劉文鋒 印大中 湯長(zhǎng)發(fā) 唐利花 陳宗平

1湖南師范大學(xué)體適能與運(yùn)動(dòng)康復(fù)湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（長(zhǎng)沙 410012）

2湖南師范大學(xué)蛋白質(zhì)化學(xué)與發(fā)育生物學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（長(zhǎng)沙 410081）

規(guī)律有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)大鼠紋狀體miRNA207/542及下游靶信號(hào)通路的影響

劉文鋒1，2印大中1，2湯長(zhǎng)發(fā)1唐利花1陳宗平1

1湖南師范大學(xué)體適能與運(yùn)動(dòng)康復(fù)湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（長(zhǎng)沙 410012）

2湖南師范大學(xué)蛋白質(zhì)化學(xué)與發(fā)育生物學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（長(zhǎng)沙 410081）

目的：采用規(guī)律有氧運(yùn)動(dòng)干預(yù)不同年齡大鼠，基于miRNA表達(dá)譜芯片技術(shù)，旨在尋找運(yùn)動(dòng)適應(yīng)性作用對(duì)神經(jīng)退行性病變?cè)缙谧饔玫陌袠?biāo)，挖掘關(guān)鍵的可解釋運(yùn)動(dòng)適應(yīng)性作用機(jī)理的靶標(biāo)基因的生物功能。方法：選取SPF級(jí)健康雄性3月齡（青年，n=20）、13月齡（中年，n=24）和22月齡（老年，n=24）SD大鼠，每個(gè)年齡組大鼠按體重隨機(jī)分為青年對(duì)照組（Y-SED，n=10）、青年運(yùn)動(dòng)組（Y-EX，n=10），中年對(duì)照組（MSED，n=12）、中年運(yùn)動(dòng)組（M-EX，n=12），老年對(duì)照組（O-SED，n=12）和老年運(yùn)動(dòng)組（O-EX，n=12）。三組對(duì)照組安靜飼養(yǎng)；三組運(yùn)動(dòng)組進(jìn)行10周遞增負(fù)荷中等強(qiáng)度的規(guī)律有氧跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)。每周進(jìn)行體重監(jiān)控；采用HE染色觀察大鼠腦紋狀體形態(tài)學(xué)變化；采用miRNA微陣列芯片miRCURYTM LNA Array（v.18.0）等方法分析miRNAs差異表達(dá)譜，使用qRT-PCR等對(duì)篩選重要差異miRNA及其相關(guān)通路的mRNA表達(dá)進(jìn)行驗(yàn)證與研究。結(jié)果：大鼠紋狀體的形態(tài)學(xué)變化明顯呈現(xiàn)增齡性變化，實(shí)施規(guī)律有氧運(yùn)動(dòng)后，各年齡組相應(yīng)地出現(xiàn)線團(tuán)狀的基質(zhì)部分明顯緊湊，之間間隙非常緊密，顯微鏡下觀察細(xì)胞核排列有序，數(shù)量明顯增加。miRNA微陣列芯片數(shù)據(jù)結(jié)果顯示，發(fā)生2倍及以上變化差異的miRNAs有26個(gè)，經(jīng)生物信息學(xué)分析，最終篩查出規(guī)律有氧運(yùn)動(dòng)上調(diào)miRNA207和下調(diào)miRNA542的表達(dá)，miRNA207和miRNA542所作用的下游基因PI3K、Akt和mTOR mRNA表達(dá)呈現(xiàn)增齡性下調(diào)，與對(duì)照組M-SED和O-SED相比較，M-EX和O-EX組PI3K、Akt和mTOR mRNA表達(dá)上調(diào)（P＜0.05，P＜0.01）。Vdac1 mRNA呈現(xiàn)增齡性上升趨勢(shì)，與各年齡安靜組相比較，運(yùn)動(dòng)組CaMKIIα和Vdac1 mRNA表達(dá)上調(diào)顯著（P＜0.05）。結(jié)論：規(guī)律有氧運(yùn)動(dòng)通過上調(diào)miRNA207和下調(diào)miRNA542的表達(dá)而激活大鼠紋狀體的PI3K/Akt/mTOR和CaMKIIα信號(hào)通路共同參與調(diào)控紋狀體的生物學(xué)功能和改善神經(jīng)老化。

