吳一飛，韋露莎，陳 輝

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)林學(xué)院，陜西 楊凌 712100；2.陜西師范大學(xué)食品工程與營養(yǎng)科學(xué)學(xué)院，陜西 西安 710119)

基于FPLC-LC-MS/MS分析嗜鹽古菌Haloarculahispanica胞內(nèi)類泛素化底物

吳一飛1，韋露莎2，陳 輝1

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)林學(xué)院，陜西 楊凌 712100；2.陜西師范大學(xué)食品工程與營養(yǎng)科學(xué)學(xué)院，陜西 西安 710119)

本研究結(jié)合SLIC克隆技術(shù)和快速蛋白質(zhì)液相色譜-高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(FPLC-LC-MS/MS)法，對嗜鹽古菌Haloarculahispanica類泛素蛋白ThiS的泛素化底物和綴合位點進行鑒定分析。采用SLIC克隆法構(gòu)建類泛素蛋白ThiS表達質(zhì)粒/整合質(zhì)粒，經(jīng)轉(zhuǎn)染后的菌株在DMSO呼吸作用誘導(dǎo)下表達并純化His6-ThiS蛋白綴合體。通過SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分析，質(zhì)粒型類泛素ThiS的表達遠遠高于基因型菌株的表達量，而通過定點突變，將ThiS的第89號位點突變成賴氨酸K和精氨酸R，進而使用胰蛋白酶對ThiS肽段上的賴氨酸殘基-雙甘氨肽標(biāo)簽進行酶切處理，采用LC-MS/MS法鑒定其底物和底物修飾位點。鑒定得到鉬喋呤合成酶MoaE，蛋氨酸亞砜還原酶MsrA和其同系物MsrB，以及Fe-S簇組裝蛋白SufB等4種底物蛋白。該方法通過結(jié)合蛋白位點突變和質(zhì)譜檢測，能夠準(zhǔn)確、有效地檢測泛素/類泛素蛋白的修飾底物及其修飾位點，為深入泛素的生物性功能研究提供了切入點。

類泛素；LC-MS/MS；SLIC克隆；嗜鹽古菌；蛋白綴合

泛素(Ubiquitin, Ub)作為蛋白修飾已得到廣泛的研究，其主要職能是識別并鎖定目標(biāo)蛋白底物，并將底物蛋白運送至蛋白酶體處進行回收[1-3]。當(dāng)細胞體內(nèi)泛素化底物不能被蛋白酶水解時，則會引起包括膜泡蛋白運輸異常、染色質(zhì)傳遞動力變化、DNA修復(fù)、多亞基化合物中的蛋白提取功效變化等一系列的影響[4-5]。Ub的多樣性功能對于真核及原核生物而言是必不可少的，但由于真核細胞的高度進化性，多種生化通路的交叉會干擾研究者對Ub/Ubl本身的探究。因此根據(jù)Ub/Ubl蛋白的高度保守性[6]，本實驗將以嗜鹽古菌Haloarculahispanica的Ubl蛋白ThiS作為研究對象，通過研究ThiS化綴合作用，來解釋和映射真核生物Ub相應(yīng)的生物功能。

ThiS是嗜鹽古菌H.hispanica中一種重要的Ubl蛋白，其泛素化過程和蛋白酶體通路是調(diào)控細胞內(nèi)蛋白質(zhì)水平和消除錯誤折疊蛋白的重要機制，它參與細胞多種生理功能調(diào)控[7]，該反應(yīng)體系與真核細胞泛素～蛋白酶體通路有著高度相似性[8-9]。在H.hispanica細胞中，對ThiS及其底物的鑒定是基于其β-grasp折疊的三級結(jié)構(gòu)開展的，由于ThiS具有C端雙甘氨肽(diGly)基序，并以異肽鍵的形式綴合到目標(biāo)蛋白上，進而能夠與目標(biāo)蛋白賴氨酸殘基形成ε-氨基酸組[10-11]。與泛素化相似，整個ThiS化通路是由E1-like MoaB酶(或ELSA酶)在依賴ATP參與的情況下進行的[12]。本實驗將采用蛋白標(biāo)記法，對H.hispanica的Ubl蛋白ThiS進行純化分離，在胰蛋白酶酶切處理下，采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)法分析泛素化底物蛋白成分，并鑒定其泛素化位點，希望進一步為類泛素-蛋白酶體反應(yīng)體系提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)[13-15]。

