張 娜 徐基貴* 談勝福 汪 麗 張克營(yíng) 王 聰 楊柳青

(1 宿州學(xué)院 化學(xué)化工學(xué)院,安徽 宿州 234000；2 宿州學(xué)院 體育學(xué)院，安徽 宿州 234000)

氧化鋯/聚亞甲基藍(lán)修飾電極檢測(cè)CaMV35S啟動(dòng)子基因

張 娜1徐基貴1*談勝福1汪 麗1張克營(yíng)1王 聰1楊柳青2

(1 宿州學(xué)院 化學(xué)化工學(xué)院,安徽 宿州 234000；2 宿州學(xué)院 體育學(xué)院，安徽 宿州 234000)

制備了基于氧化鋯(ZrO2)/聚亞甲基藍(lán)(PMB)修飾電極的無(wú)標(biāo)記DNA傳感器，用于轉(zhuǎn)基因植物CaMV35S啟動(dòng)子基因的檢測(cè)。探針DNA(ssDNA)通過(guò)ZrO2和DNA的磷酸基的相互作用修飾到電極表面，以PMB氧化峰的示差脈沖伏安響應(yīng)為檢測(cè)信號(hào)，傳感器和完全互補(bǔ)的DNA片段雜交后，PMB的氧化峰電流明顯降低，當(dāng)和完全不匹配的DNA片段雜交時(shí)，峰電流無(wú)明顯變化。對(duì)于完全互補(bǔ)的DNA片段，在2.0×10-12～2.0×10-8mol/L濃度范圍內(nèi)峰電流的變化值和濃度的對(duì)數(shù)成良好的線(xiàn)性關(guān)系，檢測(cè)限為4.1×10-13mol/L(S/N=3)。所制備的傳感器具有良好的穩(wěn)定性、再生性和重現(xiàn)性，用于樣品檢測(cè)，結(jié)果令人滿(mǎn)意。

聚亞甲基藍(lán)；氧化鋯；DNA傳感器；無(wú)標(biāo)記

前言

轉(zhuǎn)基因食品是近些年興起的一類(lèi)食品，轉(zhuǎn)基因從一開(kāi)始就引起了學(xué)界的普遍關(guān)注，轉(zhuǎn)基因食品的研究對(duì)于人們的日常生活具有重要意義。脫氧核糖核酸(DNA)是遺傳物質(zhì)信息的承擔(dān)者，具有儲(chǔ)存和傳遞遺傳信息的功能。轉(zhuǎn)基因食品的DNA片段中核苷酸堿基的特定序列決定了基因的遺傳特性，對(duì)DNA結(jié)構(gòu)的研究、特定DNA片段堿基排列順序的研究，以及DNA的突變研究對(duì)食品衛(wèi)生檢驗(yàn)和藥物篩選等方面具有十分重要的意義。利用核酸分子雜交技術(shù)檢測(cè)特定DNA序列已經(jīng)成為一個(gè)研究熱點(diǎn)[1-2]。

電化學(xué)DNA傳感器是近年來(lái)興起的一種非常優(yōu)良的生物傳感器，能夠用于檢測(cè)基因及一些能與DNA發(fā)生特殊相互作用的物質(zhì)[3-7]。聚合物以其優(yōu)良的導(dǎo)電性能成為良好的電極修飾材料[8]，在傳感器中應(yīng)用十分廣泛。更重要是導(dǎo)電聚合物對(duì)修飾電極界面性質(zhì)的改變具有極高的敏感性[9]，研究表明特定序列的DNA在電極表面雜交前后會(huì)使導(dǎo)電聚合物的電化學(xué)信號(hào)發(fā)生改變[10]。亞甲基藍(lán)(methylene blue, MB)作為一種電子媒介體，其在電極上的性能比較活潑，具有良好的電化學(xué)行為，基于電聚合方法制備的PMB修飾電極對(duì)一些生物分子具有良好的催化作用[11-13]。ZrO2是一種良好的半導(dǎo)體材料[14-15]，研究證明其能夠和DNA的磷酸基團(tuán)發(fā)生強(qiáng)的作用，能夠?yàn)镈NA在電極表面的固定提供平臺(tái)[16]。

本文制備了基于ZrO2/PMB的無(wú)標(biāo)記電化學(xué)DNA生物傳感器，研究了該修飾電極在檢測(cè)轉(zhuǎn)基因植物CaMV35S啟動(dòng)子基因中的應(yīng)用[17]，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示所制備的傳感器具有較好的選擇性和靈敏性，進(jìn)而構(gòu)建了檢測(cè)新型的轉(zhuǎn)基因植物CaMV35S啟動(dòng)子基因的新方法。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