有氧運(yùn)動(dòng)；紋狀體；老化；miRNA207；miRNA542；PI3K；Akt；mTOR；CaMKIIα

microRNAs（miRNAs）是一種小RNA基因，長(zhǎng)度約20～24個(gè)核苷酸，為內(nèi)源性非編碼基因，miRNA廣泛表達(dá)并通過多種方式調(diào)控轉(zhuǎn)錄后的一系列基因，參與生命活動(dòng)的各項(xiàng)重要過程[1-3]。當(dāng)miRNA與靶mRNA堿基完全互補(bǔ)配對(duì)時(shí)，miRNA會(huì)引起靶mRNA的降解，而當(dāng)堿基序列不完全互補(bǔ)時(shí)，miRNA在蛋白翻譯水平上調(diào)控mRNA的表達(dá)。研究報(bào)道m(xù)iRNA對(duì)腦老化和神經(jīng)退行性疾病的形成具有關(guān)鍵調(diào)節(jié)作用，如miRNA-429調(diào)控阿爾茨海默病（Alzheimer’s Disease，AD）和亨廷頓?。℉untington’s disease，HD）兩種疾病，miRNA-743b-3p調(diào)節(jié)HD和帕金森病（Parkinson’s disease，PD）兩種疾病，miRNA-141-3p，miRNA-200a-3p，miR?NA-200a-5p和miRNA-499a-5p參與AD和PD這兩種疾病的調(diào)控，miRNA-182對(duì)這三種疾病都有影響[4-7]。Yin等[8]構(gòu)建自然增齡性老化模型，取全腦進(jìn)行miRNA深度測(cè)序，進(jìn)一步采用PANTHER分類系統(tǒng)[9]對(duì)靶基因進(jìn)行了分析，研究發(fā)現(xiàn)23種差異表達(dá)的miRNAs所調(diào)控的24種靶基因，分別對(duì)AD，HD或PD有直接的作用。

本研究基于miRNA表達(dá)譜芯片技術(shù)，旨在尋找運(yùn)動(dòng)適應(yīng)性作用對(duì)神經(jīng)退行性病變?cè)缙谧饔玫男碌陌袠?biāo)，再經(jīng)過實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證趨勢(shì)與miRNA芯片表達(dá)結(jié)果的一致性，經(jīng)生物信息學(xué)分析試圖尋找上調(diào)和下調(diào)miRNA而調(diào)控相關(guān)信號(hào)通路的mRNA表達(dá)，從而挖掘關(guān)鍵的可解釋運(yùn)動(dòng)適應(yīng)性作用機(jī)理的靶標(biāo)基因的生物功能。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)對(duì)象與分組

健康雄性SD大鼠3月齡（青年，n=20）、13月齡（中年，n=24）和22月齡（老年，n=24），均為SPF（Specific pathogen Free，SPF）級(jí)動(dòng)物，由長(zhǎng)沙市開福區(qū)東創(chuàng)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科技服務(wù)部提供，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（湘）2009-0012。以國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)嚙齒類動(dòng)物飼料（A級(jí)）飼養(yǎng)。室溫保持20～24℃，相對(duì)濕度為45%～55%。實(shí)驗(yàn)過程中對(duì)動(dòng)物的處置符合《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》、《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見》等規(guī)定。

每個(gè)年齡組大鼠按體重隨機(jī)分組，分為青年對(duì)照組（Y-SED，n=10）、青年運(yùn)動(dòng)組（Y-EX，n=10）；中年對(duì)照組（M-SED，n=12）、中年運(yùn)動(dòng)組（M-EX，n=12）；老年對(duì)照組（O-SED，n=12）和老年運(yùn)動(dòng)組（OEX，n=12）。三組對(duì)照組靜息，不做跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)；三組運(yùn)動(dòng)組進(jìn)行10周遞增負(fù)荷中等強(qiáng)度的規(guī)律有氧跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)。

1.2 規(guī)律有氧運(yùn)動(dòng)處方

所有運(yùn)動(dòng)組SD大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)2周后，采用杭州立泰科技有限公司研制的PT動(dòng)物電動(dòng)跑臺(tái)進(jìn)行3天5～10 min適應(yīng)性訓(xùn)練，坡度0°，速度10 m/min。中等強(qiáng)度規(guī)律有氧運(yùn)動(dòng)模型：參考本實(shí)驗(yàn)前期動(dòng)物實(shí)驗(yàn)等[10]，以及借鑒國(guó)內(nèi)張勇等研究報(bào)道[11]，運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度相當(dāng)于最大攝氧量（VO2max）60%～65%逐漸遞增到70%～75%，坡度0°，為期10周。青年、中年和老年大鼠的運(yùn)動(dòng)負(fù)荷均從每天以15 m/min速度跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)15 min開始，第2周速度不變，時(shí)間遞增5 min，第3周速度增加3 m/ min，時(shí)間延長(zhǎng)5 min，第4周速度不變，時(shí)間遞增5 min；根據(jù)增齡性因素，第5周從速度和時(shí)間兩方面考慮遞增延續(xù)到第6周作為運(yùn)動(dòng)負(fù)荷固定的過渡運(yùn)動(dòng)期，前6周每周運(yùn)動(dòng)6天。后4周固定運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度（隨機(jī)抽取3只大鼠，尾部采血測(cè)試血乳酸濃度監(jiān)控運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度）：青年組以25 m/min速度運(yùn)動(dòng)45 min，中年組以22 m/min速度運(yùn)動(dòng)40 min，老年組以20 m/min速度運(yùn)動(dòng)35 min，每周5天（見表1）。

