邵勤+周小莉+張瑩+吳斌+王莎莎

摘要：目的 研究膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎（KOA）肝腎虧虛證的內(nèi)源性代謝物，探討KOA肝腎虧虛證辨證的物質(zhì)代謝輪廓。方法 選取KOA肝腎虧虛證和非肝腎虧虛證患者各50例及20例健康志愿者，空腹8 h后收集血清5 mL，采集核磁共振氫譜（1H-NMR），采用主成分分析法和偏最小二乘法判別分析的模式識(shí)別分析法進(jìn)行多元統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果 1H-NMR能識(shí)別的代謝物23種，KOA患者與健康志愿者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05，P<0.01）。KOA肝腎虧虛證患者軟骨基質(zhì)代謝、能量代謝、脂類代謝、疼痛及炎癥相關(guān)的代謝物與非肝腎虧虛證組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論 KOA肝腎虧虛證患者有獨(dú)特的1H-NMR代謝輪廓，KOA辨證分型具有代謝物質(zhì)基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：代謝組學(xué)；核磁共振氫譜；膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎；肝腎虧虛

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2017.06.007

中圖分類號(hào)：R274.94 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1005-5304（2017）06-0027-05

Abstract： Objective To study the endogenous metabolites of liver-kidney deficiency syndrome in knee-joint osteoarthritis （KOA） and explore the metabolic profile of KOA liver-kidney deficiency syndrome. Methods Totally 50 cases of KOA with liver-kidney deficiency syndrome and 50 cases of KOA with non-liver-kidney deficiency syndrome were collected respectively， and 20 cases of healthy volunteers were collected as the normal group. The serum samples of subjects were collected after fasting for 8 h. Hydro-Nuclear Magnetic Resonance （1H-NMR） spectrometer was collected. Principal component analysis and partial least squares discrimination analysis were used to conduct multivariate statistical analysis. Results 1H-NMR could identify 23 kinds of metabolites， and there was statistical significance between KOA patients and healthy volunteers （P<0.05， P<0.01）. There was statistical significance in cartilage matrix metabolism， energy metabolism， lipid metabolism， pain， inflammation-related metabolites in patients with KOA liver-kidney deficiency syndrome and patients with KOA non-liver-kidney deficiency syndrome （P<0.05）. Conclusion Patients with KOA liver-kidney deficiency syndrome have a unique 1H-NMR metabolic profile， KOA syndrome has a metabolic material basis.

Key words： metabolomics； 1H-NMR； knee-joint osteoarthritis； liver-kidney deficiency

膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎（knee-joint osteoarthritis，KOA）是一種以進(jìn)行性膝關(guān)節(jié)軟骨變性、破壞及骨質(zhì)增生為特征的中老年人的常見病和多發(fā)病，是引起膝關(guān)節(jié)疼痛甚至病殘的常見原因，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量和自理能力[1]。KOA屬中醫(yī)學(xué)“痹證”“骨痹”

等范疇，中醫(yī)治療KOA療效顯著[2-3]?！白C”是中醫(yī)辨證論治的起點(diǎn)和核心，但其理論的科學(xué)性一直缺乏有力的直接證據(jù)，這也是長期阻礙中醫(yī)學(xué)發(fā)展的難題[4]。近年來，基于核磁共振氫譜（1H-NMR）的代謝組學(xué)檢測方法為中醫(yī)證候客觀化研究提供了新的思路和手段[5]。本研究采用1H-NMR代謝組學(xué)檢測技術(shù)分析KOA肝腎虧虛證患者血清的代謝組學(xué)變化，尋找KOA肝腎虧虛證的代謝輪廓，為其“證”的本質(zhì)研究提供物質(zhì)基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取本院2014年1月-2016年3月KOA患者。肝腎虧虛證患者50例，其中男16例，女34例；年齡55～75歲，平均年齡（62.8±6.9）歲；病程最短3個(gè)月，最長20年，平均病程（3.9±3.1）年。非肝腎虧虛證患者50例，其中男15例，女35例；年齡55～75歲，平均年齡（62.7±8.6）歲；病程最短1個(gè)月，最長11年，平均病程（3.5±2.9）年。正常組選取本院門診體檢的健康志愿者20例，其中男7例，女13例，平均年齡（61.9±4.1）歲。3組性別、年齡、體質(zhì)指數(shù)（BMI）比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），具有可比性；非肝腎虧虛證組、肝腎虧虛證組病程、西安大略-麥克馬斯特（WOMAC）[6]評(píng)分比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），具有可比性，見表1。本研究經(jīng)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。endprint