電化學(xué)工作站CHI660D型(上海辰華儀器公司)，電化學(xué)測(cè)定使用三電極體系：裸玻碳電極和修飾電極作為工作電極，鉑電極作為輔助電極，飽和甘汞電極(SCE)作為參比電極。TG16離心機(jī)(湖南英泰儀器有限公司)，KQ5200DB型號(hào)數(shù)控超聲清洗儀(昆山市超聲儀器有限公司)。

所使用的DNA序列分別為：

探針DNA：5′-TCT TTG GGA CCA CTG TCG-3′；

完全互補(bǔ)DNA：5′-CGA CAG TGG TCC CAA AGA-3′；

完全錯(cuò)配DNA：5′- GCT TCC ATC GAG ATC GTC-3′。

磷酸緩沖鹽溶液PBS(0.1 mol/L，pH=7.0)：采用磷酸氫鈉和磷酸二氫鈉混合配制溶液,用H3PO4和NaOH調(diào)節(jié)溶液的pH值。

DNA雜交溶液：含氯化鈉(0.1 mol/L)的PBS(0.1 mol/L)，pH=7.0)。

用N2除去溶液中的氧,實(shí)驗(yàn)所需用水均為二次蒸餾水。

1.2 ssDNA/ZrO2/PMB/GCE的制備

把裸的玻碳電極使用1.0、0.3及0.05 μm Al2O3粉末打磨拋光，依次用無(wú)水乙醇、水超聲清洗1 min后，晾干。把已經(jīng)處理的玻碳電極置于含有MB(3 mmol/L)的PBS(0.1 mol/L，pH=7.0)中，在-0.6～ 0.6 V的電位范圍內(nèi)以100 mV/s的掃描速率循環(huán)伏安掃描20周，用水淋洗，制備的電極稱(chēng)為PMB/GCE。然后將該電極置于含KCl(0.1 mol/L)的氧氯化鋯(5 mmol/L)溶液中，在-1.1～0.7 mV的電位窗口內(nèi)以100 mV/s的掃描速率循環(huán)伏安掃描10周，用二次蒸餾水淋洗晾干，制備的電極稱(chēng)ZrO2/PMB/GCE。

取10 μL ssDNA(1.0×10-5mol/L)溶液滴涂到處理好的電極表面，在4 ℃的冰箱中保存12 h，依次用pH=7.0的PBS，水淋洗，去除多余的未固定ssDNA, 制備的電極稱(chēng)ssDNA/ZrO2/PMB/GCE。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

實(shí)驗(yàn)使用CHI660D電化學(xué)工作站記錄電流響應(yīng)信號(hào)。三電極系統(tǒng)分別是：以修飾電極為工作電極，SCE為參比電極，鉑絲電極為輔助電極。支持電解質(zhì)為PBS(0.1 mol/L，pH=7.0)。PMB的氧化峰電流在DNA雜交前后的變化ΔI作為DNA雜交檢測(cè)信號(hào)：△I=IdsDNA-IssDNA

IdsDNA—雜交后PMB的氧化峰電流；IssDNA—雜交前的PMB的氧化峰電流。

2 結(jié)果與討論

2.1 ZrO2/PMB/GCE的電化學(xué)表征

圖1是不同電極在PBS(0.1 mol/L，pH=7.0)和Fe(CN)63-/4-(5 mmol/L)溶液中的電化學(xué)阻抗圖(實(shí)驗(yàn)電壓0.19 V)。裸GCE(a)，PMB/GCE(b),ZrO2/PMB/GCE(c), ssDNA/ZrO2/PMB/GCE(d)。當(dāng)MB聚合到裸玻碳電極表面時(shí)，電極呈現(xiàn)良好的導(dǎo)電性，電極阻抗圖相當(dāng)于一條直線(xiàn)(b)。當(dāng)氧化鋯電沉積到PMB修飾電極的表面時(shí)，電子傳遞阻力變大(c)，這可能是由于ZrO2是半導(dǎo)體的緣故。當(dāng)ssDNA組裝到電極表面后，如圖1(d)所示，其電阻傳遞阻力變大，這可能是因?yàn)镈NA的磷酸基的負(fù)電和Fe(CN)63-/4-之間排斥作用的原因，表明修飾電極已經(jīng)成功制備。

圖1 不同電極的阻抗圖Figure 1 Impedance plots for different electrodes.

