譚龍春 趙 亮 鄧成敏 劉仙紅 官志忠,

(貴州醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)重點實驗室，貴州 貴陽 550004)

洛伐他汀上調(diào)體外培養(yǎng)神經(jīng)細胞毒蕈堿型乙酰膽堿受體及對抗β-淀粉樣肽對該受體表達的抑制作用

譚龍春1趙 亮2鄧成敏1劉仙紅3官志忠1,3

(貴州醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)重點實驗室，貴州 貴陽 550004)

目的 觀察洛伐他汀是否對毒蕈堿型乙酰膽堿受體(mAChRs)有上調(diào)作用，探討其是否具有抗β-淀粉樣肽(Aβ)的作用。方法 選擇原代培養(yǎng)的大鼠海馬神經(jīng)細胞和SH-SY5Y細胞，采用洛伐他汀和Aβ寡聚體(AβOs)分別或聯(lián)合處理培養(yǎng)細胞24～48 h后，采用蛋白印跡法和實時熒光定量PCR(Real-time PCR)檢測細胞中M1 mAChR和M3 mAChR蛋白及mRNA表達水平。結(jié)果 免疫熒光染色顯示原代大鼠海馬神經(jīng)細胞的體外培養(yǎng)純度達85%以上;不同濃度洛伐他汀處理神經(jīng)細胞24 h后，M1 mAChR和M3 mAChR蛋白及mRNA表達水平均明顯高于對照組(P<0.05)；0.5 μmol/L AβOs處理神經(jīng)細胞48 h后，其M1 mAChR和M3 mAChR蛋白及mRNA表達水平均明顯下降(P<0.05)；但預(yù)先用0.1 μmol/L洛伐他汀處理神經(jīng)細胞24 h，可減輕AβOs導(dǎo)致的M1 mAChR和M3 mAChR表達水平下降。結(jié)論 洛伐他汀可能具有上調(diào)mAChRs表達水平的作用，對抗Aβ對該受體的作用。

洛伐他汀；毒蕈堿型乙酰膽堿受體；β淀粉樣肽

阿爾茨海默病(AD)主要的病理學(xué)特征是β-淀粉樣肽(Aβ)沉積形成的老年斑(SPs) 和tau蛋白過度磷酸化形成的神經(jīng)原纖維纏結(jié)(NFTs)〔1〕，Aβ沉積和tau蛋白過度磷酸化也是導(dǎo)致神經(jīng)元功能障礙的兩個原因〔2〕。解剖學(xué)研究顯示，AD患者基底前腦的膽堿能神經(jīng)元特異性減少〔3〕。毒蕈堿型乙酰膽堿受體(mAChRs，簡稱M受體)屬于膽堿能神經(jīng)遞質(zhì)性受體，參與認知功能的調(diào)節(jié)，與AD的發(fā)生密切相關(guān)〔4,5〕。Aβ可引起膽堿能神經(jīng)系統(tǒng)損害，其機制主要有：抑制神經(jīng)內(nèi)源性乙酰膽堿(Ach)的釋放和細胞對高親和力膽堿的攝取，損害M受體與G蛋白的耦聯(lián)，阻斷M受體激動后的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，使AChE降解速度減慢〔6〕。他汀類藥物是膽固醇合成限速酶羥甲基戊二酸單酰輔酶A還原酶(HMG-CoA)抑制劑，能抑制膽固醇的合成，降低Aβ的生成〔7,8〕。本課題組之前的研究顯示，低濃度的洛伐他汀處理SH-SY5Y細胞和星形膠質(zhì)細胞，可上調(diào)α7 nAChR的表達〔9～11〕，但洛伐他汀是否也能上調(diào)mAChRs的表達并不清楚。本研究擬進一步分析洛伐他汀對抗Aβ的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物及細胞 Sprague Dawley(SD)大鼠新生仔鼠(新生24 h 內(nèi))，由貴州醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供，獲得貴州醫(yī)科大學(xué)倫理委員會批準進行實驗(No.1311018)。原代大鼠海馬神經(jīng)細胞和人神經(jīng)母細胞瘤細胞SH-SY5Y(由課題組保存)。