1.2 西醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn)

采用2010年《骨關(guān)節(jié)炎診斷及治療指南》[7]KOA標(biāo)準(zhǔn)?；颊叻戏诸悩?biāo)準(zhǔn)（1）（2）均可。

（1）臨床標(biāo)準(zhǔn)：①近1個(gè)月大多數(shù)時(shí)間有膝關(guān)節(jié)疼痛；②有骨摩擦音；③晨僵時(shí)間≤30 min；④年齡≥38歲；⑤有骨性膨大。滿足①②③④或①②⑤或①④⑤即可診斷。

（2）臨床+放射學(xué)+實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)：①近1個(gè)月大多數(shù)時(shí)間有膝關(guān)節(jié)疼痛；②X線示骨贅形成；③關(guān)節(jié)液檢查符合骨性關(guān)節(jié)炎（OA）；④年齡≥40歲；⑤晨僵≤30 min；⑥有骨摩擦音。滿足①②或①③⑤⑥或①④⑤⑥即可診斷。

1.3 中醫(yī)辨證標(biāo)準(zhǔn)

采用《中藥新藥臨床研究指導(dǎo)原則（試行）》[8]及《中醫(yī)內(nèi)科常見疾病診療指南》[9]中肝腎虧虛證辨證標(biāo)準(zhǔn)。主癥：關(guān)節(jié)疼痛，腰膝酸軟，痿弱乏力。次癥：骨節(jié)肥大，活動(dòng)不利，運(yùn)動(dòng)牽強(qiáng)。舌質(zhì)淡紅，苔薄白，脈滑或弦。

1.4 納入標(biāo)準(zhǔn)

①年齡55～75歲；②患者符合上述西醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn)；③肝腎虧虛證組符合肝腎虧虛證辨證標(biāo)準(zhǔn)；④近4周未使用糖皮質(zhì)激素及近2周內(nèi)未用其他方法治療；⑤所有受試者均簽署知情同意書。

1.5 排除標(biāo)準(zhǔn)

①患有影響關(guān)節(jié)的疾病，如類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、銀屑病、代謝性骨病及急性創(chuàng)傷等；②合并心腦血管、肝、腎、造血系統(tǒng)及內(nèi)分泌系統(tǒng)等嚴(yán)重原發(fā)性疾?。虎劬癫』颊?。

2 方法

2.1 血清樣本收集與處理

患者及健康志愿者均空腹8 h，8：00-10：00空腹靜息狀態(tài)下采集靜脈血5 mL。3000 r/min離心10 min，收集血清于EP凍存管中，-80 ℃冰箱保存，備用。

2.2 檢測樣本制備

在1H-NMR檢測前，-80 ℃冰箱取出血清，梯度解凍。取300 ?L 血清置離心管中，加入0.2 mol/L磷酸鹽緩沖液（0.2 moL/L Na2HPO4/NaH2PO4，pH7.4）200 ?L，4 ℃、14 000×g離心10 min，取上清液，置于5 mm核磁管中，再加入100 ?L氘代重水，震蕩混勻，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 核磁共振氫譜數(shù)據(jù)采集與處理

