姜衛(wèi)榮 蔣士新 孫永梅

(山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院附屬醫(yī)院麻醉科，山東 濟(jì)南 250031)

右美托咪定對缺血缺氧性腦損傷新生大鼠的神經(jīng)保護(hù)作用及機(jī)制

姜衛(wèi)榮 蔣士新1孫永梅2

(山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院附屬醫(yī)院麻醉科，山東 濟(jì)南 250031)

目的 探討右美托咪定(DEX)對缺血缺氧性腦損傷(HIBD)新生大鼠神經(jīng)功能的影響。方法 36只健康雄性SD大鼠，按照隨機(jī)數(shù)字法分為假手術(shù)組(S組)、模型組(M組)和DEX組(D組)，每組12只。D組大鼠腹腔注射100 μg/kg鹽酸右美托咪定注射液，而S組和M組大鼠按照相同的劑量注射等量的生理鹽水。每組隨機(jī)取8只大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能缺損程度評分(NDS)，應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附測定法檢測腦組織勻漿液中的炎癥因子白細(xì)胞介素(IL)-6、IL-8、IL-10和腫瘤壞死因子(TNF)-α，采用分光光度法測量谷氨酸(Glu)和γ-氨基丁酸(GABA)水平,采用氯化三苯基四氮唑(TTC)染色法計(jì)算大腦的梗死體積和腦梗死體積百分比。結(jié)果 與S組相比，M組和D組NDS評分及腦梗死相關(guān)指標(biāo)均明顯升高，且D組各指標(biāo)明顯低于M組(P<0.05)；M組和D組腦組織勻漿中IL-6、IL-8和TNF-α水平明顯高于S組，而IL-10水平顯著低于S組，且D組炎癥因子水平改善情況明顯優(yōu)于M組(P<0.05)；與D組相比，其他兩組Glu水平明顯升高，而GABA水平顯著下降，另外，與M組相比，D組腦組織中氨基酸水平的改善情況更明顯(均P<0.05)。結(jié)論 DEX可以改善HIBD新生大鼠的神經(jīng)功能，減少腦梗體積和腦梗死體積百分比，降低腦組織中的炎癥因子和興奮性氨基酸的水平，從而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)功能，為臨床用藥提供理論依據(jù)。

右美托咪定；缺血缺氧性腦損傷；神經(jīng)保護(hù)

大腦對缺血和缺氧最敏感。一旦出現(xiàn)缺血缺氧損傷，可能會(huì)導(dǎo)致腦神經(jīng)功能受到損傷，且損傷不可逆，甚至導(dǎo)致死亡〔1〕。缺血缺氧性腦損傷(HIBD)發(fā)病率高，尤其是多發(fā)于新生兒的缺血缺氧性腦病(HIE)〔2〕。HIE發(fā)病過程中釋放大量的興奮性氨基酸、炎癥因子參與神經(jīng)功能損傷的過程，從而誘發(fā)一系列的腦功能障礙疾病〔3〕。右美托咪定(DEX)是美托咪定的右旋異構(gòu)體，對于α2腎上腺素受體具有較高的選擇性激活能力，并作用于哺乳動(dòng)物的大腦組織，雖然其作為可樂定的同類藥物，但是其活性是可樂定的8倍，可以在極低濃度下產(chǎn)生作用〔1〕。另外研究發(fā)現(xiàn)DEX還是一種麻醉藥，通過激活突觸后膜的α2腎上腺素受體，從而產(chǎn)生交感神經(jīng)阻滯和鎮(zhèn)靜鎮(zhèn)痛的作用〔4〕。本文旨在探討DEX對HIBD新生大鼠神經(jīng)功能的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級健康雄性SD大鼠36只，7日齡，體重13～15 g，由華中科技大學(xué)動(dòng)物同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，所有大鼠均于清潔級飼養(yǎng)室內(nèi)適應(yīng)性飼養(yǎng)1 w，自由飲食，溫度控制在(25±2)℃，相對濕度為40%～60%，自由飲食，每隔8 h進(jìn)行通風(fēng)換氣，自然光照。按照隨機(jī)數(shù)表法將分為假手術(shù)組(S組)、模型組(M組)和DEX組(D組)，每組12只。

