張珍珍，何長(zhǎng)久，劉國(guó)世

（中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，北京 100193）

褪黑素對(duì)雌性動(dòng)物繁殖影響的研究進(jìn)展

張珍珍，何長(zhǎng)久，劉國(guó)世*

（中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，北京 100193）

編者按

2017年《中國(guó)畜牧雜志》全面改版。為更好展示畜牧學(xué)領(lǐng)域的科技前沿，促進(jìn)學(xué)術(shù)交流，本刊特別邀請(qǐng)不同領(lǐng)域的專家或青年骨干，圍繞各自的研究領(lǐng)域，介紹自己、團(tuán)隊(duì)或國(guó)際研究機(jī)構(gòu)近幾年的研究成果、存在問題及研究展望，或就當(dāng)前的研究熱點(diǎn)問題進(jìn)行討論和評(píng)論。2017年第一期自副主編開始，將為讀者帶來(lái)相關(guān)綜述，希望能引發(fā)讀者對(duì)相關(guān)熱點(diǎn)、難點(diǎn)的思考，并進(jìn)行深入探討。

卵母細(xì)胞和顆粒細(xì)胞是構(gòu)成哺乳動(dòng)物卵泡的主要細(xì)胞類型。排卵后，成熟卵母細(xì)胞經(jīng)受精進(jìn)入胚胎發(fā)育階段并通過植入子宮與母體建立聯(lián)系，而顆粒細(xì)胞則繼續(xù)留在卵巢內(nèi)與卵泡膜細(xì)胞一起分化形成黃體。因此，卵母細(xì)胞成熟、黃體形成、胚胎發(fā)育與胚胎附植是家畜繁殖學(xué)研究的核心內(nèi)容。褪黑素（Melatonin, MLT）是由動(dòng)物松果體[1]產(chǎn)生的神經(jīng)內(nèi)分泌激素，既是高效的活性氧[2]（Reactive Oxidative Stress, ROS）清除劑，也是重要的生殖激素。褪黑素也存在于藻類、植物等絕大多數(shù)生物機(jī)體中，是一種重要的生理調(diào)節(jié)劑。近年發(fā)現(xiàn)動(dòng)物多種組織和器官中都有褪黑素合成。已知褪黑素在動(dòng)物免疫調(diào)控[3]、物種進(jìn)化[4]、抗癌[5]、抗衰老[6]等方面都發(fā)揮重要作用，有關(guān)MLT與雌性生殖關(guān)系的研究，仍亟待探索。近年的研究表明褪黑素在動(dòng)物性成熟、激素分泌、卵泡發(fā)育、黃體功能、排卵、妊娠和分娩過程中發(fā)揮著廣泛的作用。本文主要綜述了國(guó)內(nèi)外特別是本實(shí)驗(yàn)室在繁殖領(lǐng)域的最新研究進(jìn)展，特別是褪黑素作用于生殖細(xì)胞的具體機(jī)制、合成來(lái)源以及生產(chǎn)應(yīng)用試驗(yàn)方面。