2.2 掃描速率的影響

研究了掃描速率對(duì)ZrO2/PMB/GCE 的CV響應(yīng)的影響，結(jié)果如圖2所示。在50～350 mV/s掃描速率范圍內(nèi)，PMB的氧化峰的峰電流和還原峰的峰電流隨掃速的增加，均呈良好的線(xiàn)性關(guān)系，它們的線(xiàn)性方程各自為i=1.029 6+3.508 6v，i=-1.877 4-3.020 0v，相關(guān)系數(shù)分別為R=0.990 2，R=0.991。表明該電極反應(yīng)過(guò)程為吸附控制。

圖2 掃描速率對(duì)ZrO2/PMB/GCE的CV響應(yīng)的影響Figure 2 Effects of scan rates on the CV of ZrO2/PMB/GCE responses.

2.3 雜交溫度的優(yōu)化

DNA的雜交溫度影響傳感器的檢測(cè)靈敏性，對(duì)DNA的雜交溫度進(jìn)行了優(yōu)化。圖3所示，隨著溫度的升高，△I不斷增加，當(dāng)超過(guò)50 ℃時(shí)，△I不再增強(qiáng)且有下降趨勢(shì)。因此，實(shí)驗(yàn)選擇50 ℃為最佳溫度。

圖3 雜交溫度對(duì)△I的影響Figure 3 Effects of hybridization temperatures on △I.

2.4 雜交時(shí)間的優(yōu)化

雜交時(shí)間的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)表明(圖4)：在雜交時(shí)間為5～20 min內(nèi)，△I隨著雜交時(shí)間的增加而增加。當(dāng)雜交時(shí)間超過(guò)20 min時(shí)，△I不再增加而趨于穩(wěn)定，說(shuō)明DNA的雜交達(dá)到飽和。因此，在實(shí)驗(yàn)中20 min為最佳雜交時(shí)間。

圖4 雜交溫度對(duì)△I的影響Figure 4 Effects of hybridization times on △I.

2.5 傳感器的選擇性

圖5是ssDNA/ZrO2/PMB/GCE與不同序列的目標(biāo)DNA(10-6mol/L)雜交后的差分脈沖伏安圖。由圖5可知：當(dāng)其與完全互補(bǔ)DNA序列雜交后峰電流變化最大(c)，而與完全錯(cuò)配的DNA序列雜交時(shí)，峰電流基本沒(méi)有變化。說(shuō)明該傳感器能夠區(qū)分互補(bǔ)和錯(cuò)配的DNA序列。

圖5 傳感器與不同序列的目標(biāo)DNA雜交后的差分脈沖伏安圖Figure 5 The DPV plots for the sensors hybridized with different DNAs

2.6 傳感器的線(xiàn)性范圍

圖6為△I與完全匹配DNA濃度對(duì)數(shù)之間的關(guān)系。對(duì)堿基完全互補(bǔ)但濃度不同的目標(biāo)DNA進(jìn)行雜交檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：隨著完全匹配DNA濃度的不斷增加，而產(chǎn)生的峰電流依次減小。目標(biāo)DNA的濃度(2.0×10-8、2.0×10-9、2.0×10-10、2.0×10-11、2.0×10-12mol/L)在2.0×10-12～2.0×10-8mol/L范圍內(nèi)，△I與完全互補(bǔ)DNA濃度的對(duì)數(shù)呈良好的線(xiàn)性關(guān)系。線(xiàn)性方程為ΔI=10.61+0.76 log[cDNA],相關(guān)系數(shù)R=0.9769，檢測(cè)限約為4.1×10-13mol/L(S/N=3)。

2.7 傳感器的穩(wěn)定性、重現(xiàn)性和再生性

把修飾電極放在PBS(pH 7.0)中置于冰箱內(nèi)保持4 ℃，分別放置不同時(shí)間(3、5、7 d)后，用于同濃度完全匹配的DNA檢測(cè)，與新制備的傳感器比較，檢測(cè)信號(hào)分別為原來(lái)的92.4%，89.6%，86.8%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明傳感器的穩(wěn)定性較好。同時(shí)制備4支傳感器，進(jìn)行完全匹配同濃度的DNA檢測(cè)，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差是4.5%，結(jié)果表明該傳感器有好的重現(xiàn)性。把已經(jīng)雜交的傳感器放在濃氫氧化鈉溶液中10 min后，依次用二次水、pH值為7.0的PBS淋洗后浸泡1 min，而后用于相同濃度完全匹配的DNA檢測(cè)，連續(xù)4次，檢測(cè)信號(hào)能保持為第1次的97.2%，92.5%，89.7%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明所制備的傳感器可以通過(guò)堿變性而實(shí)現(xiàn)再生。