1.3 實(shí)驗(yàn)取材與樣本制備

最后一周運(yùn)動(dòng)結(jié)束后，腹腔注射10%水合氯醛溶液按0.5 ml/100g麻醉大鼠進(jìn)行取材。每組隨機(jī)選取3只大鼠，進(jìn)行升主動(dòng)脈灌注[生理鹽水（37℃）快速灌注5 min（60 ml）左右以移除血液]，然后緩慢點(diǎn)滴4%多聚甲醛0.1 M磷酸緩沖液（pH 7.4）（4℃）400～500 ml灌注固定，直到動(dòng)物的肝臟發(fā)硬與尾巴僵直，取腦，保存在4%多聚甲醛0.1 M磷酸緩沖液中4°冰箱過夜，經(jīng)石蠟包埋后用于切片制作。其余大鼠直接取腦，參考Glwinski and Iversen[12，13]，諸葛啟釧主譯[14]大鼠腦立體定位圖譜，分離出兩側(cè)的新鮮紋狀體，經(jīng)液氮速凍后置于－80°冰箱保存，用于miRNA芯片等測(cè)試。

1.4 體重監(jiān)控

所有大鼠采用體重計(jì)每周一開始隔天測(cè)量體重，將每周測(cè)得3次體重求均值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。

1.5 HE染色

按照大鼠腦立體定位圖譜定位點(diǎn)：對(duì)耳線10 mm左右，前鹵0.7 mm左右，進(jìn)行切片，即可切到紋狀體部位。常規(guī)步驟：脫臘水化、蘇木素染色10～15 min、1%的鹽酸酒精分色、5%伊紅染色1 min、梯度酒精脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片、鏡檢。采用美國(guó)Simple PCI Version 6.0生物顯微鏡系統(tǒng)采集圖像。每組至少選片5張，每張切片鏡下（×200）隨機(jī)取5個(gè)視野進(jìn)行分析。

1.6 miRNA基因芯片基因芯片

采用丹麥Exiqon公司研發(fā)的第7代產(chǎn)品miRNA表達(dá)譜芯片miRCURYTMLNA Array（v.18.0）（Exiqon），包含3100個(gè)微探針，覆蓋人類、小鼠和大鼠以及除病毒之外的等所有已發(fā)現(xiàn)的microRNAs（參考miRBase 18.0），另外還包含25 miRPlusTM人類 miRNAs。

1.6.1 總RNA的提取

稱大鼠腦紋狀體60 mg左右，采用TRIzol法提取總RNA。采用紫外分光光度計(jì)（ND-1000，Nanodrop Technologies）檢驗(yàn)RNA樣品完整性。采用1.2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)所提取的RNA經(jīng)甲醛變性膠電泳完整性。由圖1可見RNA樣品質(zhì)量符合miRNA芯片實(shí)驗(yàn)要求。

圖1 增齡大鼠樣本抽提RNA的電泳情況

1.6.2 miRNA的芯片技術(shù)

使用試劑盒TRIzol（Invitrogen）and miRNeasy mini kit（QIAGEN）和miRCURY?Hy3?/Hy5?Pow?er labeling kit等抽提總RNA、量化RNA和進(jìn)行雜交，處理好的Exiqon’s miRCURY LNA?miRNA Array（miRNA芯片）采用儀器Axon GenePix 4000B microar?ray scanner掃描等；最后采用軟件miRCURY?LNA Array（v.18.0）、GenePix Pro 6.0 software（Axon）和Ingenuity Pathway Analysis等進(jìn)行RNA芯片修正、分析和生物信息學(xué)分析。經(jīng)過步驟：抽提RNA；RNA質(zhì)量檢測(cè)；總RNA的純化和濃縮；RNA反轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增；標(biāo)記miRNA；miRNA芯片雜交；洗片與掃描等。

