李文蘭，孫向明，陳 晨，劉 悅，宋 輝，丁晶鑫，徐蓓蕾，閻新佳

(1.哈爾濱商業(yè)大學(xué)藥學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150076；2.哈爾濱商業(yè)大學(xué)生命科學(xué)與環(huán)境科學(xué)研究中心，黑龍江 哈爾濱 150076；

基于UPLC-Q-TOF MS的吳茱萸致肝毒性部位及入血成分分析

李文蘭1，孫向明2，陳 晨1，劉 悅1，宋 輝2，丁晶鑫2，徐蓓蕾1，閻新佳1

(1.哈爾濱商業(yè)大學(xué)藥學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150076；2.哈爾濱商業(yè)大學(xué)生命科學(xué)與環(huán)境科學(xué)研究中心，黑龍江 哈爾濱 150076；

利用超高效液相色譜-四極桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜(UPLC-Q-TOF MS)法分析鑒定吳茱萸肝毒性部位的化學(xué)成分和給大鼠灌胃毒性部位后的血中原形成分及代謝產(chǎn)物。在優(yōu)化的色譜和質(zhì)譜條件下，采用正離子掃描模式對(duì)質(zhì)量范圍m/z50～1 200的化合物進(jìn)行數(shù)據(jù)采集，分析時(shí)間僅為12 min。通過(guò)UNIFI軟件與人工相結(jié)合的方式對(duì)采集的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，根據(jù)高分辨質(zhì)譜提供的母離子與碎片離子的精確質(zhì)量信息，初步推測(cè)了化合物的分子組成；結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)品和參考文獻(xiàn)數(shù)據(jù)，共鑒定了肝毒性部位中的29個(gè)化學(xué)成分，其中包括9個(gè)吲哚類生物堿、10個(gè)喹諾酮類生物堿、5個(gè)三萜、3個(gè)黃酮、1個(gè)其他類生物堿和1個(gè)有機(jī)酸。進(jìn)一步比較了體內(nèi)外樣品的基峰離子色譜圖，結(jié)合質(zhì)譜數(shù)據(jù)和化合物裂解規(guī)律，共鑒定出21個(gè)入血成分，包括15個(gè)原形成分和6個(gè)代謝產(chǎn)物(1個(gè)為未知成分)，并推測(cè)了代謝產(chǎn)物的代謝途徑。該方法可為揭示吳茱萸肝毒性成分提供可靠的數(shù)據(jù)支持。

吳茱萸；肝毒性部位；成分分析；代謝產(chǎn)物；超高效液相色譜-四極桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜(UPLC-Q-TOF MS)

吳茱萸是蕓香科植物吳茱萸(Euodiarutaecarpa(Juss.) Benth.)、石虎(Euodiarutaecarpa(Juss.) Benth. var.officinalis(Dode) Huang)或疏毛吳茱萸(Euodiarutaecarpa(Juss.) Benth. var.bodinieri(Dode) Huang)的干燥近成熟果實(shí)[1]，具有散寒止痛、降逆止嘔、助陽(yáng)止瀉等功效。迄今為止，科研工作者已經(jīng)從吳茱萸中分離出大量的化學(xué)成分，包含生物堿、三萜類、揮發(fā)油、黃酮類等[2-5]，其中，生物堿作為吳茱萸的主要效應(yīng)成分顯現(xiàn)出多種生物活性[6-8]。