1.2 方法

1.2.1 建模 所有大鼠均采用無水乙醚麻醉，S組大鼠僅分離左側(cè)頸總動(dòng)脈，并不進(jìn)行結(jié)扎和缺氧處理，而M組和D組大鼠均按照樊書娟等〔5〕描述的方法建立HIBD動(dòng)物模型：在大鼠的頸部正中做1個(gè)約1 cm的切口，使用手術(shù)鑷子分離出左側(cè)頸總動(dòng)脈，隨后使用手術(shù)線結(jié)扎，之后逐層縫合頸部切口，半個(gè)小時(shí)后將大鼠置于37℃恒溫缺氧倉中，缺氧倉中的氣體組成為92%的氮?dú)夂?%的氧氣，氣體流量為2 L/min，2 h后將大鼠取出。D組大鼠于造模成功后腹腔注射鹽酸右美托咪定注射液(江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，生產(chǎn)批號：20150705，規(guī)格200 μg/2 ml)，100 μg/kg，S組和M組大鼠按照相同的劑量注射等量的生理鹽水。

1.2.2 取材 缺氧24 h后，給每組存活的大鼠腹腔注射10%水合氯醛(400 mg/kg)，完全麻醉后，斷頭處死，開顱取出左側(cè)腦組織，用預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗表面，濾紙吸干后稱重，剪碎，加入9 ml/g PBS后高速勻漿，5 000 r/min離心10 min，吸取上清液，并用生理鹽水稀釋。

1.3 觀察指標(biāo) 每組隨機(jī)取8只大鼠于取材前進(jìn)行神經(jīng)功能缺損程度評分(NDS)，評分標(biāo)準(zhǔn)參考Bederson等〔6〕的方法：0分，無神經(jīng)缺損癥狀；1分，左前肢不能內(nèi)向屈曲；2分，向左旋轉(zhuǎn)或左側(cè)行走；3分，追尾狀向左轉(zhuǎn)圈。應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附測定法，嚴(yán)格按照說明書檢測炎癥因子白細(xì)胞介素(IL)-6、IL-8、IL-10和腫瘤壞死因子(TNF)-α。采用分光光度法測量谷氨酸(Glu)和γ-氨基丁酸(GABA)水平。

采用氯化三苯基四氮唑(TTC)染色法計(jì)算大腦的梗死面積：斷頭處死大鼠后，摘除小腦及腦干，置于-20℃冰箱中冷凍10 min后，將腦組織切成厚度為2 mm的腦片，并置于新配制的2%TTC溶液中，在37℃水浴中，避光孵育30 min，完全顯色后置于10%甲醛中至少固定24 h，保存于黑暗處。正常組織經(jīng)過TTC染色后呈現(xiàn)紅色，梗死組織呈現(xiàn)白色。對固定好的腦片拍照后輸入計(jì)算機(jī)，應(yīng)用IBAS 2.7型全自動(dòng)圖像分析系統(tǒng)分析圖像，腦梗死體積的近似值=腦片缺血面積×厚度，腦梗死面積百分比=(腦梗死體積/腦組織體積)×100%。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS19.0軟件進(jìn)行方差分析、t檢驗(yàn)和χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 3組NDS評分及腦梗死相關(guān)指標(biāo)對比 3組NDS評分、腦梗死體積及梗死面積百分比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與S組相比，M組和D組NDS評分及腦梗死相關(guān)指標(biāo)均明顯升高，D組各指標(biāo)明顯低于M組(均P<0.05)。見表1。

2.2 3組炎癥因子水平比較 3組炎癥因子水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。M組和D組IL-6、IL-8和TNF-α水平明顯高于S組，而IL-10水平顯著低于S組，D組炎癥因子水平改善情況明顯優(yōu)于M組(均P<0.05)。見表2。

表1 3組NDS評分及腦梗死相關(guān)指標(biāo)對比

與S組比較：1)P<0.05；與M組比較：2)P<0.05；下表同

表2 3組炎癥因子水平比較

2.3 3組Glu和GABA水平比較 3組Glu和GABA水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與S組相比，M組和D組Glu水平明顯升高，而GABA水平顯著下降，與M組相比，D組氨基酸水平的改善情況更明顯(均P<0.05)。見表3。

表3 3組Glu和GABA水平比較

3 討 論

腦部出現(xiàn)缺血缺氧是一個(gè)復(fù)雜的病理過程，如果不能進(jìn)行及時(shí)治療，可能會(huì)導(dǎo)致腦損傷加重。目前臨床療效突出的藥物主要為DEX，于2009年引入我國，具有鎮(zhèn)靜、抗焦慮和穩(wěn)定血流動(dòng)力學(xué)等作用，并且通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床研究證實(shí)其對HIBD具有良好的臨床療效〔7〕。DEX的作用部位為中樞的α2-腎上腺素受體而發(fā)揮作用，同時(shí)α2受體親和力是α1的1 640倍，其藥效是可樂定的8倍〔8〕。發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用機(jī)制可以多方面的〔9,10〕：①抑制兒茶酚胺的釋放；②營養(yǎng)神經(jīng)元并抑制神經(jīng)元凋亡；③抗氧化作用；④降低炎癥因子水平；⑤減少腦內(nèi)興奮性神經(jīng)遞質(zhì)的釋放。