1.1.2 主要試劑 洛伐他汀、多聚賴氨酸、Aβ1～42購自Sigma公司(美國)；胎牛血清、Neurobasal-A 培養(yǎng)基、Hibernate-A培養(yǎng)基、B-27 添加劑、GlutaMAX添加劑購自Gibco公司(美國)；DMEM-F12培養(yǎng)基、0.25%胰蛋白酶、青霉素及鏈霉素購自Hyclone公司(上海)；BCA蛋白定量試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、Trizol試劑、CY-3標記的羊抗小鼠IgG抗體和488標記的羊抗兔IgG抗體購自Thermo公司(美國)；SYBR green master 購自Roche公司(瑞典)；CCK-8試劑盒購自Dojindo公司(日本)；裂解液、RIPA、5倍蛋白上樣緩沖液、SDS-PAGE 凝膠配制試劑盒、顯影定影試劑盒購自碧云天生物技術(shù)公司(上海)；山羊血清購自中杉金橋生物技術(shù)有限公司(北京)；M1 mAChR、M3 mAChR和β-actin引物序列購自生工公司(上海)；兔抗GFAP抗體購自Dako(丹麥)；鼠抗NeuN抗體、ECL試劑盒購自Millpore(美國)；兔抗M1 mAChR、M3 mAChR抗體購自Santa Cruz公司(美國)；兔抗β-actin購自Abmart公司(上海)；辣根過氧化物酶(HRP)標記的抗兔二抗購自Cell Signaling(美國)。

1.2 方法

1.2.1 原代大鼠海馬神經(jīng)細胞的培養(yǎng) 原代大鼠海馬神經(jīng)細胞培養(yǎng)參考Nunez〔12〕的方法，并根據(jù)實驗室具體情況做了適當改動。新生SD乳鼠數(shù)只，75%酒精浸泡5 min，無菌條件下取頭部，取出大腦，放入預(yù)冷的Hibernate-A培養(yǎng)基中，分離海馬，并去除腦膜及血管。海馬以D-Hank緩沖鹽液清洗3次后，加入0.25% 胰蛋白酶37℃消化15 min，期間振搖3次；用含10%胎牛血清的DMEM-F12培養(yǎng)基終止消化1 min，棄培養(yǎng)基，D-Hank平衡鹽液洗2次；加入2 ml含2%B27的Neurobasal-A完全培養(yǎng)基(含Neurobasal-A培養(yǎng)基、2%B27、1%GlutaMAX添加劑、100 U/ml青霉素及100 mg/ml鏈霉素)，輕輕吹打細胞，避免產(chǎn)生氣泡，自然沉淀后取上清；再加入 2 ml含2%B27的Neurobasal完全培養(yǎng)基，重復(fù)上述操作2次，得到細胞懸液，再用70 μm的濾網(wǎng)將細胞懸液過濾。吸取過濾后的細胞懸液，進行細胞計數(shù)。計數(shù)后用含2% B27的Neurobasal-A完全培養(yǎng)基稀釋細胞，以5×105個/ml密度接種在經(jīng)左旋賴氨酸(PLL)包被(用濾過除菌的0.01 mg/ml多聚賴氨酸室溫包被過夜，PBS洗3次，晾干備用)過的6孔板內(nèi),于37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每隔3 d以含2%B27的Neurobasal-A完全培養(yǎng)基半量換液。

1.2.2 原代大鼠海馬神經(jīng)細胞的鑒定 神經(jīng)細胞培養(yǎng)至第7天時，棄培養(yǎng)液，加入PBS洗2次×3 min。每孔加入1 ml預(yù)冷4%多聚甲醛室溫固定20 min，棄多聚甲醛，PBS洗3次×5 min，室溫晾干；0.5%Triton X-100室溫透膜處理20 min，PBS洗3次×5 min，晾干；10%山羊血清室溫封閉30 min，棄山羊血清，每孔加500 μl PBS稀釋一抗，含有小鼠抗NeuN抗體(1∶50)及兔抗GFAP抗體(1∶200)，陰性對照以PBS代替一抗，4℃過夜。吸出一抗，PBS洗3次×2 min，每孔加500 μl稀釋二抗，含有Cy3(紅光)標記抗小鼠IgG和488(綠光)標記抗兔IgG，室溫避光孵育1 h，PBS洗2次×5 min；置于熒光倒置顯微鏡下觀察，采集圖片，計數(shù)10個視野內(nèi)NeuN陽性及GFAP陽性細胞個數(shù)，計算神經(jīng)細胞的純度。