歷代中國(guó)本草專著中記載吳茱萸“有毒”或“小毒”。有報(bào)道[9]稱，有人因大劑量服用吳茱萸出現(xiàn)視物模糊、頭痛、胸悶、劇烈腹痛等癥狀。近年來(lái)，關(guān)于吳茱萸具有肝毒性的報(bào)道日益增多，其對(duì)人類造成的肝毒性影響受到學(xué)者們的廣泛關(guān)注[10-12]。本課題組前期的吳茱萸致肝毒性部位篩選的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：給小鼠連續(xù)灌胃吳茱萸的50%乙醇提取物14 d，可導(dǎo)致小鼠的肝體系數(shù)、血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶顯著升高，確定50%乙醇提取物為吳茱萸發(fā)揮致肝毒性的有效部位。目前的研究?jī)H局限于吳茱萸肝毒性及其機(jī)制[13-16]，尚未見(jiàn)吳茱萸致肝毒性的物質(zhì)基礎(chǔ)和作用形式的報(bào)道。因此，存在嚴(yán)重的用藥安全隱患，限制了其臨床的應(yīng)用和拓展。

肝臟的病理狀態(tài)會(huì)影響藥物在體內(nèi)的代謝過(guò)程。本工作以吳茱萸致肝毒性后的大鼠為研究對(duì)象，采用超高效液相色譜-四極桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜(UPLC-Q-TOF MS)法對(duì)吳茱萸的肝毒性部位化學(xué)成分和血中的代謝產(chǎn)物進(jìn)行鑒定，并推測(cè)其可能的代謝途徑，以期發(fā)現(xiàn)吸收入血的成分及代謝產(chǎn)物，為揭示吳茱萸肝毒性的化學(xué)物質(zhì)基礎(chǔ)提供理論依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑與材料

Acquity UPLC I-Class超高效液相色譜與Xevo G2-S Q-TOF四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用儀：美國(guó)Waters公司產(chǎn)品；XW-80A渦旋混合器：上海宇工機(jī)械有限公司產(chǎn)品；Allegra 64R低溫高速離心機(jī)：美國(guó)貝克曼庫(kù)爾有限公司產(chǎn)品。

吳茱萸：購(gòu)自哈爾濱三棵樹(shù)藥材市場(chǎng)，經(jīng)哈爾濱商業(yè)大學(xué)張德連教授鑒定為吳茱萸Evodiarutaecarpa(Juss.) Benth；辛弗林、綠原酸、蘆丁、金絲桃苷、檸檬苦素、吳茱萸堿、吳茱萸次堿對(duì)照品：均購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢驗(yàn)所；純凈水：屈臣氏公司產(chǎn)品；甲醇、乙腈、甲酸均為色譜純；其余試劑均為分析純。

雄性Wistar大鼠(質(zhì)量為(250±20) g，批號(hào)：SCXK-(吉)2003-2004)：購(gòu)自長(zhǎng)春國(guó)家生物產(chǎn)業(yè)基地實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2 灌胃和供試品溶液的制備

1.2.1 灌胃溶液的制備 取吳茱萸粗粉適量，用50%乙醇浸泡12 h后加熱回流提取，溶劑用量及提取時(shí)間為8倍量120 min(1次)、7倍量90 min(1次)，合并2次提取液，減壓濃縮，得到浸膏，儲(chǔ)存于冰箱中，備用。給藥前，用蒸餾水溶解成約1.4 g/mL生藥材的灌胃藥液，備用。

1.2.2 體外藥材溶液的制備 稱取浸膏適量(相當(dāng)于0.5 g生藥材)，用甲醇充分溶解，定容至25 mL容量瓶中；精密吸取1 mL，用甲醇稀釋10倍，過(guò)0.22 μm微孔濾膜，備用。

1.2.3 對(duì)照品溶液的制備 稱取辛弗林、綠原酸、蘆丁、金絲桃苷、檸檬苦素、吳茱萸堿、吳茱萸次堿各1 mg，用甲醇溶解并定容至10 mL容量瓶中，過(guò)0.22 μm微孔濾膜，備用。

