閆 峻，劉 舒，李伯平，劉志強(qiáng)，郭冬發(fā)

(1.核工業(yè)北京地質(zhì)研究院，北京 100029；2.中國科學(xué)院長春應(yīng)用化學(xué)研究所，吉林 長春 130022)

復(fù)方板藍(lán)根顆粒APCI-MS指紋圖譜及化學(xué)成分的LC-APCI-MSn研究

閆 峻1，劉 舒2，李伯平1，劉志強(qiáng)2，郭冬發(fā)1

(1.核工業(yè)北京地質(zhì)研究院，北京 100029；2.中國科學(xué)院長春應(yīng)用化學(xué)研究所，吉林 長春 130022)

建立了復(fù)方板藍(lán)根顆粒提取物的大氣壓化學(xué)電離質(zhì)譜(APCI-MS)的指紋圖譜分析方法，并利用液相色譜-大氣壓化學(xué)電離-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-APCI-MSn)技術(shù)對主要指紋峰的歸屬進(jìn)行確認(rèn)。結(jié)果表明：質(zhì)譜指紋圖譜確定了10批不同來源復(fù)方板藍(lán)根顆粒提取物的10個(gè)共有峰，各提取物的指紋圖譜相似度均在97%以上?；瘜W(xué)成分的LC-APCI-MSn分析鑒別了復(fù)方板藍(lán)根顆粒提取物中吲哚類、奎唑酮類、有機(jī)酸類和卟啉類等12個(gè)化合物，并確定了5個(gè)質(zhì)譜指紋峰的歸屬。采用體外實(shí)驗(yàn)研究對復(fù)方板藍(lán)根顆粒提取物的抗病毒活性進(jìn)行評價(jià)，結(jié)果表明，其具有一定的抗病毒活性。該指紋圖譜的精密度、穩(wěn)定性和重現(xiàn)性良好，化學(xué)成分分析快捷、靈敏，結(jié)合化學(xué)成分分析和藥效學(xué)研究，可為復(fù)方板藍(lán)根顆粒質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)的制訂奠定基礎(chǔ)，同時(shí)也為深入研究其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和譜效關(guān)系提供理論依據(jù)。

復(fù)方板藍(lán)根顆粒；指紋圖譜；液相色譜-大氣壓化學(xué)電離-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-APCI-MSn)；抗病毒活性

板藍(lán)根和大青葉為十字花科植物菘藍(lán)(IsatisindigoticaFort.)的干燥根和葉，二者的主要化學(xué)成分相似，配伍后沒有新的化合物生成[1-2]。不同產(chǎn)地的板藍(lán)根和大青葉經(jīng)提取分離后，其化學(xué)成分差異較小[3]。復(fù)方板藍(lán)根顆粒是《中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)》所收載的中藥成方制劑，由板藍(lán)根和大青葉以2∶3比例經(jīng)水醇法提取后，加淀粉和蔗糖等輔料制成，具有清熱解毒、涼血之功效，用于治療瘟病發(fā)熱、出斑、風(fēng)熱感冒、咽喉腫爛、流行性乙型腦炎、肝炎和腮腺炎等病癥[4]。目前，復(fù)方板藍(lán)根顆粒的質(zhì)量控制報(bào)道主要是對靛藍(lán)、靛玉紅成分進(jìn)行定量分析[5]。而在藥效學(xué)研究的基礎(chǔ)上，對其化學(xué)成分和指紋圖譜的研究報(bào)道較少，這不足以從整體上控制質(zhì)量[6-7]。

中藥指紋圖譜能全面、綜合地反映中藥及其復(fù)方制劑所含成分的相對關(guān)系，具有特征明顯、專屬性強(qiáng)、重現(xiàn)性好等特點(diǎn)[5-7]，是目前國內(nèi)外廣泛接受的中藥評價(jià)技術(shù)。軟電離質(zhì)譜技術(shù)，如電噴霧電離(ESI)和大氣壓化學(xué)電離(APCI)等，具有樣品處理簡單、分析速度快等特點(diǎn)，是中藥及天然產(chǎn)物化學(xué)成分分析和指紋圖譜研究的有效手段[8-9]。高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(如LC-ESI-MSn和LC-APCI-MSn等)具有高效、快速、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，可以同時(shí)完成成分分離和結(jié)構(gòu)鑒定，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于中藥及天然產(chǎn)物化學(xué)成分的定性定量分析[10-11]。