2.8 樣品測(cè)定

實(shí)驗(yàn)中把綠色蔬菜葉汁作為干擾物質(zhì)研究所制備傳感器的實(shí)際應(yīng)用。取定量綠色蔬菜葉用二次蒸餾水清洗后，放入榨汁機(jī)中進(jìn)行處理，取定量綠色蔬菜葉汁放在離心機(jī)中以10 000 r/min的速度離心5 min，取處理后的綠色蔬菜葉汁0.5 mL放在1.5 mL的雜交溶液中，加入完全匹配的目標(biāo)DNA進(jìn)行回收率實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表1。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明該傳感器可以用于實(shí)際樣品測(cè)定，具有較好的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

表1 樣品分析結(jié)果

3 結(jié)論

本文研制了基于ZrO2/PMB/GCE的電化學(xué)DNA生物傳感器，優(yōu)化了實(shí)驗(yàn)條件，研究了傳感器在轉(zhuǎn)基因植物CaMV35S啟動(dòng)子基因檢測(cè)中的應(yīng)用。同時(shí)，制備的傳感器具有較高的靈敏性，能夠區(qū)分不同序列的DNA片段。此外，該傳感器性能較為穩(wěn)定，具有良好的選擇性和再生性。其在DNA分析中具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。

[1] 龐代文,齊義鵬,王宗禮,等.DNA的電化學(xué)研究[J].化學(xué)通報(bào)(ChemistryBulletin),1994,2 (1),1-4.

[2] 陳勇,李元宗,常文保,等.DTPA-Eu3+絡(luò)合物用于核酸雜交分析的研究[J].高等學(xué)?；瘜W(xué)學(xué)報(bào)(ChemicalJournalofChineseUniversities),1995,16 (2):184-187.

[3] 董曉婭，趙偉偉.基于納米金膜和穩(wěn)定Y型結(jié)構(gòu)的DNA電化學(xué)傳感器[J].化學(xué)學(xué)報(bào)(ActaChimicaSinica),2012,70(3):1457-1463.

[4] 張永春,楊濤.應(yīng)用納米金/TiO2中空微球復(fù)合膜高靈敏檢測(cè)轉(zhuǎn)基因植物外源基因特定DNA 序列[J].中國(guó)科學(xué)B輯:化學(xué)(ScienceinChinaSeriesB:Chemistry),2008,38(10):922-928.

[5] 劉萍，劉曉琴．非標(biāo)記型p53抑癌基因電化學(xué)DNA生物傳感器的研究[J]．分析測(cè)試學(xué)報(bào)(JournalofInstrumentalAnalysis),2011,30(7):739-744.

[6] 蔡宏,王延琴,何品剛.基于納米金膠標(biāo)記DNA探針的電化學(xué)DNA傳感器研究[J].高等學(xué)?；瘜W(xué)學(xué)報(bào)(ChemicalJournalofChineseUniversities),2003,24(8):13-15.

[7] 孫偉,尚智美,楊茂霞,等.巰基乙酸自組裝膜DNA電化學(xué)傳感器對(duì)轉(zhuǎn)基因NOS的定量檢測(cè)[J].高等學(xué)校化學(xué)學(xué)報(bào)(ChemicalJournalofChineseUniversities),2006,27(10) :1859-1861.

[8] 張華,朱壯暉,吳蕾,等.導(dǎo)電聚合物修飾的柔性神經(jīng)微電極的制備與界面性質(zhì)[J].功能材料與器件學(xué)報(bào)(JournalofFunctionalMaterialsandDevices),2010,16(5):457-464．

[9] 賀曉蕊,張秀明,林青,等.導(dǎo)電聚合物及其在生物傳感器構(gòu)建中的應(yīng)用[J].傳感器與微系統(tǒng)(TransducerandMicrosystemTechnologies),2010,29(7):4-7．

[10] ZHANG K Y,ZHANG Y Z．Lable-free electrochemical DNA sensor based on gold nanoparticles/poly(neutral red) modified electrode[J].Electroanalysis,2010,22(6):673-679.

[11] 郭新美,王宗花.多巴胺在聚亞甲基藍(lán)/石墨烯修飾電極上的電化學(xué)行為研究[J]．分析測(cè)試學(xué)報(bào)(JournalofInstrumentalAnalysis),2012,31(4):464-469.