1.3 給藥與樣品收集

將大鼠隨機(jī)分為空白組和給藥組，每組6只，適應(yīng)性喂養(yǎng)一周，期間自由飲水。以35 g/(kg·d)(按生藥計(jì))的劑量給大鼠灌胃，每天1次，連續(xù)灌胃給藥14 d(本課題組前期的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，給藥14 d對(duì)大鼠肝臟有一定的蓄積毒性作用)；空白組大鼠每天給予同體積的蒸餾水，于第13天灌胃給藥后禁食(自由飲水)，末次給藥60 min后，以2 mL/kg的劑量腹腔注射水合氯醛(10%)進(jìn)行麻醉，肝門(mén)靜脈取血7 mL，室溫放置30 min，待充分凝血后，以3 000 r/min離心15 min，小心吸取上清液，即為待測(cè)血清。

1.4 生物樣品的制備

取3.0 mL血清樣品，加入12.0 mL甲醇，于離心管中充分渦旋混勻1 min，再以14 000 r/min離心10 min，小心吸取上清液，氮?dú)獯蹈桑挥梦⒘恳埔浩骶芗尤?.5 mL甲醇，充分溶解殘留物，過(guò)0.22 μm微孔濾膜，得血清供試品溶液。

1.5 實(shí)驗(yàn)條件

1.5.1 色譜條件 色譜柱：HSS T3(100 mm×2.1 mm×1.8 μm)；柱溫40 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)300 nm；流動(dòng)相：A為0.1%甲酸-水溶液，B為0.1%甲酸-乙腈溶液；梯度洗脫程序：0～0.3 min(1%B)，0.3～2 min(1%～15%B)，2～4 min(15%～25%B)，4～6 min(25%～55%B)，6～8 min(55%～70%B)，8～12 min(70%～99%B)；流速0.5 mL/min；進(jìn)樣量0.2 μL。

1.5.2 質(zhì)譜條件 離子化模式：大氣壓電噴霧正離子掃描模式(ESI+)；毛細(xì)管電壓2.5 kV；源溫度120 ℃；霧化氣溫度500 ℃；霧化氣流速800 L/h；錐孔氣流速10 L/h；采集模式：MSE；質(zhì)量掃描范圍m/z50～1 200；低碰撞能量4.0 eV，高碰撞能量20.0～45.0 eV；數(shù)據(jù)采集時(shí)間12 min。實(shí)驗(yàn)采用UNIFI 1.7軟件結(jié)合天然產(chǎn)物數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

2 結(jié)果與討論

2.1 肝毒性部位化學(xué)成分的UPLC-Q-TOF MS分析

應(yīng)用UPLC-Q-TOF MS法對(duì)吳茱萸肝毒性部位進(jìn)行定性分析，共表征了29個(gè)化學(xué)成分，其色譜圖示于圖1。通過(guò)與對(duì)照品的保留時(shí)間和一、二級(jí)質(zhì)譜信息進(jìn)行比較，可以確定辛弗林、綠原酸、蘆丁、金絲桃苷、檸檬苦素、吳茱萸堿、吳茱萸次堿7個(gè)化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)。利用UNIFI1.7軟件與人工相結(jié)合進(jìn)行分析，通過(guò)準(zhǔn)分子離子峰的質(zhì)荷比(m/z)可以初步判斷化合物的元素組成和經(jīng)驗(yàn)分子式，并與已知化合物進(jìn)行匹配，參考化合物的裂解規(guī)律，由碎片離子做進(jìn)一步的驗(yàn)證。根據(jù)上述解析原則，結(jié)合數(shù)據(jù)庫(kù)檢索、各級(jí)質(zhì)譜信息和文獻(xiàn)報(bào)道，對(duì)化學(xué)成分進(jìn)行結(jié)構(gòu)推測(cè)[2-4,17-21]，結(jié)果列于表1。檢測(cè)到的29個(gè)化合物中包括9個(gè)吲哚類生物堿(化合物3、8～9、12、15～19)，10個(gè)喹諾酮類生物堿(化合物20～29)，5個(gè)三萜類(化合物4、10、11、13～14)，3個(gè)黃酮類(化合物5～7)，1個(gè)其他類生物堿(化合物1)和1個(gè)有機(jī)酸(化合物2)。

