）；PCR引物（美國invitrogen公司，2949652）。CO2培養(yǎng)箱（HF151）（上海力中科學(xué)儀器有限公司）；流式細(xì)胞儀（Beckman Coulter公司）；旋渦式混合器（太倉華利達(dá)實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；PCR儀（美國ABI7500 Real-Time）。

2 方法

2.1 流式細(xì)胞術(shù)（FCW）檢測IL-17表達(dá)無菌條件下分離小鼠脾臟，研磨后由淋巴細(xì)胞分離液獲取脾臟T細(xì)胞。向T細(xì)胞中加入CD4+Tcell Biotin-Antibody cocktail（100μL/108）、Anti-biotin MicroBeads（100μL/108）抗體孵育，洗去抗體過LS分選柱，收集流出的細(xì)胞即CD4+T細(xì)胞，加入anti-CD62L-beads（200μL/108）再經(jīng)MS分選柱分選得CD4+CD25-CD62L+細(xì)胞。在TGF-β和IL-6的聯(lián)合誘導(dǎo)Th17細(xì)胞過程中，加入不同濃度的槌果藤乙醇提取液，用流式細(xì)胞儀檢測IL-17表達(dá)。

將待檢CD4+CD25-CD62L+細(xì)胞接種12空板，分為五組，同型對照組（僅對空白對照組及藥物組數(shù)據(jù)矯正）、空白對照組，槌果藤低、中、高劑量組（藥物組），每組各一個(gè)副孔，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106/mL。除空白對照組外，四組均加入TGF-β（1ng/mL）和IL-6 (20ng/mL),藥物組加入相應(yīng)濃度槌果藤乙醇提取液，于5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3天。（1）各組分別取250μL細(xì)胞懸液于流式管中，然后加入1μL PMA（250X），1μL BFA（250X），混勻，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)刺激5h，每2h混勻1次，刺激Th17細(xì)胞的分泌。（2）分別加入表面抗體FITC anti-mouse CD4 0.25μL（0.125μg/test）4℃避光孵育15min。（3）用預(yù)冷流式染色緩沖液洗滌細(xì)胞，離心棄上清。（4）重懸細(xì)胞，加入1mL Fixation/Permeabilization固定破膜液，4℃避光孵育30min。（5）洗滌細(xì)胞，離心棄上清，重復(fù)洗2遍。（6）空白對照組及藥物組加入Anti-Mouse/Rat IL-17A PE 0.2mg/mL和同型對照管加入同等劑量同型對照，37℃溫箱孵育1h。（7）2mL Per Buffer洗滌，1500rpm離心，5min，棄上清，重復(fù)2次，加入500μL PBS上機(jī)檢測IL-17在CD4+Tcell中所占的百分比。

2.2 PCR檢測RORγt表達(dá)將待檢Th17細(xì)胞分為五組，每組均給予TGF-β+IL-6聯(lián)合誘導(dǎo)，其中一組為空白對照組。其余四組分別加入10μg/mL的槌果藤，其中三組分別加入P38抑制劑、JNK抑制劑、ERK抑制劑。每組均加入TGF-β+IL-6聯(lián)合培養(yǎng)3天，用PCR方法檢測RORγt表達(dá)。

將待檢TH17細(xì)胞接種于6孔板，調(diào)整細(xì)胞濃度為2.5×105/L，抑制劑組先分別加入P38抑制劑（2μM/μL）、JNK抑制劑（50μM/μL）、ERK抑制劑（50μM/2.67μL）于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)30min后，五組均加入TGF-β和IL-6，除空白對照組外其余四組再分別加入10μg/mL槌果藤乙醇提取物，聯(lián)合培養(yǎng)3天，3天后每組均加入PMA、BFA，刺激5h后，離心棄培養(yǎng)基，加入1mL trizol，提取RNA。逆轉(zhuǎn)錄：cDNA，上機(jī)（37℃180min，85℃5sec，4℃）測RORγt DNA濃度，選用濃度在1.8-2.0之間的DNA濃度。進(jìn)行擴(kuò)增Real-time PCR：引物RORγt-F 5＇-3＇:CAGA ACAGGGTCCAGACAGC RORγt-R 5＇-3＇:CCGTGAA AAGAGGTTGGTGCGA-PDH-F 5＇-3＇:TGACGTGCCG CCTGGAGAAA GAPDH-R 5＇-3＇:AGTGTAGCCCAA GATGCCCTTCAG（50℃，2min;95℃，10s；60℃，30s；72℃，30s，40循環(huán)），每個(gè)樣本重復(fù)3次，7500 Real-Time PCR上機(jī)檢測RORγt表達(dá)，擴(kuò)增比例用Ct值（每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號到達(dá)設(shè)定的閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)）顯示，結(jié)果以GAPDH進(jìn)行矯正，并以2-ΔΔCt值，即每組基因表達(dá)量相對于對照組的倍數(shù)，表示每組RORγt相對表達(dá)量。