在腦部缺血缺氧發(fā)生的過程中往往會(huì)引起運(yùn)動(dòng)、認(rèn)知等方面的損傷，因此需要通過Bederson法對肢體神經(jīng)功能障礙進(jìn)行評分，并對其嚴(yán)重程度進(jìn)行分析，而腦部梗死體積可以用于評價(jià)腦缺血缺氧程度，此次研究中采用TTC染色法對腦部梗死區(qū)域進(jìn)行檢測，并采用專業(yè)的圖像分析軟件分析，可以最大限度地保證圖片的客觀性，并降低實(shí)驗(yàn)誤差〔11〕。本研究結(jié)果提示DEX可以改善HIBD新生大鼠的神經(jīng)缺損功能，并減少腦梗死面積，主要是由于DEX可以通過激活α2-腎上腺素受體，抑制腺苷酸環(huán)化酶的活化，提高磷酸化的黏著斑激酶含量，從而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用，另外DEX還可以減少胞內(nèi)鈣離子內(nèi)流，從而減少腦梗死面積，繼而發(fā)揮大腦保護(hù)作用〔4〕。

腦組織出現(xiàn)缺血缺氧時(shí)能夠產(chǎn)生大量損傷因子，誘發(fā)腦水腫，進(jìn)而弱化血腦屏障功能，加速炎癥因子進(jìn)入腦組織的進(jìn)程，加劇對腦部的損傷〔12〕。其中IL-6是腦部缺血缺氧過程產(chǎn)生的重要炎癥因子之一，能夠誘發(fā)腦部炎性損傷；IL-10作為一種抗感染因子，可以在腦缺血損傷過程中發(fā)揮抗感染、抗氧化等多種腦保護(hù)作用，并能降低TNF-α的分泌；TNF-α是一種前炎癥因子，主要來源于活化的小膠質(zhì)細(xì)胞，作為炎癥反應(yīng)的觸發(fā)因子可促進(jìn)腦組織的神經(jīng)病變。IL-8主要發(fā)揮炎癥趨化作用，通過激活腦部中性粒細(xì)胞釋放大量的氧自由基，加重腦部區(qū)域的損傷〔13〕。本研究結(jié)果提示DEX可以改善HIBD新生大鼠的炎癥狀態(tài)，主要是由于DEX通過抑制中性粒細(xì)胞的浸潤和活化，加速其凋亡，從而抑制炎癥反應(yīng)〔12〕。另外，DEX能夠激活膽堿能神經(jīng)通路和抑制交感神經(jīng)而起到抗感染的作用〔8〕。

氨基酸作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)的主要神經(jīng)遞質(zhì)，可以分為興奮性氨基酸和抑制性氨基酸，興奮性氨基酸主要為Glu，可以參與興奮性傳導(dǎo)，同時(shí)也可以引起興奮性中毒，機(jī)體處于正常狀態(tài)時(shí)，Glu多存在于細(xì)胞內(nèi)，遠(yuǎn)高于細(xì)胞外的含量〔7〕。而GABA主要分布在黑質(zhì)和蒼白球中，同時(shí)還分布在海馬或小腦皮質(zhì)中，作為一種抑制性氨基酸，可以阻斷Glu的興奮性。本研究結(jié)果表明，DEX可以通過抑制電壓門控件鈣離子通道而抑制Glu的釋放，或者是選擇性作用于星型膠質(zhì)細(xì)胞上的α2受體，加速星型膠質(zhì)細(xì)胞對Glu的攝取和降解。但是DEX升高GABA的作用機(jī)制尚未明確，有待于進(jìn)一步研究。

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〔2016-11-22修回〕

(編輯 袁左鳴/滕欣航)

姜衛(wèi)榮(1972-)，女，主治醫(yī)師，主要從事麻醉學(xué)研究。

R742

A

1005-9202(2017)10-2407-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.10.025

1 濟(jì)南市槐蔭人民醫(yī)院內(nèi)科 2 山東省交通醫(yī)院麻醉科