1 卵巢局部褪黑素旁（自）分泌信號(hào)參與排卵調(diào)控

在促黃體素（Luteinizing Hormone, LH）峰后，褪黑素可通過褪黑素Ⅰ型（MT1）受體調(diào)控卵泡顆粒細(xì)胞黃體化。排卵前，雌激素誘導(dǎo)垂體LH峰的形成，從而激發(fā)卵母細(xì)胞成熟分裂與顆粒細(xì)胞黃體化。本實(shí)驗(yàn)室在小鼠和牛的研究中發(fā)現(xiàn)[7]，排卵前LH峰能誘導(dǎo)顆粒細(xì)胞中MT1表達(dá)水平呈現(xiàn)數(shù)百倍上升，在持續(xù)4 h后恢復(fù)到基礎(chǔ)水平，并將之命名為排卵前MT1峰；而同一時(shí)期，卵丘細(xì)胞中的褪黑素合成酶SNAT（即AANAT）基因的表達(dá)水平也極顯著上升，引起卵泡液中的褪黑素水平升高。以上研究表明，MLT/MT1是LH的下游信號(hào)分子，并推測(cè)MLT/MT1信號(hào)極有可能調(diào)控顆粒細(xì)胞黃體化。本實(shí)驗(yàn)室進(jìn)一步驗(yàn)證了上述推測(cè)，發(fā)現(xiàn)在MT1受體峰前補(bǔ)充外源褪黑素可以改善小鼠新生黃體的功能，血清中孕酮水平顯著上升，胚胎附植點(diǎn)數(shù)以及產(chǎn)仔數(shù)均顯著增加。收集顆粒細(xì)胞進(jìn)行LncRNA以及mRNA測(cè)序，發(fā)現(xiàn)褪黑素主要是通過調(diào)控PI3KAkt信號(hào)通路、細(xì)胞基質(zhì)受體（ECM-Receptor）互作，影響黃體細(xì)胞外基質(zhì)重塑和血管形成，從而調(diào)控顆粒細(xì)胞黃體化[7]。這表明，卵泡局部存在調(diào)控黃體化的褪黑素旁（自）分泌信號(hào)，即在排卵過程中，LH分別誘導(dǎo)卵丘細(xì)胞合成褪黑素和顆粒細(xì)胞產(chǎn)生MT1峰，隨后卵丘細(xì)胞合成的褪黑素以旁分泌的方式作用于顆粒細(xì)胞上的MT1受體，通過PI3K/ Akt、外基質(zhì)重塑信號(hào)調(diào)控黃體形成。

排卵過程中，線粒體合成的褪黑素可促進(jìn)卵母細(xì)胞成熟。早期研究表明[8]，外源褪黑素能夠促進(jìn)牛的卵母細(xì)胞體外成熟，顯著提高體外受精胚胎發(fā)育潛力，說(shuō)明褪黑素可能直接參與卵母細(xì)胞成熟調(diào)控；本實(shí)驗(yàn)室進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)確認(rèn)了卵母細(xì)胞中褪黑素的來(lái)源，證實(shí)排卵過程中卵母細(xì)胞線粒體合成大量褪黑素[9]，卵泡液中褪黑素濃度也顯著高于同時(shí)期血清水平。此外，研究發(fā)現(xiàn)褪黑素通過改善線粒體功能提高卵母細(xì)胞成熟質(zhì)量[9]：一方面，褪黑素促進(jìn)線粒體在卵內(nèi)正常分布，并通過提高線粒體DNA（mtDNA）拷貝數(shù)與膜電位（MMP）增加ATP合成，從而促進(jìn)卵母細(xì)胞減數(shù)分裂中期紡錘體組裝；另一方面，褪黑素能抑制線粒體呼吸鏈代謝過程中活性氧的產(chǎn)生，降低卵母細(xì)胞內(nèi)游離堿基氧化產(chǎn)物8-oxodG水平，從而降低DNA氧化損傷，并通過影響凋亡相關(guān)基因（Bcl-2、Caspase3）的表達(dá)，抑制卵母細(xì)胞凋亡[9]。褪黑素還作用于卵母細(xì)胞上褪黑素受體MT1，通過上調(diào)卵丘擴(kuò)展基因PTX3和HAS1表達(dá)促進(jìn)卵丘擴(kuò)展，同時(shí)上調(diào)EGFR的表達(dá)水平，增強(qiáng)LH（或hCG）的作用，進(jìn)而促進(jìn)卵母細(xì)胞成熟相關(guān)基因MARF1的表達(dá)，提高卵母細(xì)胞成熟效率[8]。以上結(jié)果表明，褪黑素是卵母細(xì)胞在長(zhǎng)期進(jìn)化過程中所形成的用于抵御排卵過程中氧化損傷的重要分子。