每類化合物的解析舉例如下：化合物8為[M+H]+m/z302.130 1，推斷其分子式為C19H15N3O，碎片離子m/z286.097 8與母離子相差16.032 3 u，為母離子丟失N-14位的CH3后形成[M+H-CH3+H]+碎片離子，此碎片進(jìn)一步中性丟失1個(gè)CO基團(tuán)(28.008 4 u)，產(chǎn)生m/z258.089 4[M+H-CH3+H-CO]+碎片離子，推測(cè)為去氫吳茱萸堿；化合物20為[M+H]+m/z286.216 6，推斷其分子式為C19H27NO，母離子中性丟失1個(gè)C4H8產(chǎn)生m/z230.125 8[M+H-3CH2-CH3+H]+碎片離子，豐度較高的是喹諾酮類生物堿常見(jiàn)的m/z186.092 1和m/z173.084 3碎片離子，主要是由碳鏈上電子重排和化學(xué)鍵斷裂而丟失部分側(cè)鏈結(jié)構(gòu)形成的穩(wěn)定共軛結(jié)構(gòu)，這兩種離子在質(zhì)譜中有較高的豐度，推測(cè)為1-甲基-2-壬基-4(1H)喹諾酮；化合物11為[M+H]+m/z485.180 3，推斷其分子式為C26H28O9，碎片離子m/z439.173 3與母離子相差46.007 u，為1個(gè)CH2O2，產(chǎn)物為[M+H-CO2-H2]+，母離子在高能量碰撞下斷裂，丟失C16H19O7碎片形成特征離子m/z161.059 5，推測(cè)為吳茱萸內(nèi)酯醇；化合物5為[M+H]+m/z611.160 8，推測(cè)其分子式為C27H30O16，碎片離子m/z465.100 8與母離子相差146.06 u，恰好為母離子丟失寡糖鏈末端的鼠李糖基，m/z303.049 7為母離子丟失整個(gè)寡糖鏈獲得的碎片離子，與標(biāo)準(zhǔn)品一致，推測(cè)為蘆丁；化合物1為[M+H-H2O]+m/z150.091 3，在一級(jí)質(zhì)譜中未見(jiàn)[M+H]+峰，可見(jiàn)此結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，側(cè)鏈的羥基易發(fā)生斷裂，失去1個(gè)H2O形成m/z150.091 3碎片離子，此碎片發(fā)生α斷裂，脫掉側(cè)鏈的1個(gè)CH3形成m/z136.067 5[M+H-CH3+H]+碎片離子，與標(biāo)準(zhǔn)品一致，推測(cè)為辛弗林[22]；化合物2為[M+H]+m/z355.101 4，推測(cè)其分子式為C16H18O9，m/z163.039 1和m/z193.063 2為母離子在高能量碰撞下前體離子酯鍵斷裂產(chǎn)生的碎片離子，與標(biāo)準(zhǔn)品一致，推測(cè)為綠原酸。各代表化合物及標(biāo)準(zhǔn)品的二級(jí)質(zhì)譜和結(jié)構(gòu)示于圖2。

圖1 正離子模式下，吳茱萸肝毒性部位(a)和7個(gè)混合對(duì)照品(b)的基峰離子色譜圖Fig.1 Base-peak ion (BPI) chromatograms of Euodia rutaecarpa hepatotoxic part (a) and 7 mixture standards (b) in positive ion mode

表1 吳茱萸肝毒性部位的UPLC-Q-TOF MS數(shù)據(jù)及化學(xué)成分識(shí)別Table 1 UPLC-Q-TOF MS data and chemical compositions of Euodia rutaecarpa hepatotoxic part