研究表明，板藍(lán)根的主要有效成分之一是生物堿類化合物。它可通過與PK-15細(xì)胞表面受體相結(jié)合而增加病毒吸附和與機(jī)體融合的難度，也可通過抑制病毒核酸復(fù)制和影響蛋白合成而發(fā)揮抑制病毒在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制和增殖的作用[12]。隨著中藥現(xiàn)代化步伐的加快和人們對高效、低毒、低副作用中藥需求的不斷增加，生物堿類化合物有望成為一種低毒、高效的抗病毒藥物[13]。

本研究擬建立復(fù)方板藍(lán)根顆粒提取物的APCI-MS指紋圖譜，利用高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)鑒定主要共有峰的結(jié)構(gòu)，希望為復(fù)方板藍(lán)根顆粒譜效關(guān)系的研究和質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)的制定提供理論依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與裝置

Waters 2695高效液相色譜儀：美國Waters公司產(chǎn)品；LCQ離子阱質(zhì)譜儀：美國Finnigan公司產(chǎn)品；自動(dòng)酶標(biāo)儀：奧地利CliniBio公司產(chǎn)品。

1.2 主要試劑與藥材

靛藍(lán)、靛玉紅對照品：由中國藥品生物制品檢定所提供；水楊酸、亞麻酸對照品：美國Sigma公司產(chǎn)品；新生小牛血清：大連生化試劑廠產(chǎn)品；利巴韋林注射液：天津藥業(yè)集團(tuán)新鄭股份有限公司產(chǎn)品；單純皰疹I(lǐng)型病毒(HSV-I)、呼吸道合胞病毒(RSV)和腺病毒B3型病毒(AD3)：長春生物制品研究所產(chǎn)品；IMDM細(xì)胞培養(yǎng)液：美國HyClone公司產(chǎn)品；噻唑藍(lán)(MTT)：美國Sigma公司產(chǎn)品；甲醇、乙酸：均為色譜純，美國Fisher公司產(chǎn)品；水為超純水；其他試劑均為分析純。

板藍(lán)根和大青葉藥材經(jīng)長春中醫(yī)藥大學(xué)王淑敏教授鑒定為十字花科植物菘藍(lán)(IsatisindigoticaFort.)的干燥根和葉，分別產(chǎn)自河北、安徽、黑龍江、甘肅、山西、吉林等地，詳細(xì)情況列于表1。

表1 板藍(lán)根和大青葉藥材的來源Table 1 Sources of Isatidis Radix and Isatidis Folium

1.3 樣品制備

稱取4 g板藍(lán)根，6 g大青葉，加200 mL水煎煮2次，每次1 h，過濾，合并濾液，減壓濃縮至50 mL；加入100 mL 95%乙醇，攪勻，靜置24 h，減壓抽濾并干燥，得到復(fù)方板藍(lán)根顆粒總提取物浸膏。加50 mL水溶解該浸膏，置于分液漏斗中，用150 mL乙酸乙酯萃取5次，合并萃取液，減壓濃縮并干燥，得到復(fù)方板藍(lán)根顆粒提取物。

1.4 復(fù)方板藍(lán)根顆粒提取物的APCI-MS指紋圖譜研究

1) 供試品溶液的制備

取S1～S10號板藍(lán)根和大青葉藥材，按1.3節(jié)方法制備不同來源藥材的復(fù)方板藍(lán)根顆粒提取物。精密稱取不同批次的復(fù)方板藍(lán)根顆粒提取物各0.1 g，分別置于10 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，即得復(fù)方板藍(lán)根顆粒提取物的樣品溶液。測試前取10 μL樣品溶液，加甲醇稀釋至400 μL，過0.45 μm濾膜，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

2) 質(zhì)譜條件

大氣壓化學(xué)電離離子源，正離子模式檢測，質(zhì)量掃描范圍m/z100～300，氣化溫度400 ℃，毛細(xì)管溫度150 ℃，毛細(xì)管電壓15.0 V，鞘氣(N2)流速0.75 L/h，流動(dòng)注射泵進(jìn)樣，進(jìn)樣流速5 μL/min。