2 早期胚胎發(fā)育過程中，褪黑素可通過MT1受體促進(jìn)胚胎發(fā)育

本實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn)外源褪黑素可以顯著提高體外胚胎的發(fā)育效率，并證實(shí)褪黑素受體MT1在牛胚胎早期發(fā)育階段（原核胚、2-細(xì)胞胚、8/16細(xì)胞胚、囊胚）中持續(xù)表達(dá)，8/16細(xì)胞胚胎表達(dá)水平最高[8]。利用受體抑制劑Luzindole阻斷胚胎MT1受體后，褪黑素對(duì)胚胎發(fā)育的促進(jìn)作用減弱，這證實(shí)褪黑素促進(jìn)早期胚胎發(fā)育是通過MT1受體介導(dǎo)的；進(jìn)一步研究證實(shí)，褪黑素通過MT1受體下調(diào)胚胎中第二信使cAMP的水平，影響cAMP/PKA的下游通路，進(jìn)而調(diào)控Dnmt1a、SLC2A1、ErbB1基因，促進(jìn)囊胚葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)、基因組表觀修飾以及囊胚激活，從而顯著提高原核胚體外發(fā)育的囊胚率、囊胚孵化率和囊胚細(xì)胞數(shù)。此外，添加褪黑素體外培養(yǎng)小鼠原核胚胎發(fā)育到囊胚，移植后的妊娠率、平均產(chǎn)仔數(shù)和后代成活率分別提高了40.1%、52.4%、15.6%[10]；褪黑素還能改善囊胚線粒體功能，抑制凋亡基因p53、Bax和Caspase3的表達(dá)，促進(jìn)抗氧化基因GPx4和SOD1表達(dá)，從而抑制囊胚細(xì)胞內(nèi)線粒體凋亡途徑，并減少囊胚氧化損傷，提高囊胚質(zhì)量[9]。這進(jìn)一步表明，褪黑素還可通過抗氧化及抗凋亡作用促進(jìn)胚胎體外發(fā)育效率和提高囊胚質(zhì)量。

3 胚胎附植過程中，褪黑素通過MT2受體促進(jìn)子宮接受態(tài)的形成

人排卵前大卵泡中MT含量高于小卵泡，MT含量和孕酮（P）呈正相關(guān)[11]。人子宮上，存在具有功能的MT1受體和褪黑素Ⅱ型（MT2）受體，妊娠和非妊娠狀態(tài)下表達(dá)情況不同，影響子宮的晝夜收縮節(jié)律和分娩。女性月經(jīng)周期中血清褪黑素含量黃體期較卵泡期高，顆粒細(xì)胞-黃體細(xì)胞上有褪黑素結(jié)合位點(diǎn)，褪黑素能直接激活黃體細(xì)胞分泌P；同時(shí)，褪黑素(10 pM-100 nM)能顯著提高黃體細(xì)胞LH受體的表達(dá)[12]。在大鼠上，切除松果體后胚胎附植點(diǎn)顯著減少，雌二醇（E2）上升，P下降，補(bǔ)充外源褪黑素后恢復(fù)正常[13]。本實(shí)驗(yàn)室進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，MT2受體在妊娠第2天的子宮腔上皮與子宮腺內(nèi)特異表達(dá)，褪黑素合成酶基因SNAT在妊娠后表達(dá)水平持續(xù)上升。對(duì)妊娠小鼠進(jìn)行持續(xù)外源褪黑素處理，采集妊娠第4天子宮進(jìn)行組織學(xué)分析，褪黑素能顯著增大子宮內(nèi)膜面積，增加內(nèi)膜中子宮腺的密度和面積，并且促進(jìn)小鼠胚胎附植[14]。以上研究表明褪黑素在胚胎附植過程中發(fā)揮重要作用。

4 褪黑素可抵御環(huán)境應(yīng)激

環(huán)境應(yīng)激造成家畜繁殖力下降，每年給畜牧業(yè)帶來(lái)了不可估量的損失，是畜牧生產(chǎn)中難以解決卻又不得不面對(duì)的難題。熱應(yīng)激是一類典型的環(huán)境應(yīng)激，容易造成母畜卵泡閉鎖、卵泡細(xì)胞凋亡以及卵母細(xì)胞成熟異常。本實(shí)驗(yàn)室前期研究表明，豬的卵母細(xì)胞在熱應(yīng)激狀態(tài)下，自身會(huì)合成大量的褪黑素，后續(xù)研究證實(shí)褪黑素能夠顯著提高熱應(yīng)激豬卵母細(xì)胞的成熟效率[15]。并發(fā)現(xiàn)褪黑素可以抑制羊顆粒細(xì)胞的凋亡[16]。本實(shí)驗(yàn)室還發(fā)現(xiàn)植物抗氧化劑白藜蘆醇可通過Mos/MEK/p42通路促進(jìn)卵母細(xì)胞體外成熟[17]；同時(shí)白藜蘆醇也能通過緩解熱應(yīng)激帶來(lái)的氧化損傷，通過改善線粒體功能從而保護(hù)豬卵母細(xì)胞體外成熟，但效果弱于褪黑素[15,18]；褪黑素和白藜蘆醇共同添加時(shí)，緩解熱應(yīng)激作用最佳[18]。