1.2.3 SH-SY5Y細胞的培養(yǎng) 從液氮罐中取出凍存的SH-SY5Y細胞，快速放入37℃水浴箱中搖動1～2 min使其快速融化，迅速轉(zhuǎn)入含10 ml培養(yǎng)液的15 ml離心管中，1 000 r/min離心5 min，棄上清，加入含有10%胎牛血清和1%雙抗(青霉素100 U/ml，鏈霉素100 U/ml)的DMEM高糖培養(yǎng)基，用滴管輕輕吹打，使細胞重懸，然后把細胞懸液轉(zhuǎn)入底面積為25 cm2(T25)的細胞培養(yǎng)瓶中，并放入37℃ 、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當細胞貼壁生長到80%后用0.25%胰蛋白酶消化傳代。另外，可用細胞凍存液(90%胎牛血清，10%DMSO，現(xiàn)用現(xiàn)配)凍存細胞，然后將凍存細胞置于細胞梯度凍存盒內(nèi)，放至-80℃過夜，次日轉(zhuǎn)入-196℃液氮中保存。

1.2.4 細胞活性實驗 采用CCK-8法檢測細胞活性。原代培養(yǎng)神經(jīng)細胞及SH-SY5Y細胞分別以1×105個/ml2濃度接種于96孔板中，不同濃度藥物處理細胞，每個濃度設(shè)5個復(fù)孔，每孔加100 μl細胞懸液；培養(yǎng)至計劃時間后，將每孔原始培養(yǎng)基取出，置換為不含血清及藥物的純培養(yǎng)基100 μl，空白對照組加入100 μl無細胞純培養(yǎng)基，于每孔中加入10 μl CCK-8試劑，37℃孵育2 h，450 nm波長測定吸光度。

1.2.5 洛伐他汀處理細胞 SH-SY5Y細胞于6孔板中培養(yǎng)，生長至80%～90%，更換成無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)12 h。原代大鼠海馬神經(jīng)細胞培養(yǎng)至第10天，棄B27培養(yǎng)2 h，分別加入不同濃度洛伐他汀(0.01 μmol/L和0.1 μmol/L)處理，24 h后加入0.5 μmol/L Aβ寡聚體(AβOs)；48 h后收集細胞，強效裂解液提取細胞總蛋白，BCA法進行蛋白定量。

1.2.6 蛋白印跡法檢測M1 mAChR和M3 mAChR蛋白表達水平 經(jīng)10%聚丙烯酰胺凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉后，分別用抗M1 mAChR(1∶1 000)、抗M3 mAChR(1∶1 000)抗體室溫孵育1 h后4℃過夜。再加入HRP標記的抗兔二抗(1∶5 000)，室溫振搖孵育1 h。將膜與ECL試劑反應(yīng)后膠片曝光，所得膠片用掃描儀掃描，Image J軟件分析結(jié)果。以β-actin蛋白條帶灰度值作為內(nèi)參，以目的蛋白和β-actin蛋白條帶灰度值的比值進行校準，計算實驗組與對照組相對蛋白表達水平差異。

1.2.7 實時熒光定量PCR(Real-time PCR)檢測M1 mAChR、M3 mAChR mRNA表達水平 采用一步法提取細胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，再以cDNA為模板進行Real-time PCR。M1 mAChs、M3 mAChR及β-actin引物序列見表1。分析結(jié)果時以β-actin為內(nèi)參照，應(yīng)用RQ值(RQ=2-ΔΔCT)計算M1 mAChR、M3 mAChR基因在實驗組與對照組的相對表達水平。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS13.0軟件行單因素方差分析(One-Way ANOVA)；進一步多重比較，方差齊性采用LSD-t檢驗，方差不齊采用DunnettT3分析。