2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS軟件15.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)采用（） ，兩兩比較采用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 FCW檢測Th17細(xì)胞分化槌果藤中、高劑量組與空白對照組比較，Th17細(xì)胞分化比例明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；槌果藤低劑量組與對照組間、中劑量與高劑量組間Th17細(xì)胞分化水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見表1。

表1 不同濃度槌果藤對Th17細(xì)胞分化比例的影響（）

表1 不同濃度槌果藤對Th17細(xì)胞分化比例的影響（）

注：與空白對照組比較，*P<0.05

組別空白對照組槌果藤低劑量組槌果藤中劑量組槌果藤高劑量組孔數(shù)槌果藤濃度（μg/mL）2 2 2 2 0 1 1 0 20分化率（%）8.24±0.34 8.22±0.66 4.83±0.13* 4.99±0.38*

3.2 PCR檢測RORγt轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平與對照組比較，單純槌果藤組RORγt轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平明顯降低（P<0.05）；不同信號通路阻斷劑組中，ERK阻斷劑組RORγt轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平明顯高于單純槌果藤組和空白對照組（P<0.05），P38阻斷劑組、JNK阻斷劑組與單純槌果藤比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見表2。

表2 槌果藤對RORγt轉(zhuǎn)錄水平的影響（）

表2 槌果藤對RORγt轉(zhuǎn)錄水平的影響（）

注：與對照組比較，*P<0.05；與單純槌果藤組比較，△P<0.05

組別空白對照組單純槌果藤組P38抑制劑組JNK抑制劑組ERK抑制劑組樣本數(shù)9 9 9 9 9基因相對表達(dá)量（倍數(shù)）1 0.66±0.25* 0.57±0.26* 0.56±0.21* 1.46±0.47*△

4 討論

Th17細(xì)胞已被證實(shí)在調(diào)節(jié)免疫與自身免疫性疾病中發(fā)揮重要作用，大量研究發(fā)現(xiàn)，Th17細(xì)胞與實(shí)驗(yàn)性腦炎、哮喘、RA等自身免疫性疾病相關(guān)。本研究通過乙醇提取法提取槌果藤中藥用成分，分為低、中、高劑量組，采用FCW檢測Th17在CD4+Tcell分化所占比值。CD4+Tcell在TGF-β+IL-6聯(lián)合誘導(dǎo)3天，F(xiàn)CW檢測對照組Th17水平增加，表明聯(lián)合誘導(dǎo)Th17細(xì)胞過程成功，其中槌果藤低、中、高劑量相比，以中劑量抑制作用最為明顯。PCR檢測以抑制作用最為明顯的抑制濃度中劑量為基礎(chǔ)濃度，加入阻斷劑，以空白組為對照組，結(jié)果顯示，槌果藤可抑制RORγt轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平從而抑制Th17細(xì)胞的分化，ERK阻斷劑組RORγt轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平增高，表明槌果藤可能通過ERK通路影響Th17細(xì)胞的分化。