5 展 望

本文綜述了褪黑素在哺乳動(dòng)物上的繁殖調(diào)控作用，包括提高卵母細(xì)胞成熟、胚胎發(fā)育、附植效率和改善黃體功能，減少應(yīng)激等。我們將上述成果運(yùn)用于家畜和家禽的實(shí)際生產(chǎn)，發(fā)現(xiàn)：①荷斯坦奶牛（體細(xì)胞數(shù)在30～100萬(wàn)/mL）連續(xù)4 d皮下注射4.64 mg褪黑素能顯著提高血液中白蛋白含量，降低皮質(zhì)醇、白細(xì)胞、淋巴細(xì)胞水平，提高機(jī)體免疫力，降低牛奶體細(xì)胞數(shù)，使奶中體細(xì)胞數(shù)從42.52±5.17萬(wàn)/mL降低到26.24±4.22萬(wàn)/mL，降幅近40%[19]。②配種時(shí)皮下注射2 mL褪黑素復(fù)合抗氧化劑可以將春季奶牛產(chǎn)后首次配種受胎率由38.32%提高到46.83%，夏季奶牛產(chǎn)后首次配種受胎率由25.00%提高到38.89%[7]。③給受體羊埋植40mg褪黑素可以將原核胚微注射外源基因胚胎移植受胎率由14.3%提高至31.3%[20]。④給超數(shù)排卵供體梅花鹿埋植40mg褪黑素可以將其黃體數(shù)量由5.75個(gè)提高至9.75個(gè)[21]。⑤產(chǎn)蛋高峰期后埋植適當(dāng)劑量褪黑素能夠抑制產(chǎn)蛋性能下降，能使產(chǎn)蛋率提高，并能提高總蛋重，降低沙皮蛋率及沙破蛋率，但能夠降低平均蛋重和蛋黃色澤；最佳埋植時(shí)間360日齡左右，最佳劑量10mg，有效期至少3個(gè)月，產(chǎn)蛋率平均提高約4%～8%[22]。此外， Farez等[3]發(fā)現(xiàn)，人類免疫疾病多發(fā)性硬化癥發(fā)病率與體內(nèi)褪黑素水平相關(guān)，當(dāng)體內(nèi)褪黑素水平升高可以改變免疫細(xì)胞Th17和Tr1細(xì)胞的增殖進(jìn)而抑制該病的發(fā)生。這提示我們，褪黑素在預(yù)防和治療雌性動(dòng)物繁殖障礙疾病上還有許多潛在作用。

綜上所述，一定劑量的褪黑素，可以保證動(dòng)物正常的生理功能，改善其繁殖性能。目前，組學(xué)、表觀遺傳等先進(jìn)技術(shù)手段在生殖生理學(xué)領(lǐng)域的進(jìn)一步應(yīng)用，將有助于深入揭示褪黑素在動(dòng)物生殖調(diào)控上的作用通路和分子機(jī)理。

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10.19556/j.0258-7033.2017-06-001

國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃（973計(jì)劃）（2014CB138 505）

張珍珍（1992-），女，在讀博士，研究方向：動(dòng)物配子和胚胎發(fā)育調(diào)控機(jī)制，E-mail: free1534677917@gmail. com

* 通訊作者：劉國(guó)世（1972-），男，教授，博導(dǎo)，研究方向：動(dòng)物配子和胚胎發(fā)育調(diào)控機(jī)制及繁殖技術(shù)，E-mail: gshliu@cau. edu.cn