續(xù)表1

2.2 肝毒性部位入血成分的UPLC-Q-TOF MS分析

采用UPLC-Q-TOF MS法對(duì)灌胃吳茱萸肝毒性部位后的大鼠血清及空白血清進(jìn)行分析，共檢測(cè)到21個(gè)入血成分，通過(guò)與肝毒性部位各化學(xué)成分的保留時(shí)間和質(zhì)譜數(shù)據(jù)比對(duì)，發(fā)現(xiàn)其中15個(gè)成分為原形成分，6個(gè)成分為代謝產(chǎn)物(a～f號(hào)峰)，示于圖3和表2。

代謝產(chǎn)物的鑒定過(guò)程如下[23-27]：化合物a為未知結(jié)構(gòu)化合物；化合物b為[M+H]+m/z318.123 2，推斷其分子式為C19H15N3O2，碎片離子m/z302.128 7與母離子相差15.994 5 u，為母離子中性丟失1個(gè)O產(chǎn)生[M+H-OH+H]+，此結(jié)構(gòu)進(jìn)一步失去1個(gè)CH4形成[M+H-CH4]+m/z286.097 8碎片離子，推測(cè)為羥基去氫吳茱萸堿；化合物c為[M+H]+m/z288.323 3，推測(cè)其分子式為C18H13N3O，碎片離子m/z274.295 9與母離子相差14.027 4 u，為母離子中性失去1個(gè)CH2產(chǎn)生[M+H-CH3+H]+，碎片離子m/z260.313 2與母離子相差28.010 1 u，為母離子丟失1個(gè)CO，推測(cè)為去甲基去氫吳茱萸堿；化合物d為[M+H]+m/z318.351 0，推斷其分子式為C19H15N3O2，母離子具有—N—CHO結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)中的羰基吸電子加大了碳氮鍵偶極矩，斷裂形成了m/z290.339 1碎片離子，母離子環(huán)己烯結(jié)構(gòu)在高能量碰撞下發(fā)生RDA斷裂，產(chǎn)生m/z171.048 4、m/z144.139 1碎片離子，推測(cè)為14-甲?；鋮擒镙谴螇A；化合物e為[M+H]+m/z304.108 6，推斷其分子式為C18H13N3O2，碎片離子m/z288.112 2與母離子相差15.996 4 u，為母離子失去1個(gè)O產(chǎn)生[M+H—OH+H]+，此結(jié)構(gòu)的環(huán)內(nèi)叔胺碳氮鍵斷裂丟失1個(gè)NH產(chǎn)生[M+H-NH]+m/z273.144 3碎片離子，推測(cè)為羥基吳茱萸次堿；化合物f為[M+H]+m/z320.139 5，推斷其分子式為C19H17N3O2，m/z187.217 8、m/z134.155 2為母離子的環(huán)己烯結(jié)構(gòu)在質(zhì)譜碰撞電壓轟擊下發(fā)生RDA斷裂形成的特征碎片離子，推測(cè)為羥基吳茱萸堿。各代謝產(chǎn)物的二級(jí)質(zhì)譜和結(jié)構(gòu)示于圖4。

2.3 代謝產(chǎn)物的代謝途徑分析

吳茱萸肝毒性部位的多數(shù)成分以原形入血，推測(cè)有4個(gè)原形成分入血的同時(shí)發(fā)生了Ⅰ相和Ⅱ相代謝，產(chǎn)生了5個(gè)代謝產(chǎn)物(2.2節(jié)中提到的6個(gè)代謝產(chǎn)物中有1個(gè)未知產(chǎn)物未能鑒定)，示于圖5。去氫吳茱萸堿通過(guò)去甲基化和羥基化代謝產(chǎn)生了去甲基去氫吳茱萸堿和羥基去氫吳茱萸堿。推測(cè)14-甲?；鋮擒镙谴螇A可能為二氫吳茱萸次堿的甲?；a(chǎn)物。吳茱萸次堿和吳茱萸堿在體內(nèi)可能發(fā)生了甲基化，代謝為羥基吳茱萸次堿和羥基吳茱萸堿。

圖2 代表化合物及對(duì)應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)品的二級(jí)質(zhì)譜圖和結(jié)構(gòu)圖Fig.2 Secondary mass spectrograms and structures of representative compounds and corresponding standards