1.5 復(fù)方板藍(lán)根顆粒提取物化學(xué)成分的LC-APCI-MSn研究

1) 供試品溶液的制備

取S1號板藍(lán)根和大青葉藥材，按1.3節(jié)方法制備不同來源藥材的復(fù)方板藍(lán)根顆粒提取物。稱取0.1 g復(fù)方板藍(lán)根顆粒提取物，置于10 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，過0.45 μm濾膜，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

2) 色譜條件

色譜柱：Kromasil C18分析柱(4.6 mm×250 mm×5 μm)；流動(dòng)相：0.15%乙酸-水溶液(A)，甲醇(B)；線性梯度洗脫；洗脫程序：0～45 min、40%～100%B，45～60 min、100%B；流速0.8 mL/min；柱溫25 ℃；進(jìn)樣量10 μL；檢測波長254 nm。

3) 質(zhì)譜條件

大氣壓化學(xué)電離離子源，正負(fù)離子模式檢測，質(zhì)量掃描范圍m/z50～1 000，氣化溫度450 ℃，毛細(xì)管溫度150 ℃，鞘氣(N2)流速 0.90 L/h，輔助氣(N2)流速0.15 L/h。

1.6 復(fù)方板藍(lán)根顆粒提取物的抗病毒活性研究

1.6.1 復(fù)方板藍(lán)根顆粒提取物和陽性對照藥物細(xì)胞毒性的測定 用含2%小牛血清的IMDM細(xì)胞培養(yǎng)液將由S1號藥材制備的復(fù)方板藍(lán)根顆粒提取物和陽性對照藥物利巴韋林注射液分別配制成1 000、500、450、400、350、300、250、200、150、100、50、10、8、4、2、1、0.8、0.4、0.2、0.1、0.05和0.025 g/L的溶液。應(yīng)用犬腎細(xì)胞(MDCK)和羊膜細(xì)胞(FL)分別測定復(fù)方板藍(lán)根顆粒提取物和利巴韋林注射液的最大無毒濃度(TD0)。

1.6.2 病毒毒力的測定 將單純皰疹-Ⅰ病毒(HSV-Ⅰ)、呼吸道合胞病毒(RSV)和腺病毒3型病毒(Ad3)分別從原液～10-5mg/L稀釋成5個(gè)濃度，加入鋪滿MDCK/FL細(xì)胞的96孔板，并設(shè)立正常對照組，待24 h后觀察致細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE)，計(jì)算3種病毒的半數(shù)組織培養(yǎng)感染劑量(TCID50)。

1.6.3 實(shí)驗(yàn)分組 實(shí)驗(yàn)設(shè)正常細(xì)胞對照組，完全病毒感染組，陽性藥物對照組和高、中、低3個(gè)濃度的實(shí)驗(yàn)藥物組。

1.6.4 病毒感染細(xì)胞病變抑制實(shí)驗(yàn) 以2×105mg/L的密度將FL-MDCK細(xì)胞接種在96孔板上，每孔0.1 mL，置于37 ℃的CO2培養(yǎng)箱孵育，24 h后棄掉上清液。每孔以0.1 mL 1 000 TCID50的病毒感染相應(yīng)的宿主細(xì)胞，置于37 ℃的CO2培養(yǎng)箱孵育，2 h后棄掉上清液。加入各實(shí)驗(yàn)組待測藥物，置于CO2培養(yǎng)箱孵育，24 h后觀察CPE，待完全病毒感染組CPE為“++++”時(shí)記錄結(jié)果，并用MTT法測定各孔的OD570值，從而確定各實(shí)驗(yàn)組藥物對病毒感染細(xì)胞的病變抑制程度，每個(gè)孔平行測定6次。

2 結(jié)果與討論

2.1 APCI-MS指紋圖譜的方法學(xué)考察

2.1.1 精密度實(shí)驗(yàn) 取S1號板藍(lán)根和大青葉藥材，按照1.4節(jié)方法制備復(fù)方板藍(lán)根顆粒提取物APCI-MS指紋圖譜供試品溶液，重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄質(zhì)譜圖。結(jié)果表明，各主要質(zhì)譜峰的相對豐度RSD均小于0.07%，離子流強(qiáng)度RSD均小于0.09%，儀器精密度良好。