使用Bruker UltraShield?500 MHz核磁共振波譜儀，采用Carr-Purcell-Meiboom-Gill自旋回波序列結(jié)合預(yù)飽和方法采集信號(hào)。自由感應(yīng)衰減（FID）采樣點(diǎn)為32 k，采集累加次數(shù)128，控制溫度在298 K。信號(hào)經(jīng)過32 k傅立葉變換轉(zhuǎn)為NMR圖譜。將圖譜文件夾導(dǎo)入MestReNova 10.0分析軟件進(jìn)行分析、積分，積分區(qū)間為δ 0.5～9.0，積分間隔0.004 ppm，為消除剩余水峰引起的影響，將δ 4.6～5.1區(qū)域設(shè)為零積分分段。對(duì)所產(chǎn)生的積分?jǐn)?shù)據(jù)進(jìn)行歸一化處理。

2.4 模式識(shí)別分析

將數(shù)據(jù)導(dǎo)入SIMCA-P12.0軟件進(jìn)行多元統(tǒng)計(jì)分析，進(jìn)行主成分分析（PCA）。為消除相關(guān)因素（如個(gè)體差異）對(duì)分組的影響，強(qiáng)化組間差異，進(jìn)一步采用正交信號(hào)校正處理，再行偏最小二乘法判別分析（PLS-DA）的模式識(shí)別分析。分析結(jié)果以得分圖表示，直觀給出各樣本分布。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料以 —x±s表示，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料組間比較采用卡方檢驗(yàn)。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 3組血清代謝物核磁共振氫譜圖譜

根據(jù)文獻(xiàn)[10]和人類代謝組數(shù)據(jù)庫信息（HMDB），結(jié)合二維譜圖對(duì)1H-NMR圖中進(jìn)行檢測的血清代謝物的核磁共振信號(hào)歸屬，能識(shí)別的代謝物共23種，見圖1。

3.2 3組血清代謝物主成分分析和偏最小二乘法判別分析

對(duì)各組血清代謝譜的數(shù)據(jù)進(jìn)行PCA和PLS-DA，見圖2。PCA積分圖（a）成分積分值主要集中分布于散點(diǎn)圖（95%置信區(qū)間）的3個(gè)區(qū)域，正常組和肝腎虧虛證組分布集中，非肝腎虧虛證組分布較為分散。PLS-DA積分圖（b）3組樣本在t[1]維能較好地分開，說明組間差異顯著。

為了進(jìn)一步說明各組代謝物的區(qū)別，找出分組貢獻(xiàn)較大的代謝物，將PCA和PLS-DA結(jié)果得到的代謝物經(jīng)內(nèi)標(biāo)校正的峰值面積歸一化進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，KOA患者軟骨基質(zhì)降解相關(guān)的代謝物纈氨酸、羥脯氨酸、N-乙?；肴樘前?、甘氨酸、組氨酸與正常組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05，P<0.01），肝腎虧虛證組低于非肝腎虧虛證組（P<0.05）；KOA患者能量相關(guān)的代謝物α-葡萄糖、β-葡萄糖、肌酸低于正常組（P<0.05，P<0.01），肝腎虧虛證組葡萄糖水平明顯低于非肝腎虧虛組（P<0.05），乳酸水平低于非肝腎虧虛證組（P<0.05），肌酸、丙酮酸明顯高于非肝腎虧虛證組（P<0.05）；KOA患者脂類代謝相關(guān)的代謝物脂質(zhì)、脂肪酸水平高于正常組（P<0.05，P<0.01），肝腎虧虛證組脂質(zhì)、脂肪酸水平低于非肝腎虧虛證組（P<0.05）；KOA患者疼痛、炎癥相關(guān)代謝物乳酸、丙氨酸、丙酮酸較正常組顯著升高（P<0.05，P<0.01），肝腎虧虛證組的γ-氨基丁酸、組氨酸水平低于非肝腎虧虛證組（P<0.05），L-色氨酸水平高于非肝腎虧虛證組（P<0.05）。結(jié)果見表2。