圖3 吳茱萸肝毒性部位(a)、含藥血清(b)和空白血清(c)的基峰離子色譜圖Fig.3 Base-peak ion (BPI) chromatograms of Euodia rutaecarpa hepatotoxic part (a), medicated serum (b) and blank serum (c)

表2 大鼠血清中肝毒性部位的原形及代謝成分Table 2 Prototype and metabolic components of hepatotoxic part in rat serum

續(xù)表2

注：A表示原形成分，B表示代謝成分

圖4 代謝產(chǎn)物的二級(jí)質(zhì)譜圖和結(jié)構(gòu)圖Fig.4 Secondary mass spectrograms and structures of metabolites

圖5 吳茱萸在大鼠血漿中的代謝途徑Fig.5 Metabolic pathways of Euodia rutaecarpa in rat serum

3 結(jié)論

采用UPLC-Q-TOF MS法對(duì)吳茱萸肝毒性部位及其入血成分進(jìn)行分析，在肝毒性部位中檢測(cè)并鑒定了29個(gè)化學(xué)成分，在含藥血清中檢測(cè)到21個(gè)入血成分，包括6個(gè)代謝產(chǎn)物(其中一個(gè)為未知成分)，并推測(cè)其代謝途徑。這為闡明吳茱萸致肝毒性的物質(zhì)基礎(chǔ)提供了參考，也為吳茱萸的臨床應(yīng)用提供了依據(jù)。

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Analysis ofEuodiarutaecarpaHepatotoxic Part and Absorbed Components in Rat Serum Based on UPLC-Q-TOF MS

LI Wen-lan1, SUN Xiang-ming2, CHEN Chen1, LIU Yue1, SONG Hui2, DING Jing-xin2, XU Bei-lei1, YAN Xin-jia1

(1.SchoolofPharmacy,HarbinUniversityofCommerce,Harbin150076,China; 2.ResearchCenteronLifeSciencesandEnvironmentalSciences,HarbinUniversityofCommerce,Harbin150076,China;

A method of ultra performance liquid chromatography coupled with quadrupole time-of-flight mass spectrometry (UPLC-Q-TOF MS) was established to analyze the chemicals inEuodiarutaecarpahepatotoxic part and metabolic components in rat blood. Under the optimized condition of chromatography and mass spectrometry, the data collection for the compounds in the mass range ofm/z50-1 200 was performed using positive ion scanning mode within 12 min. The collected data were analyzed based on UNIFI software combined with artificial analysis. According to the precise mass information of precursor ions and fragment ions offered by high resolution mass spectrometry, the molecule composition of compound was preliminarily speculated. Finally, a total of 29 constituents in hepatotoxic part are identified combined with substances and reference data, including 9 indole alkaloids, 10 quinolone alkaloids, 5 triterpenoids, 3 flavonoids, one other alkaloid and one organic acid. 21 compounds in blood are characterized, including 15 prototypes and 6 metabolites (a compound unknown) by comparing the base peak ion chromatograms of samples in vivo and in vitro combined with MS data, compound fragmentation laws and published literatures. The metabolic pathways of metabolites were further speculated. This method can provide, a reliable data support to indicate hepatotoxic components ofEuodiarutaecarpa.

Euodiarutaecarpa; hepatotoxic part; constituent analysis; metabolites; ultra performance liquid chromatography coupled with quadrupole time-of-flight mass spectrometry (UPLC-Q-TOF MS)

2016-06-30;

2016-09-13

哈爾濱市科技局科技創(chuàng)新人才項(xiàng)目(2015RQXXJ011)；黑龍江省教育廳科研項(xiàng)目(12541192)資助

李文蘭(1967—)，女(漢族)，河北人，教授，從事中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究。E-mail: lwldzd@163.com

O657.63

A

1004-2997(2016)03-0282-12

10.7538/zpxb.youxian.2016.0065