1.6.3 miRNA芯片的掃描與數(shù)據(jù)分析

從圖2芯片掃描圖可見，圖像清晰，無背景信號(hào)，無劃痕，信號(hào)點(diǎn)規(guī)則，邊緣清晰雜交信號(hào)均一，表明芯片雜交反應(yīng)成功。

圖2 M-SED組（上）和M-EX組（下）的芯片掃描圖

采用中位數(shù)據(jù)歸一化方法（Median Normalization Method）得到標(biāo)準(zhǔn)值（Normalized Data）：Normalized Data=修正值（Foreground-Background）/medi?an，即為各個(gè)miRNA的修正值除以各張芯片的中位數(shù)做標(biāo)準(zhǔn)化后的數(shù)值，進(jìn)行樣本比較時(shí)采用的數(shù)值[15，16]。為了檢測(cè)集合中的miRNAs的差異化表達(dá)水平，我們通過 Bioconductor DESeq package[17]（http：//www.biocon?ductor.org/），來對(duì)miRDeep2中已知的miRNAs的表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.6.4 miRNAs生物信息學(xué)分析：靶點(diǎn)預(yù)測(cè)和功能分析

采用IPA（Ingenuity Pathway Analysis）分析工具以及靶標(biāo)預(yù)測(cè)數(shù)據(jù)庫(kù)TargetScan[18]中的所有miRNA靶標(biāo)數(shù)據(jù)。通過GO（Gene Ontology）分析可得到分子功能、生物過程和細(xì)胞組成三方面信息[19]。蛋白質(zhì)或者基因可以通過ID對(duì)應(yīng)或者序列注釋的方法找到與之對(duì)應(yīng)的GO號(hào)，從而得到功能類別或者細(xì)胞定位等。

通過miRDB（http：//mirdb.org/miRDB/）數(shù)據(jù)庫(kù)來預(yù)測(cè)差異性表達(dá)的已知miRNAs的靶點(diǎn)——預(yù)測(cè)得分≥60[20，21]。借助DAVID（http：//david.abcc.ncifcrf.gov/）生物信息學(xué)資源（6.7版本）對(duì)每個(gè)測(cè)到的靶點(diǎn)基因進(jìn)行功能學(xué)注釋，包括一個(gè)整合的生物學(xué)知識(shí)庫(kù)和分析工具，可以系統(tǒng)地從大基因/蛋白系列中提取生物學(xué)意義[22，23]。通過KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）網(wǎng)站數(shù)據(jù)庫(kù)[24，25]了解代謝、遺傳信息處理、環(huán)境信息處理、細(xì)胞過程和人類疾病等信息[26]。

1.7 miRNA207和miRNA542表達(dá)的qRT-PCR驗(yàn)證

1.7.1 qRT–PCR miRNA引物

表2 qRT-PCR miRNA引物設(shè)計(jì)

1.7.2 目的基因miRNA的相對(duì)定量

每組隨機(jī)3個(gè)樣本，每個(gè)樣品3個(gè)復(fù)管進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，確認(rèn)實(shí)時(shí)熒光定量PCR的擴(kuò)增曲線和熔解曲線，記錄各個(gè)基因miRNA的Ct（cycle threshold）值。以β-actin作為內(nèi)參，采用2－△△Ct法，對(duì)目的基因miRNA表達(dá)進(jìn)行相對(duì)定量。

1.8 下游靶信號(hào)通路mRNA的qRT-PCR檢測(cè)

表3 qRT-PCR mRNA引物設(shè)計(jì)

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)均用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行處理。所有數(shù)據(jù)均采用平均值 ±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示；各組間顯著性差異采用方差分析、組內(nèi)顯著性差異用雙側(cè)t檢驗(yàn)；本實(shí)驗(yàn)使用LSD法和SNK法進(jìn)行多重比較；P＜ 0.05為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 體重監(jiān)控情況

從圖3可以得出，健康雄性SD大鼠3.0月齡（青年組）體重481.25±22.17 g、13月齡（中年組）體重547.75±21.94 g和23月齡（老年組）體重693.21± 68.85 g。各年齡安靜組的大鼠體重隨著實(shí)驗(yàn)時(shí)間而出現(xiàn)比較穩(wěn)定的緩慢增加趨勢(shì)，體重增加的變化無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而各年齡運(yùn)動(dòng)組從第2周開始體重有下降趨勢(shì)，趨勢(shì)一直延續(xù)到實(shí)驗(yàn)結(jié)束，其中第3周中年安靜組與運(yùn)動(dòng)組的大鼠體重相比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；第4周開始到第10周，青年、中年和老年安靜組與相應(yīng)的運(yùn)動(dòng)組相比較，體重差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