SLIC(one-step sequence-and ligation independent cloning)克隆法作為一種簡便、高效、省時的方法，被越來越多地運用在基因定點突變和基因敲除中[16]。其特點是在室溫環(huán)境下將限制性酶切或者反式PCR制備的目的線性互補基因片段(≥15 bp)與載體混合，使用T4 DNA聚合酶將兩者連接，可以有效避免由于堿基數(shù)巨大的質(zhì)粒在反式PCR反應(yīng)中所產(chǎn)生的錯誤堿基配對[17-18]。

目前在伴生蛋白或結(jié)合蛋白的結(jié)構(gòu)研究中，快速蛋白質(zhì)液相色譜-高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(FPLC-LC-MS/MS)已逐漸成為核心的研究方法[19-20]，但其分析結(jié)果很難達到絕對穩(wěn)定的狀態(tài)，這與蛋白的純化分離、儀器的差異性相關(guān)[21]。因此，在該方法的高度可靠性的前提下，擬通過增加生物學(xué)重復(fù)來提高數(shù)據(jù)的可靠性。

1 實驗部分

1.1 主要材料與試劑

生化試劑(蛋白胨、蛋白酶抑制劑等)：美國Sigma-Aldrich公司產(chǎn)品；其他分析級有機/無機化學(xué)試劑(如二甲基亞砜、Tris等)：美國Fisher Scientific公司和Bio-Rad公司產(chǎn)品；Phusion和Taq DNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶、T4多核苷酸和T4連接酶：美國New England Biolabs公司和美國Bioline公司產(chǎn)品；Hi-Lo DNA標(biāo)準(zhǔn)品：美國Minnesota Molecular公司產(chǎn)品；脫鹽寡核苷酸：美國Integrated DNA Technologies公司產(chǎn)品；胰蛋白酶：美國Promega公司產(chǎn)品；牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)品：美國MP biomedical公司產(chǎn)品；聚偏二氟乙烯膜(PVDF)：美國Amersham公司產(chǎn)品；α-His6單克隆抗體：美國Sigma公司產(chǎn)品；SDP-sta：美國Applied Biosystems公司產(chǎn)品。

1.2 儀器與軟件

3130型基因分析儀：美國Applied Biosystems公司產(chǎn)品；細胞破碎儀：美國 Thermo公司產(chǎn)品；快速蛋白液相色譜Biologic DuoFlow 10系統(tǒng)：美國Bio-Rad公司產(chǎn)品；Ni-NTAagarose和Strep-Tactin Superflow 長效親和柱料：德國Qiagen公司產(chǎn)品；Eksigent nano LC Ultra液相色譜儀：美國AB sciex公司產(chǎn)品；X光檢測儀：美國Amersham Biosciences公司產(chǎn)品；質(zhì)譜數(shù)據(jù)使用英國Matrix Science公司的Mascot軟件(2.4.0版)和美國Proteome Software公司的Scaffold軟件(4.0版)處理。

1.3 供試菌株和培養(yǎng)基

大腸桿菌(EscherichiacoliTop10 和EscherichiacoliGM2163)，嗜鹽古菌H.hispanicaY27號及其基因敲除型號和所用質(zhì)粒列于表1，實驗所用引物列于表2。其中E.coliTop10被用來分離新構(gòu)建的質(zhì)粒pCD15，E.coliGM2163被用來復(fù)制質(zhì)粒pCD15及pCD63，保證質(zhì)粒的甲基化處理，并且隨后轉(zhuǎn)化到H.hispanica細胞中。在大腸桿菌(Escherichiacoli)和古菌(Haloarculahispanica)培養(yǎng)實驗中，分別采用LB(Luria-Bertani)固/液培養(yǎng)基(含氨芐霉素0.1 g/L，pH 6.8)，YPC液體培養(yǎng)基(pH 6.5)和ATCC974固/液培養(yǎng)基(含新生霉素0.1 mg/L，100 mmol/L DMSO，pH 6.8)[6]。