2.1.2 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取與2.1.1節(jié)實(shí)驗(yàn)相同的供試品溶液，分別在0、4、8、12、18、24 h進(jìn)樣，記錄質(zhì)譜圖。結(jié)果表明，各主要質(zhì)譜峰的相對豐度RSD均小于0.07%，離子流強(qiáng)度RSD均小于0.10%，說明樣品至少在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.3 重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn) 平行取6份與2.1.1節(jié)實(shí)驗(yàn)相同的供試品溶液，分別進(jìn)樣，記錄質(zhì)譜圖。結(jié)果表明，各主要質(zhì)譜峰的相對豐度RSD均小于0.08%，離子流強(qiáng)度RSD均小于0.12%，說明該方法的重現(xiàn)性良好。

2.2 APCI-MS指紋圖譜的建立

10批不同來源的復(fù)方板藍(lán)根顆粒提取物的APCI-MS指紋圖譜和共有模式圖分別示于圖1和圖2。根據(jù)測定結(jié)果，標(biāo)定共有指紋峰10個(gè)，分別為m/z120、146、149、163、181、187、239、249、263、279。不同來源的復(fù)方板藍(lán)根顆粒提取物APCI-MS指紋圖譜各共有峰的相對豐度列于表2。

采用夾角余弦值和相關(guān)系數(shù)兩個(gè)參數(shù)對不同來源的復(fù)方板藍(lán)根顆粒APCI-MS指紋圖譜的相似度進(jìn)行評價(jià)，詳細(xì)情況列于表3。由表3可知，其相似度均在97%以上。

圖1 復(fù)方板藍(lán)根顆粒提取物的APCI-MS指紋圖譜Fig.1 APCI-MS fingerprints of the extracts from Compound Indigowoad Root Granule

圖2 復(fù)方板藍(lán)根顆粒提取物的APCI-MS指紋圖譜的共有模式圖Fig.2 Common pattern chromatograms of APCI-MS fingerprints of the extracts from Compound Indigowoad Root Granule

2.3 復(fù)方板藍(lán)根顆粒提取物化學(xué)成分的LC-APCI-MSn研究

采用HPLC-APCI-MSn技術(shù)，在正負(fù)離子模式下，對復(fù)方板藍(lán)根顆粒提取物的化學(xué)成分進(jìn)行鑒定，其總離子流圖示于圖3，詳細(xì)數(shù)據(jù)列于表4。

2.4 APCI-MS指紋圖譜主要共有峰的結(jié)構(gòu)確認(rèn)

經(jīng)HPLC-APCI-MSn分析，判斷各共有峰中，m/z146、239、249代表的化合物分別為3-醛基吲哚、3-羥苯基喹唑酮、色胺酮；m/z263代表的化合物為靛藍(lán)和靛玉紅，二者互為同分異構(gòu)體；m/z279代表的化合物為羥基靛玉紅和亞麻酸。其他共有峰所代表的化合物結(jié)構(gòu)有待進(jìn)一步研究。

表2 復(fù)方板藍(lán)根顆粒提取物APCI-MS指紋圖譜各共有峰的相對豐度Table 2 Relative abundance of common pattern chromatograms of the extracts from Compound Indigowoad Root Granule

表3 復(fù)方板藍(lán)根顆粒提取物APCI-MS指紋圖譜的相似度Table 3 Similarities of fingerprint chromatograms of the extracts from Compound Indigowoad Root Granule

2.5 復(fù)方板藍(lán)根顆粒提取物的抗病毒活性研究

復(fù)方板藍(lán)根顆粒提取物對FL/MDCK細(xì)胞均未見CPE的改變，當(dāng)藥物濃度低于1 g/L時(shí)，CPE觀察視野很清晰，因此將1 g/L作為實(shí)驗(yàn)藥物組的最大濃度；陽性對照藥物利巴韋林注射液的最大無毒濃度(TD0)為800 mg/L。采用Reed-Muench法計(jì)算得到3種病毒的TCID50均為1 000。復(fù)方板藍(lán)根顆粒提取物不同化學(xué)組分對HSV-Ⅰ、RSV和Ad3三種流感病毒的抑制作用情況列于表5。

由表5可知，復(fù)方板藍(lán)根顆粒提取物高濃度組對HSV-Ⅰ、RSV和Ad3三種病毒均有明顯的抑制作用；中濃度組對Ad3病毒有明顯的抑制作用，對HSV-Ⅰ和RSV病毒有一定的抑制作用；低濃度組對HSV-Ⅰ、RSV和RSV均有一定的抑制作用。說明高濃度組對三種病毒的抑制作用與陽性藥物組的抑制作用相當(dāng)。

