梁 軍 劉安民 葛洪醒 周 峰 金 濤 羅 丹

(荊門市第二人民醫(yī)院骨科，湖北 荊門 448000)

復方接骨中藥介導MAPK信號通路促進骨髓間充質干細胞增殖及成骨分化

梁 軍 劉安民 葛洪醒 周 峰 金 濤 羅 丹

(荊門市第二人民醫(yī)院骨科，湖北 荊門 448000)

目的 探討復方接骨中藥介導MAPK信號通路對骨髓間充質干細胞(BMSCs)增殖及成骨分化的促進作用。方法 取健康雄性SD大鼠60只，隨機平均分為實驗組和對照組，實驗組灌喂復方接骨中藥煎劑，對照組灌喂等體積自來水，處理10 d后提取各組大鼠血清。分離BMSCs，利用體積分數(shù)為0.1的含藥血清及非含藥血清單獨處理BMSCs 24、48、72 h及聯(lián)合10 μmol/L p38MAPK抑制劑SB203580處理BMSCs 72 h后，MTT檢測細胞增殖；RT-PCR及Western印跡檢測兩組血清單獨處理及聯(lián)合SB203580處理BMSCs 72 h后成骨細胞分化標記基因ALP、BGP、BMP-2的表達；Western印跡檢測兩組血清處理BMSCs 72 h p38蛋白表達及磷酸化。結果 含藥血清處理24、48 h，細胞OD值與非含藥血清組及對照組相比差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，第72小時含藥血清組細胞OD值顯著高于對照組及非含藥血清組(P<0.01)，非含藥血清組細胞OD值與對照組相比差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。兩組血清處理72 h后，含藥血清處理組ALP、BGP、BMP-2表達及p38磷酸化明顯高于對照組及非含藥血清組(P<0.01)，非含藥血清組ALP、BGP、BMP-2表達及p38磷酸化與對照組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，p38總蛋白表達三組差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。SB203580聯(lián)合兩組血清處理72 h后，非含藥血清+SB203580組與SB203580組細胞增殖及ALP、BGP、BMP-2表達差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，明顯低于對照組(P<0.01)，含藥血清+SB203580組細胞增殖及ALP、BGP、BMP-2表達顯著高于SB203580組(P<0.01)，與對照組差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。結論 復方接骨中藥可能通過促進MAPK信號通路促進BMSCs的增殖及成骨分化。

復方接骨中藥；骨髓間充質干細胞

間充質干細胞(MSCs)是存在于發(fā)育早期中胚層和外胚層的干細胞，骨髓MSCs(BMSCs)則是存在于骨髓的MSCs〔1〕。BMSCs具有多分化潛能，在個體發(fā)育成熟及組織修復過程中發(fā)揮重要作用〔2〕。研究發(fā)現(xiàn)，中藥許多組分體外對于BMSCs的增殖及分化具有促進作用〔3〕。本實驗所用藥方參照范紅旗等〔4〕的藥方成藥，具有補肝腎、強筋骨、活血止痛等作用，對骨折愈合具有促進作用。目前復方接骨中藥促進BMSCs增殖、分化的研究較少且機制不清。本研究通過中藥藥理學〔5〕方法獲得含藥血清作為藥物源，體外獲得BMSCs，研究復方接骨中藥對BMSCs增殖及成骨分化的影響，探討相關機制。

1 材料與方法

1.1 材料 雄性SD大鼠由武漢大學動物實驗中心提供。接骨中藥組方：厚樸10 g，大黃10 g，枳殼10 g，桃仁10 g，蘇木10 g，當歸10 g，紅花5 g，骨碎補15 g，川斷15 g，熟地15 g，自然銅10 g，龜板10 g，枸杞15 g，杜仲15 g。DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶購自美國Gibco；胎牛血清購自杭州四季青生物工程有限公司；蛋白酶裂解液、青鏈霉素雙抗購自上海碧云天生物技術有限公司；p38MAPK抑制劑SB203580購自美國Gene Operation；堿性磷酸酶(ALP)單抗、骨鈣素(BGP)單抗、骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)-2單抗、p38單抗、p-p38單抗、β-actin單抗、過氧化物酶標記的二抗購自美國Santa Cruz Biotech；噻唑藍(MTT)檢測試劑盒購自上海奧迪生物制品有限公司；PrimerScript反轉錄試劑盒購自大連寶生物工程有限公司；酶標儀購自美國Thermo；倒置顯微鏡購自德國Leica。