表1 菌株和質(zhì)粒Table 1 Strains and plasmid

注：*來自本工作SLIC克隆法構(gòu)建

表2 研究所用引物Table 2 Primers used in this study

1.4 實驗方法

1.4.1 SLIC克隆法對載體的構(gòu)建 本實驗以H.hispanicaY27基因組為模板，通過Inv-PCR對ThiS基因進行擴增。在室溫條件下，將插入片段與載體按 1∶4，使用0.4 U的T4 DNA聚合酶構(gòu)建整合質(zhì)粒pCD63，以提高質(zhì)粒構(gòu)建的高效性和準(zhǔn)確性[16]。插入的His6-ThiS基因片段兩側(cè)都應(yīng)具備一個不小于15 bp的延伸堿基序列，保持該序列與線性載體插入端的兩側(cè)同源，期間使用限制性內(nèi)切酶DraIII和HindIII對載體質(zhì)粒進行線性化處理，最后使用膠回收移除雜帶基因。PCR產(chǎn)物通過基因分析儀對DNA序列進行Sanger自動化測序。

1.4.2 樣品的制備 從H.hispanica菌株YW104(His6-ThiS S89K)和YW106(His6-ThiS S89R)中表達具有N端His6標(biāo)簽的ThiS蛋白，包括ThiS綴合的大量蛋白底物復(fù)合體，在含有0.1 g/L 氨芐西林和0.1 mg/L 新生霉素的250 mL ATCC974液體培養(yǎng)基中進行震蕩搖床培養(yǎng)(200 r/min；42 ℃)。待細胞生長至平臺期(OD600≈2.5)時進行離心分離(4 500 g，15 min，4 ℃)，離心過程中需加入15 mL低鹽緩沖液(50 mmol/L Tris pH 7.5，2.8 mol/L NaCl)。將離心收集的細胞在高鹽濃度裂解液中以每5 mL/g進行重懸(含2.8 mol/L NaCl，1%Triton X-100，1 mmol/L EDTA，5 mg/L核酸酶，0.5 g混合蛋白酶抑制劑，Tris-HCl(50 mmol/L，pH 7.4))，在French Press細胞破碎儀中以1.38×104kPa高壓進行3～4次細胞破碎處理。細胞裂解液在13 000 g，25 min，4 ℃條件下高速離心。使用His6親和柱色譜純化分離ThiS及其綴合蛋白，不同蛋白組分進行2～4次的純化和分裝，并儲存于-80 ℃，備用。使用Bradford試劑盒測定蛋白濃度：向10 μL蛋白樣品中加入20 μL Bradford試劑，再加入dH2O至100 μL，可依據(jù)顏色變化情況對樣品進行篩選。采用二喹啉甲酸BCA對其進行定量分析，使用96孔板，加入原濃度、稀釋10倍和100倍的25 μL蛋白樣品，與100 μL BCA 溶液(A∶B=50∶1)混合，在OD562nm下檢測蛋白濃度值，牛血清蛋白作為蛋白標(biāo)品進行對照。向蛋白樣品溶液中加入5 μL 200 mmol/L DTT，在95 ℃條件下處理5 min；然后將溫度降至55 ℃，處理40 min；待樣品冷卻至室溫后，加入1 μL 1 mol/L CAA，避光條件下室溫孵育1 h；最后添加20 μL 200 mmol/L DTT，室溫下對樣品進行45 min淬火處理，以避免蛋白樣品的賴氨酸烴化；在4 ℃ dH2O中隔膜透析除鹽12 h，37 ℃條件下胰蛋白酶酶切處理16 h(胰蛋白酶∶樣品=1∶50，質(zhì)量比)。