4 討論

“證”是對(duì)疾病發(fā)展過程中某一階段的病機(jī)概括，具有整體性和動(dòng)態(tài)性。代謝組學(xué)從微觀入手，系統(tǒng)研究機(jī)體在新陳代謝動(dòng)態(tài)進(jìn)程中所有代謝物的變化規(guī)律，二者的思路和研究方法具有趨同性。從系統(tǒng)生物學(xué)角度看，疾病是因蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)和基因調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)異常而致，而中醫(yī)的“證候”可能是由于這種異常所引發(fā)的一種特異性變化狀態(tài)，表現(xiàn)為體液中內(nèi)源性成分的變化，這一改變可以組、群、譜的特征出現(xiàn)[11]。本研究發(fā)現(xiàn)，3組血清樣本1H-NMR檢測的代謝圖譜差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。endprint

4.1 與軟骨基質(zhì)降解相關(guān)的代謝物變化

與軟骨基質(zhì)膠原和蛋白聚糖相關(guān)的代謝產(chǎn)物產(chǎn)生的氨基酸類物質(zhì)是患者體內(nèi)能檢測到的最大代謝物群，而且在OA的不同病理階段呈動(dòng)態(tài)變化[12]。本研究發(fā)現(xiàn)，KOA患者與基質(zhì)降解相關(guān)的甘氨酸和組氨酸較正常組高，而與基質(zhì)合成相關(guān)氨基酸（纈氨酸、羥脯氨酸等）減少。原因可能是本研究中KOA患者以早中期為主，此病理階段的軟骨基質(zhì)以降解為主，伴有基質(zhì)合成不足。N-乙酰基半乳糖胺是硫酸軟骨素相關(guān)的代謝產(chǎn)物，而硫酸軟骨素是關(guān)節(jié)軟骨基質(zhì)蛋白聚糖的重要成分之一，既往研究表明，N-乙?；肴樘前房勺鳛镺A疾病進(jìn)展的一個(gè)重要的生物標(biāo)志物[13]。肝腎虧虛證患者血清中甘氨酸、組氨酸、纈氨酸、羥脯氨酸、N-乙酰基半乳糖胺含量均低于非肝腎虧虛證患者，可能肝腎虧虛證患者處于KOA慢性期，病程較長，軟骨基質(zhì)的合成和降解低于非肝腎虧虛證患者。

4.2 與能量代謝相關(guān)的代謝物變化

OA病變過程中，機(jī)體啟動(dòng)自身調(diào)控機(jī)制代償性維持相關(guān)的修飾蛋白和膠原蛋白的形成，這些生化過程中需要額外能量，KOA患者α-葡萄糖、β-葡萄糖較正常人低[14]。本研究也發(fā)現(xiàn)KOA患者伴有α-葡萄糖、β-葡萄糖降低。肌酸在細(xì)胞能量代謝中起著舉足輕重的作用，其作為“ATP運(yùn)輸機(jī)”攜帶ATP到被利用的位點(diǎn)。退化的軟骨中低濃度的肌酸可能會(huì)干擾細(xì)胞能量代謝[15]。

在病理狀態(tài)下，由于機(jī)械壓力、氧化應(yīng)激等原因，關(guān)節(jié)組織中葡萄糖分解生成丙酮酸超過了三羧酸循環(huán)的氧化能力，剩余的丙酮酸在乳酸脫氫酶的作用下形成乳酸，導(dǎo)致組織中乳酸產(chǎn)生增加、積累，進(jìn)一步導(dǎo)致細(xì)胞凋亡或死亡。同時(shí)，也可導(dǎo)致關(guān)節(jié)在酸性環(huán)境下細(xì)胞基質(zhì)合成下降，基質(zhì)降解增加，進(jìn)一步加重軟骨退變[16]。本研究發(fā)現(xiàn)，患者血清中乳酸、丙氨酸、丙酮酸顯著高于正常組，提示KOA關(guān)節(jié)內(nèi)環(huán)境存在缺氧和酸中毒等內(nèi)環(huán)境紊亂狀態(tài)，這也是患者出現(xiàn)關(guān)節(jié)肌肉酸軟疼痛的原因之一。