圖3 增齡大鼠及運(yùn)動(dòng)干預(yù)對(duì)大鼠體重的監(jiān)控

2.2 紋狀體HE染色結(jié)果

從圖4可以看出，Y-SED組大鼠紋狀體的線團(tuán)狀的基質(zhì)部分很明顯，之間間隙明顯，M-SED組則基質(zhì)部分能明顯分別出來，之間間隙比Y-SED組明顯減小，而O-SED組難以辨出基質(zhì)部分，之間間隙非常小?？梢姲察o組明顯呈現(xiàn)年齡增齡性變化。實(shí)施規(guī)律有氧運(yùn)動(dòng)后，各年齡組相應(yīng)的出現(xiàn)線團(tuán)狀的基質(zhì)部分明顯緊湊，之間間隙非常緊密，顯微鏡下觀察細(xì)胞核排列有序，數(shù)量明顯增加，表明規(guī)律有氧運(yùn)動(dòng)改善了紋狀體的形態(tài)結(jié)構(gòu)。

圖4 增齡大鼠紋狀體HE染色（其中CPu即為紋狀體）

2.3 差異miRNAs的結(jié)果

本實(shí)驗(yàn)通過miRNA微陣列芯片數(shù)據(jù)篩選出發(fā)生2倍及以上變化差異的miRNAs 26個(gè)（見表4和5）。其中規(guī)律有氧運(yùn)動(dòng)上調(diào)2倍及以上大鼠紋狀體的15個(gè)miRNAs：miR-207、miR-3593-3p和miR-106b-3p等；而下調(diào)2倍及以上的11個(gè)miRNAs：miR-542-3p、miR-363-5p和miR-141-5p等。

本實(shí)驗(yàn)對(duì)上述26個(gè)miRNAs分別進(jìn)行生物信息學(xué)分析：靶點(diǎn)預(yù)測(cè)及其功能分析。通過表達(dá)量趨勢(shì)配對(duì)、亞細(xì)胞定位篩選、靶標(biāo)基因在已知疾病中的作用、通路篩選等提煉可能調(diào)控的靶基因?qū)?；使用轉(zhuǎn)錄因子預(yù)測(cè)、分子活性預(yù)測(cè)等模塊，從靶標(biāo)數(shù)據(jù)庫(kù)中篩選出最可信的miRNA-mRNA相互作用網(wǎng)絡(luò)；結(jié)果發(fā)現(xiàn)miRNA207和miRNA542符合本實(shí)驗(yàn)的研究需要，值得進(jìn)一步研究。

表4 篩選出大鼠紋狀體運(yùn)動(dòng)組比安靜組上調(diào)2倍及以上的miRNAs

表5 篩選出大鼠紋狀體運(yùn)動(dòng)組比安靜組下調(diào)2倍及以上的miRNAs

2.4 miRNA207和miRNA542的生物信息學(xué)分析與下游靶基因預(yù)測(cè)

2.4.1 GO分析

根據(jù)GO生物信息學(xué)分析，預(yù)測(cè)miRNA207和miR?NA542所作用的靶標(biāo)相關(guān)蛋白的功能等，靶標(biāo)相關(guān)蛋白主要涉及到蛋白結(jié)合的蛋白質(zhì)有122個(gè)、催化結(jié)合蛋白105個(gè)和陽離子結(jié)合蛋白61個(gè)等，主要參與AMP結(jié)合、神經(jīng)遞質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)活動(dòng)、ATP合成和谷氨酸結(jié)合等生物學(xué)功能（圖5）。96個(gè)蛋白參與生物合成、93個(gè)蛋白為氮有關(guān)活動(dòng)蛋白、86個(gè)蛋白為轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、84個(gè)蛋白參與能量代謝、84個(gè)蛋白參與發(fā)育過程等。蛋白相關(guān)的生物功能涉及嘌呤核苷酸信號(hào)、Ca2+依賴的細(xì)胞外分泌正調(diào)控、細(xì)胞凋亡負(fù)調(diào)控、大腦行為應(yīng)答和P53參與調(diào)控的DNA損壞應(yīng)答調(diào)控等（圖6）。