1.4.3 免疫印記 蛋白樣品在SDS上樣緩沖液(100 mmol/L Tris-Cl，含2%SDS和10%甘油，0.6 g/L溴酚藍和2.5%β-巰基乙醇，pH 6.8)中煮10～15 min。用12% SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳和電印記轉(zhuǎn)膜法(PVDF膜，0.5 μm)檢測蛋白樣品，每個電泳孔上樣等量的蛋白樣品(OD600=0.065和蛋白濃度測定BCA)。免疫印跡使用α-His6單克隆抗體、化學(xué)發(fā)光劑CDP-star和X光顯影檢測；蛋白定量使用蛋白膠考馬斯亮藍染色45～60 min。

1.4.4 色譜條件 色譜柱：LC Packing?C18 Pep柱(75 μm×150 mm×5 μm)；流動相：A為H2O(含0.1%甲酸和3%乙腈)，B為乙腈(含0.1%甲酸和3%H2O)；洗脫梯度：0～5 min、3%A，5～10 min、3%～10%A，10～30 min、10%～60%A；流速300 μL/min。將酶切處理的蛋白樣品注入色譜柱，在3 μL/min流速下用0.1%甲酸脫鹽處理5 min。

1.4.5 質(zhì)譜條件 電噴霧離子源，電噴霧電壓為2 200 V，質(zhì)譜分辨率為60 000，質(zhì)量掃描范圍m/z300～2 000。在上述條件下對軌道離子阱內(nèi)的蛋白樣品進行掃描，其中最不活躍的10種離子被碰撞誘導(dǎo)解離(CID)。串聯(lián)質(zhì)譜的動態(tài)排除設(shè)定為60 s。所有的質(zhì)譜樣品使用Mascot和Scaffold軟件處理，Mascot用來搜索HAH(H.hispanica基因編碼)，并對所有被胰蛋白酶所酶切降解的肽段分子質(zhì)量進行分析。Mascot軟件設(shè)定的子離子碎片誤差為0.8 u，母離子誤差為15×10-6。Mascot軟件對Cys的碘乙酰胺派生作用，Asn和Gln的脫酰胺作用和Met的氧化等多種修飾都做了詳細記錄。使用Scafold驗證MS/MS處理的肽段和蛋白信息，通過Peptide Prophet軟件對可能性大于95.0%的多肽進行確認， 蛋白的識別需具備可能性大于95.0%并擁有2個唯一獨特肽段這兩項條件。

2 結(jié)果和分析

2.1 ThiS基因的克隆、鑒定與表達載體構(gòu)建

根據(jù)NCBI公布的ThiS基因序列(GI:11049545)設(shè)計的特異性引物已列于表2。上游引物ThiS FW和下游引物ThiS RV擴增ThiS基因，使用SLIC法構(gòu)建表達質(zhì)粒pCD12和整合質(zhì)粒pCD63；以pCD12為模板對ThiS進行定向突變，得到ThiS S89K和ThiS S89R，在此過程中，使用反式PCR對ThiS基因N端添加His6標(biāo)簽。在載體構(gòu)建過程中，分別使用KpnI和BlpI、PflMI和NheI雙酶切位點。將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至E.coliTop10中，于LB培養(yǎng)基(AMP，100 mg/L)過夜培養(yǎng)，接種于5 mL液體LB培養(yǎng)基中生成12 h，提取質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至E.coliGM2163中進行質(zhì)粒的甲基化處理。參照Halohandbook[22]方法將甲基化處理的表達質(zhì)粒和整合質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至H.hispanicaY27菌株中，進行His6-ThiS的細胞內(nèi)表達。

圖1 在DMSO呼吸作用下，H.hispanica不同表現(xiàn)型的生長曲線比較(48 h)Fig.1 Growth curves of different types of H.hispanica with DMSO respiration in 48 h