1.2 含藥血清的制備 選取60只3月齡、體重300～350 g的SD健康大鼠，隨機分為對照組和實驗組。復方中藥每天煎制后，按2.5 ml/只的量灌喂實驗組大鼠，對照組每天灌喂等量的自來水，連續(xù)灌喂10 d。末次灌喂前1 d大鼠禁食水，對大鼠進行麻醉后進行腹腔取血。大鼠腹部消毒后，打開腹腔，找到腹主動脈后進行穿刺取血，每只大鼠約取7～8 ml血，2 500 r/min離心30 min取上清。上清置于56℃水浴鍋中30 min使補體失活，過濾除菌后置于4℃保存。

1.3 BMSCs的分離及鑒定 取1只3月齡健康雄性SD大鼠，處死后置于75%乙醇中消毒15 min，超凈臺中取出大鼠的雙側股骨和脛骨，剪掉骨兩端使骨髓腔暴露出來，使用含10%胎牛血清的低糖DMEM培養(yǎng)基反復沖洗骨髓直至骨為白色，收集流出液到離心管中，1 000 r/min離心3 min，棄去上清液，使用5 ml含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基重懸沉淀，細胞懸液加到5 ml 1.073 g/ml的Percoll梯度液中，4℃、500 r/min離心30 min，取中間細胞層重懸于細胞培養(yǎng)液中，細胞接種于25 cm2培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5%的CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細胞融合度約達到80%時，0.25%胰酶消化后收集細胞，按1∶2接種至新鮮培養(yǎng)基中。取第4代細胞，胰酶消化后收集細胞，磷酸鹽緩沖液(PBS)重懸，并調整細胞濃度為1×106個/ml，分別加入CD29、CD45、CD11b/c、CD90抗體置于4℃避光孵育30 min，收集細胞，PBS清洗后，向沉淀中加入0.3 ml PBS重懸，流式細胞儀檢測。

1.4 MTT比色法檢測BMSCs增殖 取第4代對數(shù)生長期的BMSCs，胰酶消化后收集細胞，并調整細胞濃度為2×104個/ml，以每孔200 μl接種于96孔板中，置于細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，向含藥血清孔中加入體積分數(shù)為0.1含藥血清的DMEM培養(yǎng)基，非含藥血清孔加入體積分數(shù)為0.1的非含藥血清的DMEM培養(yǎng)基，分別培養(yǎng)24、48、72 h，含藥血清+SB203580組及非含藥血清+SB203580組預先加入10 μmol/L SB203580干預1 h后棄去培養(yǎng)基，分別加入體積分數(shù)為0.1的非含藥血清及0.1的含藥血清處理72 h，SB203580組加入10 μmol/L SB203580干預1 h后加入等體積PBS處理72 h，對照組不作處理，每個梯度設置6個復孔，同時設置空白對照組，培養(yǎng)完成后取出細胞，加入150 μl濃度為5 mg/ml的MTT溶液，置于細胞培養(yǎng)箱中孵育4 h后棄去上清液，加入100 μl二甲基亞砜(DMSO)震蕩培養(yǎng)10 min，晶體完全溶解后，酶標儀檢測490 nm處吸光值。

1.5 RT-PCR檢測ALP、BGP、BMP-2的表達 取處理后各組細胞，向細胞中加入1 ml Trizol，冰上靜置30 min，細胞中加入200 μl氯仿，震蕩15s后冰上靜置3 min，離心取上清液至新離心管中，加入等體積異丙醇，震蕩30 s后-20℃放置30 min，離心取沉淀，加入1 ml無水乙醇漂洗2次，待沉淀晾干后加入20 μl無酶水溶解，微量核酸儀檢測RNA濃度。利用PrimerScript反轉錄試劑盒將RNA反轉錄成cDNA，按照熒光定量試劑盒說明配制反應體系，置于定量PCR儀檢測，并分析mRNA的相對表達水平。