2 結(jié) 果

2.1 原代大鼠海馬神經(jīng)細胞純度鑒定 相差顯微鏡下原代大鼠海馬神經(jīng)細胞(圖1)，經(jīng)NeuN和GFAP免疫熒光雙染后，可見NeuN陽性細胞，即神經(jīng)細胞，激發(fā)后細胞核顯紅色熒光(圖1)；GFAP陽性細胞，即星形膠質(zhì)細胞，激發(fā)后，胞質(zhì)顯綠色熒光，胞核無色透明(圖1)；未加抗體的陰性對照未觀察到熒光(圖1)。計數(shù)統(tǒng)計后，神經(jīng)細胞純度達到85%以上。

2.2 洛伐他汀細胞活性試驗 1 μmol/L洛伐他汀作用于原代大鼠海馬神經(jīng)細胞及SH-SY5Y細胞24 h，可見細胞存活率顯著低于對照組(設(shè)為100)(P<0.01)。所以在后面的研究中，選擇0.01 μmol/L和0.1 μmol/L洛伐他汀，該濃度不影響細胞的存活率。見圖2。

2.3 AβOs細胞毒性試驗 0.5 μmol/L AβOs作用于原代大鼠海馬神經(jīng)細胞及SH-SY5Y細胞48 h，可見細胞存活率(設(shè)為100)顯著低于對照組(P<0.01)。故在后面的研究中，選擇0.5 μmol/L AβOs處理細胞。見圖3。

2.4 洛伐他汀對M1 mAChR和M3 mAChR蛋白表達水平的影響 0.01和0.1 μmol/L洛伐他汀作用于原代大鼠海馬神經(jīng)細胞和SH-SY5Y細胞24 h后，M1 mAChR和M3 mAChR蛋白表達水平均明顯高于對照組(P<0.05)，見圖4，表2。

圖1 原代大鼠海馬神經(jīng)細胞免疫熒光染色(×200)

2.5 洛伐他汀對抗AβOs對M1、M3 mAChR蛋白表達水平的影響 0.5 μmol/L AβOs處理原代大鼠海馬神經(jīng)細胞和SH-SY5Y細胞48 h，與對照組相比，M1 mAChR及M3 mAChR蛋白表達水平均明顯下降(P<0.05)；用0.1 μmol/L洛伐他汀預(yù)處理原代大鼠海馬神經(jīng)細胞和SH-SY5Y細胞24 h，可減輕AβOs導(dǎo)致的mAChRs蛋白表達水平下降。見圖5，表3。

2.6 洛伐他汀對M1 mAChR及M3 mAChR mRNA表達水平的影響 0.01和0.1 μmol/L洛伐他汀作用于原代大鼠海馬神經(jīng)細胞24 h后，M1 mAChR及M3 mAChR mRNA表達水平均明顯高于對照組(P<0.05)。見表4。

2.7 洛伐他汀對抗AβOs對M1 mAChR及M3 mAChR mRNA表達水平的影響 0.5 μmol/L AβOs處理原代大鼠海馬神經(jīng)細胞48 h，與對照組相比，M1 mAChR、M3 mAChR mRNA表達水平明顯下降(P<0.05)；用0.1 μmol/L洛伐他汀預(yù)處理原代大鼠海馬神經(jīng)細胞，可減輕AβOs導(dǎo)致的M1 mAChR、M3 mAChR mRNA表達水平下降。見表5。

圖2 不用濃度洛伐他汀對原代大鼠海馬神經(jīng)細胞及SH-SY5Y細胞存活率的影響

圖3 不用濃度AβOs對原代大鼠海馬神經(jīng)細胞及SH-SY5Y細胞存活率的影響

1、2、3分別為洛伐他汀0、0.01、0.1 μmol/L組圖4 洛伐他汀對M受體蛋白表達水平的影響

組別SHSY5Y細胞M1mAchRM3mAchR原代海馬神經(jīng)細胞M1mAchRM3mAchR0μmol/L組100．00±4．17100．00±11．68100．00±15．0099．99±7．230．01μmol/L組114．93±4．661)146．07±3．111)154．01±31．231)161．80±9．691)0．1μmol/L組112．55±4．911)140．56±3．971)149．25±28．681)180．67±7．681)