2.2 His6-ThiS蛋白的類泛素修飾表達

為了確保質(zhì)粒在添加了N端His6標(biāo)簽后的ThiS基因型和質(zhì)粒型在DMSO呼吸作用下依然保持功能的完整性，生長曲線實驗將6種菌株在相同條件的YPC培養(yǎng)基(100 mmol/L DMSO，pH 6.8)中培養(yǎng)54 h，以6 h為間隔，在OD600波長下檢測菌株的生長。6種菌株分別為野生型Y27、His6-ThiS、His6-ThiS S89K、His6-ThiS S89R、His6-ThiS基因型菌株，ΔThiS基因缺陷型菌株作為對照。從圖1可知，質(zhì)粒與基因組表達的His6-ThiS與野生型菌株Y27的生長趨勢沒有明顯差別，ΔThiS菌株生長受到了抑制，原因是ThiS在DMSO誘導(dǎo)下合成DMSO還原酶以確保菌株能夠進行無氧呼吸，但ΔThiS菌株的基因缺失造成了細胞在YPC培養(yǎng)基中無法生長。將質(zhì)粒和基因組表達的ThiS菌株在ATCC974培養(yǎng)基中培養(yǎng)48 h(4 ℃，200 r/min)并收集，通過SDS-PAGE對細胞裂解液進行蛋白分離，結(jié)果示于圖2。

圖2 質(zhì)粒型與基因型His6-ThiS的蛋白綴合對比圖Fig.2 Comparison of His6-ThiS conjugation from genome and plasmid expression

圖3 His6-ThiS突變體的蛋白綴合對比圖Fig.3 Comparison of His6-ThiS variant conjugation via plasmid expression

從圖2可知，在DMSO呼吸作用的誘導(dǎo)下，質(zhì)粒型ThiS的泛素化表達量比基因型高，這一差異源自植入的表達質(zhì)粒中含有一個高效的rRNA P2啟動子，比基因組上的天然啟動子具有更好的催化能力。

His6-ThiS突變體的蛋白綴合對比示于圖3。可見，野生型ThiS與ThiS S89K的蛋白表達量相似，而ThiS S89R表現(xiàn)出更多的富集，在28、43和100～75 kDa之間的位置均能檢測到額外的綴合條帶，蛋白表達量明顯增加。這為后期利用LC-MS/MS法分析ThiS的蛋白綴合，選擇與野生型差別較小的ThiS S89K菌株提供了較為理想的參考。

2.3 ThiS綴合底物的LC-MS/MS分析

通過3次生物學(xué)重復(fù)對ThiS化綴合位點進行測定，樣品在胰蛋白酶酶切處理后進行LC-MS/MS分析，經(jīng)Scaffold軟件分析，可以發(fā)現(xiàn)ThiS的C端的甘氨酸G91以異構(gòu)肽方式與多個底物蛋白的Lys殘基發(fā)生綴合，由ThiS化修飾產(chǎn)生了114.1 Da的GlyGly指紋圖譜，結(jié)果示于圖4～7，具體綴合位點列于表3。其中MoaE(K153、K254、K261和K262)，SufB(K350)，MsrA(K169)和MerB(K120)的序列覆蓋率分別為78%，38%，46%和62%。雖然余下大部分蛋白未經(jīng)雙甘氨肽修飾，但大部分蛋白都被脫酰胺化(如 SufD、硫氧還原蛋白-二氧化硫還原酶)或被氧化(如核糖-1,5-二磷酸異構(gòu)酶)。

通過MS/MS分析，底物蛋白MPT和酶MoaE在ThiS化過程中被多重修飾；而底物蛋白中具有單一ThiS化修飾的蛋白包括Fe-S簇組裝蛋白SufB、蛋氨酸亞砜還原酶MsrA和其同源體MsrB。雖然蛋氨酸亞砜還原酶MsrA與MsrB的主要氨基酸序列相似度不高，但具有鏡像的活性位點，可以通過還原蛋氨酸亞砜(S和R差向異構(gòu))殘基修復(fù)氧化蛋白，形成次磺酸中間體，生成蛋氨酸[23]。