1.6 Western印跡檢測細胞中蛋白表達 取處理72 h的各組細胞，離心收集沉淀，加入細胞裂解液冰上孵育30 min，離心收集上清轉移至新的離心管中，二喹啉甲酸(BCA)法檢測蛋白濃度，制備蛋白樣品，樣品蛋白含量一致。配制蛋白膠，蛋白膠凝固后上樣，電壓80 V電泳30 min，120 V繼續(xù)電泳直至溴酚藍跑出蛋白膠。取出蛋白膠冰浴轉膜，取出聚偏氟乙烯(PVDF)膜加入5%脫脂奶粉室溫孵育3 h，分別加入ALP單抗、BGP單抗、BMP-2單抗、p38單抗、p-p38單抗作為一抗4℃孵育過夜，Tris鹽酸緩沖液(TBST)清洗后加入二抗室溫孵育1 h，TBST清洗，加入化學增強發(fā)光法(ECL)發(fā)光劑顯影5 min后利用自動凝膠成像系統(tǒng)采集圖像。

1.7 統(tǒng)計學方法 應用SPSS21.0軟件行t檢驗，使用GraphPad Prism 5統(tǒng)計軟件繪圖。

2 結 果

2.1 含藥血清對BMSCs增殖的影響 非含藥血清組與對照組細胞OD值差異不大(P>0.05)，第24小時和第48小時含藥血清組OD值與對照組相比差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，72 h時含藥血清組細胞OD值明顯高于對照組及非含藥血清組(P<0.01)。說明復方接骨中藥促進BMSCs增殖。見圖1。

2.2 含藥血清對成骨分化的影響 mRNA表達統(tǒng)計時將對照組ALP、BGP、BMP-2 mRNA的表達均設為1，蛋白表達統(tǒng)計時設內參蛋白β-actin的表達為1。非含藥血清組ALP、BGP、BMP-2的mRNA表達分別為(1.052±0.123)、(1.074±0.123)、(1.101±0.172)，含藥血清組分別為(1.825±0.112)、(2.362±0.153)、(1.413±0.135);對照組ALP、BGP、BMP-2的蛋白表達分別為(0.223±0.015)、(0.329±0.021)、(0.162±0.008)，非含藥血清組分別為(0.227±0.016)、(0.334±0.022)、(0.169±0.009)，含藥血清組分別為(0.398±0.019)、(0.683±0.024)、(0.262±0.016)，非含藥血清組ALP、BGP、BMP-2的表達與對照組相比差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，含藥血清組三者mRNA及蛋白的表達均明顯升高，與對照組及非含藥血清組相比差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。見圖2。

2.3 含藥血清對p38蛋白磷酸化的影響 將內參蛋白β-actin的表達設為1。對照組p38、p-p38蛋白表達分別為(0.524±0.023)、(0.167±0.014)，非含藥血清組分別為(0.527±0.025)、(0.170±0.016)，含藥血清組分別為(0.529±0.026)、(0.318±0.017)，非含藥血清組與對照組相比未出現(xiàn)顯著性變化(P>0.05)，含藥血清組p38總蛋白表達與對照組相比無明顯變化(P>0.05)；p-p38蛋白表達明顯升高，顯著高于對照組及非含藥血清組(P<0.01)。見圖3。

2.4 p38MAPK抑制劑聯(lián)合血清作用對p38蛋白表達及磷酸化的影響 設內參蛋白β-actin的表達為1，對照組p38、p-p38蛋白表達分別為(0.518±0.028)、(0.182±0.026)，SB203580組為(0.516±0.027)、(0.104±0.018)，非含藥血清組+SB203580組分別為(0.520±0.029)、(0.108±0.016)，含藥血清組+SB203580組分別為(0.521±0.031)、(0.175±0.014)，4組細胞中p38總蛋白表達差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；非含藥血清+SB203580組和SB203580組p-p38的表達未出現(xiàn)顯著差異(P>0.05)，與對照組相比顯著降低(P<0.01)，含藥血清組p-p38的表達與對照組差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，顯著高于SB203580組(P<0.01)。見圖4。

與對照組相比：1)P<0.01；與非含藥血清組相比：2)P<0.01圖1 兩組血清對BMSCs增殖的影響

圖2 兩組血清對ALP、BGP、BMP-2表達的影響

圖3 兩組血清對p38蛋白表達及磷酸化的影響

2.5 p38MAPK抑制劑聯(lián)合血清作用對BMSCs增殖的影響 對照組、SB203580組、非含藥血清組+SB203580組、含藥血清組+SB203580組OD值分別為(0.118±0.014)、(0.061±0.012)、(0.069±0.011)、(0.102±0.009)，非含藥血清+SB203580組與SB203580組細胞OD值差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，明顯低于對照組(P<0.01)，含藥血清+SB203580組細胞OD值顯著高于SB203580組(P<0.01)，與對照組差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