與0 μmol/L組比較：1)P<0.05

表3 洛伐他汀對抗AβOs對SHSY5Y細胞及原代海馬神經(jīng)細胞中M1、M3 mAChR蛋白表達水平的影響±s)

與0 μmol/L組比較：1)P<0.05；與Aβ組比較：2)P<0.05

1：0 μmol/L洛伐他汀組；2：0.1 μmol/L洛伐他汀組；3：Aβ組；4：0.1 μmol/L洛伐他汀+Aβ組圖5 洛伐他汀對抗AβOs對M受體蛋白表達水平的影響

組別M1mAchRM3mAchR0μmol/L組100．44±11．45100．31±9．790．01μmol/L組202．96±21．931)172．75±12．591)0．1μmol/L組205．22±19．931)178．45±10．781)

與0 μmol/L組比較：1)P<0.05

表5 洛伐他汀對抗AβOs對原代海馬神經(jīng)細胞M1、M3 mAChR mRNA表達水平的影響

與0 μmol/L組比較：1)P<0.05；與Aβ組比較：2)P<0.05

3 討 論

他汀類藥物作為一種降脂藥，廣泛用于降低血液中膽固醇水平；除此之外，他汀類藥物也被認為是治療和預(yù)防AD的潛在藥物〔13〕。流行病學(xué)研究顯示，服用他汀類藥物治療高血壓和心臟病的老年人，癡呆和認知損害的發(fā)生率低于未服藥人群，他汀類藥物能夠降低AD的發(fā)病風險〔14〕。動物模型研究顯示，他汀類藥物預(yù)防AD中作用機制可能包括減少Aβ〔15〕、β-位點APP切割酶(BACE1)水平及氧化應(yīng)激〔16，17〕。

對于AD早期患者，連續(xù)1年給予膽堿酯酶抑制劑后發(fā)現(xiàn)，患者腦內(nèi)的海馬萎縮速率減半，表明膽堿能系統(tǒng)與神經(jīng)退行性疾病關(guān)系密切〔18〕。影像學(xué)顯示膽堿功能障礙與AD的病理過程及認知障礙有關(guān)〔19，20〕。長期使用抗膽堿能藥物，特別是抗毒蕈堿藥物，可以顯著增加癡呆的發(fā)病風險〔21〕。G蛋白耦聯(lián)受體能夠調(diào)節(jié)與APP代謝有關(guān)的3種分泌酶的活性，從而調(diào)節(jié)APP代謝，影響Aβ生成；同時，Aβ通過負反饋機制也可以調(diào)節(jié)G蛋白耦聯(lián)受體的活性〔22〕。mAChRs 屬于G蛋白耦聯(lián)受體，與膽堿功能失調(diào)、Aβ和Tau神經(jīng)病理學(xué)等密切相關(guān)，選擇性激活M1受體可延緩AD的發(fā)生和進展〔23〕。文獻報道M1 mAChR與SPs和過度磷酸化的Tau蛋白的積累有關(guān)聯(lián)〔24〕。此外，M1 mAChR陽性變構(gòu)調(diào)節(jié)劑可以改善由于膽堿功能障礙引起的AD患者認知缺陷〔25〕。由于M1 mAChR與AD的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，所以它被認為是AD治療中的關(guān)鍵靶點。本實驗發(fā)現(xiàn)洛伐他汀可顯著提高M1 mAChR和M3 mAChR的蛋白及mRNA表達水平，提示洛伐他汀可刺激mAChRs的表達。上調(diào)mAChRs表達水平可改善AD患者的認知功能，對抗細胞凋亡，起到神經(jīng)保護作用，同時也減少Aβ產(chǎn)生和tau蛋白過度磷酸化，從而延緩AD病程〔26,27〕。