圖5 GO分析得出大鼠紋狀體miRNA的分子功能分類

2.4.2 KEGG生物學(xué)通路分析

由KEGG生物學(xué)通路分析可知miRNA207與鈣信號(hào)依賴蘇氨酸激酶（Cask）、突觸素、1433蛋白和Bcl-2等蛋白有著密切關(guān)系；而miR-542-3p與谷氨酸結(jié)合蛋白、ATP結(jié)合蛋白和核內(nèi)不均一核糖蛋白3等有著密切關(guān)系。經(jīng)過KEGG生物學(xué)通路分析，對(duì)可能富集的生物學(xué)通路進(jìn)行了預(yù)測(cè)，對(duì)符合P值者（EASE-score，F(xiàn)isher-P value or Hypergeometric-P value）進(jìn)行相關(guān)通路的預(yù)測(cè)，包括：神經(jīng)活性配體-受體相互作用信號(hào)通 路 （Neuroactive ligand- receptor interaction，rno04080）、鈣信號(hào)通路（Calcium signaling pathway，rno04020）和γ-氨基丁酸突觸信號(hào)通路（GABAergic synapse，rno04727）等。這些統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的生物學(xué)信號(hào)通路可能與神經(jīng)老化或者神經(jīng)退行有著密切關(guān)系。GO和KEGG生物學(xué)通路分析結(jié)果顯示，運(yùn)動(dòng)對(duì)增齡大鼠紋狀體的細(xì)胞死亡、突觸結(jié)構(gòu)重塑、氨基酸代謝、糖代謝和DNA損傷等的影響是本研究中miRNAs靶基因生物信息學(xué)分析的主要方向。

圖6 GO分析得出大鼠紋狀體miRNA的生物學(xué)功能分類

2.5 差異篩選miRNA207和miRNA542的驗(yàn)證

采用qRT-PCR驗(yàn)證差異表達(dá)的miRNA，根據(jù)前面靶基因預(yù)測(cè)與分析，選擇上調(diào)miRNA207和下調(diào)miR?NA542進(jìn)行驗(yàn)證，驗(yàn)證結(jié)果與芯片結(jié)果基本一致。

由圖7可以看出，miRNA207表達(dá)呈現(xiàn)增齡性上升趨勢(shì)。與Y-SED相比較，M-SED和O-SED的miR? NA207表達(dá)上調(diào)顯著（P＜0.05），但是M-SED和O-SED之間沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；各年齡安靜組與運(yùn)動(dòng)組相比較，miRNA207表達(dá)上調(diào)顯著（P＜0.01）。

圖7 qRT-PCR測(cè)定miRNA207擴(kuò)增曲線和溶解曲線及其表達(dá)水平

從圖8可以看出，miRNA542表達(dá)的變化呈現(xiàn)不明顯的增齡性上升或下降趨勢(shì)。與Y-SED相比，M-SED的miRNA542表達(dá)稍上調(diào)（P＞0.05），而O-SED上調(diào)顯著（P＜0.01）；與Y-SED相比，Y-EX的 miRNA542表達(dá)略增高（P＞0.05）；與M-SED相比，M-EX的miRNA542表達(dá)有所下降（P＞0.05）；與O-SED相比較，O-EX的miRNA542表達(dá)顯著下調(diào)（P＜0.01）。

圖8 qRT-PCR測(cè)定miRNA542擴(kuò)增曲線和溶解曲線及其表達(dá)水平

圖9 qRT-PCR測(cè)定PI3K擴(kuò)增曲線和溶解曲線及其表達(dá)水平

圖10 qRT-PCR測(cè)定Akt擴(kuò)增曲線和溶解曲線及其表達(dá)水平

圖11 qRT-PCR測(cè)定mTOR擴(kuò)增曲線和溶解曲線及其表達(dá)水平

2.5 下游靶信號(hào)通路PI3K/Akt/mTOR表達(dá)水平

從圖9-11可以看出，PI3K、Akt和mTOR mRNA表達(dá)呈現(xiàn)增齡性下調(diào)，與Y-SED相比較，O-SED的PI3K、Akt和mTOR mRNA表達(dá)下調(diào)顯著（P＜0.05）。與Y-SED相比，Y-EX的Akt和mTOR mRNA表達(dá)稍上調(diào)，而PI3K出現(xiàn)下調(diào)趨勢(shì)，但沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與M-SED相比較，M-EX的PI3K、Akt和mTOR mRNA表達(dá)上調(diào)（P＜0.05）；與O-SED相比較，O-EX的PI3K、Akt和mTOR mRNA表達(dá)上調(diào)顯著（P＜0.01）。

2.6 下游靶信號(hào)通路CaMKIIα的影響

從圖12和13可以看出，Vdac1 mRNA呈現(xiàn)增齡性上升趨勢(shì)，與Y-SED相比較，M-SED和O-SED的CaMKIIα和Vdac1 mRNA表達(dá)均顯著上調(diào)（P＜0.05），但M-SED和O-SED之間比較沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；各年齡安靜組與運(yùn)動(dòng)組相比較，CaMKIIα和Vdac1 mRNA表達(dá)上調(diào)顯著（P＜0.05），其中與M-SED相比較，M-EX明顯上調(diào)（P＜0.01）。