研究[2]表明，Th17細(xì)胞是促炎癥細(xì)胞，由TGF-β和IL-6聯(lián)合誘導(dǎo)產(chǎn)生，導(dǎo)致組織的炎癥反應(yīng)和自身免疫病發(fā)生，在分化過程中，維甲酸受體相關(guān)孤兒受體γ（RORγt）控制Th17的分化。近年來MAPK信號通路在TGF-β介導(dǎo)的Th17細(xì)胞分化中作用越來越受到重視，MAPK信號通路包括ERK1/2，JNK和P38。在Th17細(xì)胞分化中，Tan等[5]發(fā)現(xiàn)運(yùn)用藥物抑制ERK信號明顯增加Th17細(xì)胞的分化和增加IL-17、IL-21、IL-22和IL-23R的表達(dá)，Cui等[6]也報(bào)道活化ERK信號通路能抑制Th17細(xì)胞分化，同時(shí)Brereton等[7]報(bào)道ERK特異性信號通路抑制劑明顯減輕自身免疫病的癥狀，與降低IL-23和IL-1誘導(dǎo)的IL-17產(chǎn)生有關(guān)。以上說明MAPK通路在T細(xì)胞分化中占重要地位。本研究將槌果藤提取物與Th17細(xì)胞共同培養(yǎng)3天，利用PCR技術(shù)檢測RORγt受體的表達(dá)（P<0.05），發(fā)現(xiàn)單純槌果藤組可明顯抑制RORγt受體的表達(dá)，進(jìn)一步通過不同信號通路阻斷劑的干預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，ERK阻斷劑組與槌果藤提取物共同培養(yǎng)后RORγt的表達(dá)明顯增高（P<0.05），而JNK和P38阻斷劑組與棰果藤提取物共同培養(yǎng)后，對RORγt的表達(dá)無影響（P>0.05）。推測槌果藤可能通過MAPK信號通路的ERK信號通路，影響Th17細(xì)胞的分化。

槌果藤作為傳統(tǒng)中草藥，具有臨床副作用小、價(jià)格低廉、應(yīng)用廣泛的特點(diǎn)，具有祛風(fēng)、散寒、除濕、消腫、止痛之效，用于風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、肝硬化和肝炎等引起的脾胃病證和浮腫[8]。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，槌果藤可以減少局灶階段硬化腎小球鼠尿蛋白，但其作用機(jī)制尚不明確。本研究證實(shí)了中高劑量槌果藤對體外誘導(dǎo)Th17細(xì)胞增殖與分化具有明顯抑制作用，并推測其可能通過MAPK信號通路的ERK信號通路影響RORγt的表達(dá)。槌果藤其他的免疫抑制作用及機(jī)制還有待進(jìn)一步深入研究。

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（收稿：2016-11-21修回：2017-02-23）

Capparis Spinosa L.Inhibit the Proliferation of Th17 Cells and Transcription of RORγtin Vitro

WANG Shanshan1,LIANG Peijun2,YING Xumin3
1 The Second Clinical Medical College,Zhejiang Chinese Medical University,Hangzhou(310053),China;2 The First Clinical Medical College,Zhejiang Chinese Medical University, Hangzhou(310053),China;3 Hangzhou Red Cross Hospital(the author is now working in Hangzhou Emergency Center),Hangzhou(310021),China

ObjectiveTo investigate the effect of Capparis spinosa L.On the proliferation and differentiation of Th17 cells in vitro.MethodsThe Th17 cells were cultrivated with different concentration of Cappris spinosa L.（1,10,and 20μg/mL）,then the cells were detected with Flow cytometry.In the second part of the experiment, the Th17 cells was cocultured with 10 μg/mL Capparis spinosa L.for the detection of RORγt by PCR.ResultsAfter 3-d coculture,the differentiation of Th17 cells in 10 and 20 μg/mL Capparis spinosa L.groups was significantly decreased compared to control group（4.83%±0.13%,4.99%±0.38%vs 8.24%±0.34%,P<0.05）;no significant difference in Th17 differentiation was found between 1 Capparis spinosa L.group and control and between 10 and 20μg/mL Capparis spinosa L.groups,respectively（P>0.05）.The transcription of RORγt in 10 μg/mL Capparis spinosa L.group（0.66±0.25）was lower than that in control group（1,P<0.05）and that in ERK inhibitor group（1.46±0.47,P<0.05）;but no significant difference was noted among P38 inhibitor group,JNK inhibitor group,and Capparis spinosa L.Group（P>0.05）.ConclusionCapparis spinosa L.can inhibit the proliferation and differentiation of Th17 cells through inhibiting the transcription of RORγt by ERK signaling pathway.

Capparis spinosa L.;Th17;RORγt;proliferation;differentiation

浙江省中醫(yī)藥科技計(jì)劃項(xiàng)目（No.2011ZA080）；浙江省醫(yī)藥衛(wèi)生科技計(jì)劃項(xiàng)目（No.2011KYA137）

1浙江中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院（杭州310053）；2浙江中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院（杭州310053）；3杭州市紅十字會醫(yī)院（現(xiàn)在杭州市急救中心工作）（杭州310021）

應(yīng)旭旻，Tel：0571-56109531；E-mail：xmyin@163.com