肝腎虧虛證組葡萄糖、乳酸水平明顯低于非肝腎虧虛證組，而肌酸、丙酮酸明顯高于非肝腎虧虛證組，提示肝腎虧虛證患者能量代謝紊亂程度高，處于相對(duì)能量不足狀態(tài)，可導(dǎo)致氣血運(yùn)行不暢，“不通則痛”。這與肝腎虧虛證患者常伴有腰膝酸軟乏力等有關(guān)。

4.3 與脂類代謝相關(guān)的代謝物變化

目前研究發(fā)現(xiàn)，OA不是單一與衰老和生物學(xué)應(yīng)力相關(guān)的疾病，也與代謝紊亂多種因素相關(guān)，脂肪代謝參與疾病的起始和進(jìn)展，在OA軟骨細(xì)胞中有大量脂肪沉積[17]。本研究發(fā)現(xiàn)，在KOA患者血清中，其脂質(zhì)含量明顯高于正常組，其水解產(chǎn)物脂肪酸增加。脂肪酸在線粒體中β氧化生成的大量乙酰輔酶A，除氧化磷酸化提供能量外，也可合成酮體，包括乙酰乙酸、β-羥丁酸、丙酮。本研究中，KOA患者血清中丙酮含量高于正常組。肥胖是OA發(fā)病的危險(xiǎn)因素，可加重關(guān)節(jié)局部機(jī)械應(yīng)力，同時(shí)也與脂類代謝異常密切相關(guān)。肝腎虧虛證患者脂質(zhì)、脂肪酸水平低于非肝腎虧虛證患者，考慮與非肝腎虧虛證患者痰濁瘀滯證型與脂質(zhì)代謝異常更密切相關(guān)。

4.4 與疼痛、炎癥相關(guān)的代謝物變化

既往研究發(fā)現(xiàn)，在KOA患者的大腦前扣帶皮質(zhì)發(fā)現(xiàn)γ-氨基丁酸異常增多，提示其可作為KOA產(chǎn)生慢性關(guān)節(jié)疼痛潛在的代謝標(biāo)志物[18]。本研究發(fā)現(xiàn)，KOA患者的γ-氨基丁酸顯著高于正常組。同時(shí)，KOA患者血清中的乳酸、丙氨酸、丙酮酸明顯升高，這也是患者出現(xiàn)關(guān)節(jié)肌肉酸軟疼痛的原因之一。L-色氨酸在人類各種慢性炎癥性疾病中扮演重要角色，與OA關(guān)節(jié)慢性炎癥的微環(huán)境相關(guān)[19]。在OA患者中，在組氨酸脫羥酶的催化下，組氨酸促進(jìn)組織胺的合成，加劇關(guān)節(jié)軟骨的破壞和關(guān)節(jié)炎癥反應(yīng)。KOA炎癥相關(guān)代謝物的改變，也表明OA不僅是一種“磨損和撕裂”病變，同時(shí)也是慢性炎癥病變[20]。肝腎虧虛證患者的γ-氨基丁酸、組氨酸水平低于非肝腎虧虛證患者，而L-色氨酸水平高于非肝腎虧虛證患者，這也可能是肝腎虧虛證患者急性疼痛及急性炎癥較非肝腎虧虛證患者少，常呈慢性疼痛和慢性炎癥臨床表現(xiàn)的原因。

本結(jié)果表明，KOA肝腎虧虛證與非肝腎虧虛證的血清樣本中有多種代謝物含量存在明顯差異，利用PCA和PLS-DA模式識(shí)別分析法可將患者進(jìn)行較理想的區(qū)分，提示KOA辨證分型具有客觀存在的物質(zhì)基礎(chǔ)。這些內(nèi)源性代謝物與證候的相關(guān)性及其在證候發(fā)生機(jī)制中的作用有待于進(jìn)一步研究。

致謝：重慶大學(xué)化工學(xué)院熊燕教授對(duì)本研究予以大力支持和悉心指導(dǎo)，在此表示感謝！

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（收稿日期：2016-11-27）

（修回日期：2017-01-25；編輯：季巍?。〆ndprint