圖12 qRT-PCR測(cè)定CaMKIIα擴(kuò)增曲線和溶解曲線及其表達(dá)水平

圖13 qRT-PCR測(cè)定Vdac1擴(kuò)增曲線和溶解曲線及其表達(dá)水平

3 討論

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)規(guī)律運(yùn)動(dòng)上調(diào)2倍及以上的大鼠紋狀體的15個(gè)miRNAs，如miR-207等；而下調(diào)2倍及以上的11個(gè)miRNAs，如miR-542-3p等。Tan等[27]研究發(fā)現(xiàn)miRNA207調(diào)控下游靶基因Akt3作用于DNA損傷與細(xì)胞凋亡的過程。PI3K/Akt/mTOR通路通過影響下游多種效應(yīng)分子的活化狀態(tài)，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、凋亡、分化和代謝等一系列重要的生理活動(dòng)，也與腫瘤細(xì)胞的增殖、分化、凋亡、化療耐藥性及血管生成密切相關(guān)[28]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示PI3K、Akt和mTOR mRNA表達(dá)呈現(xiàn)增齡性下調(diào)，表明增齡過程中，生存信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路PI3K/Akt/mTOR隨年齡的增長(zhǎng)而下調(diào)；運(yùn)動(dòng)對(duì)各年齡大鼠PI3K、Akt和mTOR mRNA表達(dá)總體性上調(diào)，除青年運(yùn)動(dòng)組PI3K出現(xiàn)下調(diào)趨勢(shì)（P＞0.05），表明規(guī)律有氧運(yùn)動(dòng)能激活PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路。Fujita和Sato等[29，30]研究發(fā)現(xiàn)在抗凋亡途徑PI3K/Akt激酶通路中，Akt激酶等一系列激酶均屬于HSP90底物蛋白，HSP90及輔助伴侶分子Cdc37與Akt結(jié)合，使其活化發(fā)揮抗凋亡作用。Tao等[31]報(bào)道側(cè)腦室注射miR-207激動(dòng)劑后，神經(jīng)功能缺損和腦梗死體積被減弱，同時(shí)線粒體棘結(jié)構(gòu)被改善；此外，miR-207模擬物可以減少溶酶體和自噬體數(shù)量，增加自噬泡的數(shù)量；他們的研究結(jié)果提示miR-207可能影響自噬—溶酶體信號(hào)通路和線粒體誘導(dǎo)的凋亡。Long等[32]報(bào)道m(xù)iR542-3p抑制癌細(xì)胞的增長(zhǎng)與擴(kuò)散并促進(jìn)其凋亡。說明miR-207和miR542-3p都可能是研究運(yùn)動(dòng)改善神經(jīng)老化的新的靶標(biāo)分子，亟待進(jìn)一步研究。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明運(yùn)動(dòng)上調(diào)增齡大鼠紋狀體的miR?NA207表達(dá)和下調(diào)miRNA542表達(dá)；miRNA207和miR?NA542所作用的下游信號(hào)通路主要有：神經(jīng)老化或者神經(jīng)退行有著密切關(guān)系的神經(jīng)活性配體—-受體相互作用信號(hào)通路、鈣信號(hào)通路和γ-氨基丁酸突觸信號(hào)通路等12條通路。同時(shí)，本實(shí)驗(yàn)通過生物學(xué)通路分析，得知miRNA207與鈣信號(hào)依賴蘇氨酸激酶（Cask）、突觸素、1433蛋白和Bcl-2等蛋白表達(dá)有著密切關(guān)系，提示運(yùn)動(dòng)有利于改善腦老化，可能與突觸蛋白相關(guān)聯(lián)。CaMKII是腦內(nèi)最為豐富的蛋白激酶之一，是調(diào)控鈣信號(hào)等多條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通道的重要分子，在突觸可塑性、學(xué)習(xí)和記憶中具有關(guān)鍵作用[33，34]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)CaMKIIα和Vdac1 mRNA呈現(xiàn)增齡性趨勢(shì)，與各年齡安靜組相比較，運(yùn)動(dòng)組CaMKIIα和Vdac1 mRNA表達(dá)上調(diào)顯著。已有實(shí)驗(yàn)證實(shí)CaMKII-α缺乏的轉(zhuǎn)基因小鼠表現(xiàn)出顯著的突觸可塑性缺陷和記憶形成障礙[35]。CaM?KII-α被發(fā)現(xiàn)同時(shí)存在于突觸前和突觸后部位，突觸前的CaMKII-α主要參與了突觸小泡群集和神經(jīng)遞質(zhì)釋放的調(diào)控，位于突觸后部位的CaMKII-α則參與調(diào)節(jié)NMDA受體的表達(dá)水平及其向突觸后膜的定位。Foster等[36]將老化腦中鈣調(diào)神經(jīng)素（Calcineurin，CN）活性變化與胞內(nèi)Ca2+濃度的變化聯(lián)系了起來，他們證明其在學(xué)習(xí)記憶中有重要作用，參與了大腦神經(jīng)元突觸效應(yīng)的去增強(qiáng)、多種不同機(jī)制的長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)、長(zhǎng)時(shí)程抑制、認(rèn)知記憶、短期記憶向長(zhǎng)期記憶的轉(zhuǎn)換、腦老化等過程[37]。