3 結(jié)論

本研究建立了類泛素蛋白ThiS綴合底物及其底物綴合位點的FPLC-LC-MS/MS分析方法，一級質(zhì)譜得到底物多肽分子離子，選取目標(biāo)肽離子作為母離子，與惰性氣體碰撞，使肽鏈中的肽鍵斷裂，形成N端碎片b型離子系列和C端碎片y型離子系列，通過對這些碎片離子綜合分析得到肽段的氨基酸序列。實驗還發(fā)現(xiàn)，質(zhì)粒表達的ThiS蛋白修飾量比基因組的表達量高，在DMSO誘導(dǎo)作用下可為后期的分析提供更豐富的綴合蛋白，對關(guān)鍵位點的氨基酸置換使得底物蛋白與ThiS分離，使雙甘氨肽(114 Da)得以保留在底物蛋白的賴氨酸殘基上。通過對雙甘氨肽的追蹤可以得到一系列底物肽的相對豐度及質(zhì)荷比(m/z)，進而得到一系列關(guān)鍵的生物學(xué)數(shù)據(jù)。而泛素～蛋白酶體的蛋白降解通路作為最廣泛的生物代謝進程，使得本方法可以得到廣泛的利用，并且有望為蛋白綴合研究提供便利條件。

圖4 diGly修飾的MoaE綴合位點的MS/MS圖Fig.4 MS/MS spectra of MoaE ThiSylation sites modified by diGly

圖5 diGly修飾的MsrA綴合位點的MS/MS圖Fig.5 MS/MS spectra of MsrA ThiSylation sites modified by diGly

圖6 diGly修飾的MsrB綴合位點的MS/MS圖Fig.6 MS/MS spectra of MsrB ThiSylation sites modified by diGly

圖7 diGly修飾的SufB綴合位點的MS/MS圖Fig.7 MS/MS spectra of SufB ThiSylation sites modified by diGly

表3 質(zhì)粒型His6-ThiS菌株表達純化的LC-MS/MS分析蛋白綴合底物列表Table 3 List of His6-ThiS conjugation sites by LC-MS/MS

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Conjugation and Substrate Research of Tagged Ubiquitin-Like ProteininvivoofHaloarculahispanicabased on FPLC-LC-MS/MS

WU Yi-fei1, WEI Lu-sha2, CHEN Hui1

(1.CollegeofForestry,NorthwestA&FUniversity,Yangling712100,China；2.CollegeofFoodEngineeringandNutritionalScience,ShaanxiNormalUniversity,Xi’an710119,China)

The method of one-step sequence- and ligation-independent cloning (SLIC) combined with FPLC-LC-MS/MS was adopted to find out the substrate protein which modified byHaloarculahispanica’s ubiquitin-like protein ThiSinvivo. AN-terminal His6tag has been added to the ThiS with DMSO respiration to format multiple ubiquitylation conjugations. Based on SDS-PAGE analysis, the expression level of ubiquitylaion from plasmid is much higher than genome. From site mutation, the amino acid 89 of ThiS has been mutated from Serine to Lysine/Arginine. The purified ubiquitylation conjugation protein has been split up by trypsin and the modification sites were identified by LC-MS/MS analysis of GlyGly signatures(114 Da) on lysine side-chains of tryptic peptides derived from ThiS. The results show that the conjugates substrates of ThiS include 4 target proteins: MoaE, MsrA, MsrB and Fe-S cluster assembly protein SufB. Follow-up affinity purification of selected protein targets (Fe-S and MoaE) confirmed the LC-MS/MS results. This method combining the amino acid site mutation and MS/MS analytical approach is efficient and accurate for the detection of Ub/Ubl modification substrate protein, including the substrate conjugation site. This research can provide basic knowledge for the future study of ubiquitin/ubiquitin-like protein function in eukaryote cell.

ubiquitin-like protein; LC-MS/MS; SLIC (one-step sequence- and ligation-independent cloning); archaeal; protein conjugation

2016-04-05;

2016-07-15

國家自然科學(xué)基金(31670658)資助

吳一飛(1985—)，男(漢族)，陜西人，博士研究生，森林保護學(xué)專業(yè)。E-mail: yifeiwu53@163.com

陳 輝(1961—)，男(漢族)，甘肅人，教授，從事野生動植物保護與利用和森林保護學(xué)研究。E-mail: chenhui@nwsuaf.edu.cn

O657.63

A

1004-2997(2017)03-0272-10

10.7538/zpxb.youxian.2016.0070