Aβ是AD患者神經(jīng)元細胞外淀粉樣斑塊的主要成分，是由APP經(jīng)分泌酶剪切產(chǎn)生的一系列包括39～43個氨基酸的短肽，主要是Aβ40和Aβ42，其中Aβ42聚集性最強，有很強的神經(jīng)毒性〔28〕。少量的Aβ能保護腦細胞，促進神經(jīng)元的生長，但是過量的Aβ則會對神經(jīng)元產(chǎn)生毒性，引起AD等神經(jīng)性疾病的發(fā)生〔29〕。細胞內(nèi)的Ca2+對細胞功能有極重要的作用，它是重要的細胞內(nèi)第二信使，調(diào)節(jié)許多細胞反應(yīng)和活動，參與神經(jīng)遞質(zhì)釋放、突觸的可塑性等。Aβ可以增加細胞內(nèi)Ca2+濃度，損害線粒體功能和細胞骨架，導(dǎo)致細胞損傷〔29〕。此外，Aβ可引起炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致突觸功能障礙和神經(jīng)毒性作用，最終導(dǎo)致神經(jīng)元變性或死亡〔30,31〕。這些研究均表明，Aβ可降低M1 mAChR、M3 mAChR蛋白和mRNA的表達水平。M1 mAChR、M3 mAChR表達減少，其與G蛋白的耦聯(lián)作用和介導(dǎo)生成第二信使的能力下降，鈣離子內(nèi)流減少，抑制了神經(jīng)遞質(zhì)的釋放，進一步導(dǎo)致學(xué)習記憶能力減弱。此外，Aβ引起的膽堿能功能下降可減少APP營養(yǎng)分泌，增加Aβ分泌，影響M1受體的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，抑制乙酰膽堿的合成和釋放，進一步加劇了膽堿能缺乏〔32〕。而且洛伐他汀對于Aβ引起的M1 mAChR、M3 mAChR表達下降有緩解作用。綜上所述，洛伐他汀可能具有上調(diào)mAChRs對抗Aβ的作用，這對尋找治療AD的藥物靶點提供了一定的理論依據(jù)。

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〔2016-11-19修回〕

(編輯 曲 莉)

Lovastatin may up-regulate expression of muscarinic acetylcholine receptors and against the neurotoxicity of β-amyloid peptide on the receptors

TAN Long-Chun,ZHAO Liang,DENG Cheng-Min,etal.

The Key Laboratory of Molecular Biology,Guizhou Medical University,Guiyang 550004,Guizhou,China

Objective To investigate the influence of lovastatin on muscarinic acetylcholine receptors (mAChRs),and reveal whether the drug attenuate the inhibited effect of -amyloid peptide (Aβ) on the receptors.Methods The primary cultured rat hippocampal neurons and SH-SY5Y cells were exposed to lovastatin and Ab oligomers (AβOs) with alone or both treatments for 24～48 h. The protein levels of M1 and M3 mAChR were examined by Western blot,and the mRNA levels were tested by Real-time PCR.Results The purity of primary cultured rat hippocampal neurons was over 85%;by exposures of different concentrations of lovastatin for 24 h,the protein and mRNA levels of M1 and M3 mAChR were higher than those of control group,respectively (P<0.05);as compared with those of control group,the protein and mRNA levels of M1 and M3 mAChR were obviously decreased in the treatment with 0.5 μmol/L AβOs for 48 h (P<0.05); while the cells were pretreated with 0.1 μmol/L lovastatin for 24 h before the treatments by AβOs,the decreased protein and mRNA levels of M1 and M3 mAChR were all alleviated.Conclusions Lovastatin might up-regulate expression of mAChRs and attenuate the inhibited effect of Aβ on the receptors.

Lovastatin;Muscarinic acetylcholine receptors;β-amyloid peptide

國家自然科學(xué)基金( 81260173)；教育部“長江學(xué)者和創(chuàng)新團隊發(fā)展計劃資助”(IRT13058)；貴州省科技計劃(黔科合重大專項字〔2014〕6008號)；貴州省創(chuàng)新計劃項目(黔教合協(xié)同創(chuàng)新中心〔2014〕06)

官志忠(1951-)，男，博士，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事阿爾茨海默病分子神經(jīng)病理學(xué)研究。

譚龍春(1990-)，女，在讀碩士，主要從事阿爾茨海默病分子神經(jīng)病理學(xué)研究。

R741

A

1005-9202(2017)10-2363-05；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.10.008

1 省部共建地方病與少數(shù)民族性疾病教育部重點實驗室

2 貴州醫(yī)科大學(xué)微生物學(xué)教研室 3 貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院病理科