圖3 復(fù)方板藍(lán)根顆粒提取物的液相色譜圖(a)和正離子模式(b)、負(fù)離子模式(c)下的總離子流圖 Fig.3 LC chromatogram (a), positive TIC (b) and negative TIC (c) of the extract from Compound Indigowoad Root Granule

表4 復(fù)方板藍(lán)根顆粒提取物的LC-APCI-MSn數(shù)據(jù)Table 4 LC-APCI-MSn data of the extracts from Compound Indigowoad Root Granule

續(xù)表4

注：*表示化合物3、8、9和11分別與相應(yīng)的對照品具有相同的保留時(shí)間、質(zhì)荷比和MS2譜

表5 復(fù)方板藍(lán)根顆粒提取物對HSV-Ⅰ、RSV和Ad3病毒的抑制作用情況Table 5 Effects of the extracts from Compound Indigowoad Root Granule on HSV-Ⅰ,

注：與完全病毒感染組比較，*表示P<0.05，**表示P<0.01

3 結(jié)論

本研究建立了復(fù)方板藍(lán)根顆粒APCI-MS指紋圖譜分析方法，不同產(chǎn)地的板藍(lán)根和大青葉配伍后制成的復(fù)方板藍(lán)根顆粒提取物的APCI-MS指紋圖譜具有較高的相似度，這說明了板藍(lán)根和大青葉藥材的同源性以及配伍后化學(xué)成分的相似性。該方法的精密度、穩(wěn)定性和重現(xiàn)性良好，且樣品制備簡單、分析速度快，可作為復(fù)方板藍(lán)根顆粒的質(zhì)量評價(jià)方法，同時(shí)也可為深入研究復(fù)方板藍(lán)根顆粒的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)和譜效關(guān)系提供理論依據(jù)。

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Fingerprint Chromatograms and Chemical Components ofCompoundIndigowoadRootGranuleby APCI-MS and LC-APCI-MSn

YAN Jun1, LIU Shu2, LI Bo-ping1, LIU Zhi-qiang2, GUO Dong-fa1

(1.BeijingResearchInstituteofUraniumGeology,Beijing100029,China;2.ChangchunInstituteofAppliedChemistry,ChineseAcademyofSciences,Changchun130022,China)

A method of atmospheric pressure chemical ionization mass spectrometry (APCI-MS) was established for analyzingCompoundIndigowoadRootGranuleextract, and the main peaks in the fingerprints were confirmed by high performance liquid chromatography coupled to mass spectrometry hyphenated (LC-APCI-MSn). The fingerprint analysis was based on the atmospheric pressure chemical ionization ion source (APCI) with the positive mode. The separation was performed on a Kromasil C18 column (4.6 mm×25.0 mm×5 μm) under 25 ℃ with linear gradient elution of methanol (containing 0.15% acetic acid)-water as mobile phase at a flow rate of 0.8 mL/min. The detector is full wavelength ultraviolet detector (DAD) with the detection wavelength of 254 nm. Mass spectrometry analysis was required for atmospheric pressure chemical ionization ion source (APCI) with both positive and negative ions detection modes. Mass spectrometry fingerprint identified 10 common peaks from 10 batches of different sources ofCompoundIndigowoadRootGranuleextracts and the results showed that the similarities of each extract was covered over 97%. A total of 12 chemical compounds, including indoles, quinazolinones organic acids and porphyrins were identified using LC-APCI-MSn, and 5 common fingerprint peaks were identified. Pharmacodynamical studies have revealed that extracts ofCompoundIndigowoadRootGranuleown certain anti-viral activities. Hense, owing to its high precision, stability and reproducibility, the fingerprint method inCompoundIndigowoadRootGranuleis important and indispensable in the foundation of quality control standards as well as the further research in the relationships of material basis and spectrum effect.

CompoundIndigowoadRootGranule; fingerprint chromatograms; liquid chromatography-atmosphere pressure chemical ionization-mass spectrometry (LC-APCI-MSn); anti-viral activity

2016-04-07;

2016-06-10

閆 峻(1982—)，男(漢族)，吉林通化人，高級工程師，從事中藥及天然產(chǎn)物化學(xué)成分和質(zhì)量控制研究。E-mail: cnncyanjun@163.com

O657.6

A

1004-2997(2016)03-0320-08

10.7538/zpxb.youxian.2016.0057