4 結(jié)論

規(guī)律運(yùn)動(dòng)通過上調(diào)miRNA207和下調(diào)miRNA542的表達(dá)而激活大鼠紋狀體的PI3K/Akt/mTOR和CaM?KIIα信號(hào)通路共同參與調(diào)控紋狀體的生物學(xué)功能和改善神經(jīng)老化。

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The Effect of Regular Aerobic Exercise on the Expression of miRNA207 and miRNA542 and Downstream Target Signal Transduction in the Striatum of Rats

Liu Wenfeng1，2，Yin Dazhong1，2，Tang Changfa1，Tang Lihua1，Chen Zongping1
1 Hunan Provincial Key Laboratory of Physical Fitness and Sports Rehabilitation，Hunan Normal University，Changsha 410012，China
2 The Key Laboratory of Protein Chemistry and Developmental Biology of Ministry of Education，Hunan Normal University，Changsha 410081，China Corresponding Author：Liu Wenfeng，wfliu@hunnu.edu.cn

ObjectiveTo explore the new targets of the impact of exercise on the striatal in the ear?ly neurodegeneration among rats of different ages with regular aerobic exercise by means of the miR?NA expression profile chip technology，and explain the key biochemical and molecular regulation mech?anism of the new target genes.MethodsThree，13 and 22-month-old specific pathogen free（SPF）male Sprague-Dawley Rat（SD）rats were randomly divided into a young（Y-SED，n=10），a middleaged（M-SED，n=10）and an old-aged（O-SED，n=12）sedentary control group，and the correspond?ing Y-EX（n=10），M-EX（n=10）and O-EX（n=12）in the aerobic exercise group.The rats in the sedentary control groups didn’t exercise，while those in the aerobic exercise groups underwent a 10-week regular moderate-intensity aerobic exercise on treadmill.The rats’body weight was measured ev?ery week.HE staining was used to present the morphological changes in the striatum.The miRNA mi?croarray of miRNA miRCURYTM LNA Array（v.18.0）（Exiqon，Danish）was employed to analyze the expression profile of miRNAs.The qRT-PCR was performed to screen and to verify the related signal pathways for the biochemical mechanisms.ResultsThe morphology of the rats’striatum changed clear?ly with ages.The nuclei in the striatum were arranged orderly and the number of nuclei increased sig?nificantly in each group undergoing regular aerobic exercise.miRNA microarray data showed that 26 miRNAs increased to no less than twice of the original level.The expression of miRNA207 was found up-regulated while that of miRNA542 was down-regulated after regular aerobic exercise through screen?ing the bioinformatics of miRNA.The expression of PI3K，Akt and mTOR mRNA，downstream genes of miRNA207 and miRNA542，was also found down-regulated with the increase of age.However，com?pared with the sedentary groups，the expression of PI3K，Akt and mTOR was higher in the exercise groups.The Vdac1 mRNA was observed an increasing tendency with age.Compared with all the seden?tary groups，significant upregulation was observed in the expression of CaMKIIα and Vdac1 in the aer?obic exercise groups.ConclusionRegular aerobic exercise can regulate the biological function of rats’striatum and alleviate the aging process through upregulating the expression of miRNA207 and downreg?ulating that of miRNA542 to activate the PI3K/Akt/mTOR and CaMKIIα signaling pathway.

aerobic exercise，striatum，aging，miRNA207，miRNA542，PI3K，Akt，mTOR，CaM?KIIα

2016.08.10

湖南師范大學(xué)青年優(yōu)秀人才培養(yǎng)計(jì)劃（ET1507）；國(guó)家自然科學(xué)基金（31271257）；國(guó)家高科技 863計(jì)劃（2008AA02Z411）；湖南省自然科學(xué)基金（11JJ6082）；湖南教育廳優(yōu)秀青年基金（12B088）

劉文鋒，Email：wfliu@hunnu.edu.cn