2.6 p38MAPK抑制劑聯(lián)合血清作用對成骨分化的影響 SB203580組ALP、BGP、BMP-2 的mRNA表分別為(0.428±0.032)、(0.397±0.027)、(0.221±0.018)，非含藥血清組+SB203580組ALP、BGP、BMP-2 mRNA分別為(0.436±0.033)、(0.408±0.026)、(0.230±0.017)，含藥血清組+SB203580組分別為(0.973±0.054)、(0.962±0.048)、(0.592±0.037)；對照組ALP、BGP、BMP-2 的蛋白表達分別為(0.322±0.021)、(0.454±0.032)、(0.215±0.020)，SB203580組分別為( 0.218±0.019)、( 0.234±0.026)、(0.112±0.015)，非含藥血清組+SB203580組分別為(0.220±0.021)、(0.239±0.028)、(0.115±0.016)，含藥血清組+SB203580組分別為(0.317±0.023)、(0.441±0.035)、(0.210±0.020)，非含藥血清+SB203580組與SB203580組細胞ALP、BGP、BMP-2 mRNA及蛋白表達差異無統(tǒng)計學差異(P>0.05)，明顯低于對照組(P<0.01)，含藥血清+SB203580組細胞三種基因表達顯著高于SB203580組(P<0.01)，與對照組差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見圖5。

1：對照組；2：SB203580組；3：非含藥血清+SB203580組；4：含藥血清+SB203580組；下圖同圖4 p38MAPK抑制劑聯(lián)合血清作用對p38蛋白表達及磷酸化的影響

圖5 p38MAPK抑制劑聯(lián)合血清作用對成骨分化的影響

3 討 論

研究發(fā)現(xiàn)成人MBSCs仍具有分化能力，在適宜的條件下能分化成骨相關的結締組織，證實MBSCs具有成骨能力〔6〕。ALP是成骨細胞分化所必需的酶，是成骨細胞分化的早期標志物〔7〕。ALP通過水解有機酸酯為游離的磷酸根，而且能通過破壞鈣化抑制劑啟動鈣化的發(fā)生〔8〕。ALP的活性標志著成骨細胞的分化程度。BGP是由成熟的成骨細胞分泌的一種多肽，是成骨細胞分化的中期標志物〔9〕。BGP含量的高低與成骨細胞的分化程度正相關。大量研究證實，BGP含量增高促進成骨細胞分化。BMP-2也是成骨細胞分化的檢測指標，其含量的高低與成骨細胞的分化程度密切相關〔10〕。BMP-2的表達對成骨細胞的增殖以及分化具有促進作用〔11〕。本研究結果說明復方接骨中藥能促進MBSCs向成骨細胞分化。MAPK是一類絲氨酸/蘇氨酸激酶，對細胞的生長、分化、炎癥反應等具有調節(jié)作用〔12〕。MAPK信號通路包括ERK1/2、p38等，活化的MAPK通過級聯(lián)反應將外界信號傳遞給細胞核，通過作用于AIF-2、c-Myc等轉錄因子，調節(jié)與細胞增殖、分化相關的基因表達〔13〕。有報道稱p38MAPK信號通路對成骨細胞的分化具有促進作用，p38蛋白的磷酸化是該通路被激活的重要過程〔14〕。本研究結果顯示，復方接骨中藥血清對p38的磷酸化具有促進作用，提示該中藥可能通過活化p38MAPK信號通路促進MBSCs的增殖及成骨分化。蛋白酶抑制劑具有抑制蛋白激酶活性的能力，SB203580是p38MAPK的常用抑制劑，能夠透過細胞抑制p38蛋白磷酸化，進而抑制后續(xù)的級聯(lián)反應，研究發(fā)現(xiàn)SB203580可以有效抑制細胞中一些炎癥因子誘導的信號轉導途徑〔15〕。本研究證實復方接骨中藥通過作用于p38MAPK信號通路，使p38蛋白磷酸化增強，進而促進該信號通路的活化，促進MBSCs的增殖及成骨分化。

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〔2016-10-24修回〕

(編輯 袁左鳴)

湖北省自然科學基金項目(No.2004ABA208)

羅 丹(1978-)，女，副主任醫(yī)師，主要從事骨疾病研究。

梁 軍(1969-)，男，副主任醫(yī)師，主要從事骨疾病研究。

R681

A

1005-9202(2017)10-2360-04；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.10.007