[12] 馬艷蓉,高作寧.聚亞甲基藍(lán)修飾金電極對(duì)抗壞血酸電催化氧化及其電分析方法研究[J].分析試驗(yàn)室(ChineseJournalofAnalysisLaboratory),2008,27(1):1-4.

[13] 馬艷蓉,高作寧.聚亞甲基藍(lán)修飾金電極對(duì)過(guò)量抗壞血酸存在下尿酸的測(cè)定[J]．分析測(cè)試學(xué)報(bào)(JournalofInstrumentalAnalysis),2008,27(2):139-142.

[14] 陳靜,張娜,邢儉儉,等.普魯士藍(lán)/氧化鋯復(fù)合材料的電化學(xué)行為及對(duì)H2O2的電催化[J].中國(guó)無(wú)機(jī)分析化學(xué)(ChineseJournalofInorganicAnalyticalChemistry),2015,5(1):66-69.

[15] 謝軼,袁若,柴雅琴,等.基于DNA-Hb修飾的聚合二氧化鋯/金電極過(guò)氧化氫生物傳感器的研究[J],化學(xué)傳感器(ChemicalSensor),2008,28(2):32-38．

[16] ZHANG W, YANG T, JIANG C, et al. DNA hybridization and phosphinothricin acetyltransferase gene sequence detection based on zirconia/nanogold film modified electrode[J].AppliedSurfaceScience,2008, 254(15):4750-4756.

[17] 張娜,張克營(yíng),王聰,等.氧化鋯/聚中性紅電化學(xué)DNA傳感器用于轉(zhuǎn)基因植物CaMV35S啟動(dòng)子基因序列的測(cè)定[J].分析試驗(yàn)室(ChineseJournalofAnalysisLaboratory),2014,33(7):808-811.

Preparation of Label-free Electrochemical CaMV35S Transgene Gene Sensor Based on ZrO2/Poly(methelene blue) Modified Electrode

ZHANG Na1, XU Jigui1*, TAN Shengfu1, WANG Li1, ZHANG Keying1, WANG Cong1, YANG Liuqing2

(1.DepartmentofChemistryChemicalEngineering,SuzhouUniversity,Suzhou,Anhui234000,China；2.DepartmentofPhysicalEducation,SuzhouUniversity,Suzhou,Anhui234000,China)

A ZrO2/poly(methelene blue) modified electrode was fabricated as a label-free DNA sensor used for CaMV35S transgene gene detection. Probe oligonucleotides (ssDNA) were immobilized on the ZrO2thin films via the strong affinity between ZrO2and phosphate groups. The changes of peak current of poly(methelene blue) were used as the detection signal.It was found that when the sensor hybridized with complementary target ssDNA, an obvious decrease of PMB oxidation peak currents was observed, whereas no obvious change of PMB oxidation peak currents was observed when the probe hybridized with non-complementary target ssDNA.For the completely complementary target ssDNA sequence, in the concentration range of 2.0×10-12—2.0×10-8mol/L,the change of peak current has a good linear relationship with the logarithm of the concentration of complementary target ssDNAwith thethe detection limit of 4.1×10-13mol/L (S/N=3).In addition, the sensor also exhibited an excellent stability, reproducibilityand repeatibility. Itwas applied to determine CaMV35S transgene gene sequencewith satisfactory results.

poly(methelene blue);ZrO2; DNA biosensor; label-free

10.3969/j.issn.2095-1035.2017.02.019

2016-10-08

2017-01-25

安徽省高校自然科學(xué)基金項(xiàng)目(KJ2017AA4341)；宿州學(xué)院優(yōu)秀青年人才支持項(xiàng)目(SZXYQNL2017001)；宿州學(xué)院科研平臺(tái)開(kāi)放課題(2011YKF03，2015YKF16)；國(guó)家大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)項(xiàng)目(201510379037)；省級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練項(xiàng)目(201510379051)；宿州學(xué)院大學(xué)生科研立項(xiàng)(KYLXLKYB16-04)資助

張娜，女，講師，主要從事電分析化學(xué)研究。

*通信作者：徐基貴，男，教授，主要從事化學(xué)研究。E-mail：szxyzn@163.com

O657.15；TH832.4

A

2095-1035(2017)02-0078-05

本文引用格式：張娜,徐基貴,談勝福,等.氧化鋯/聚亞甲基藍(lán)修飾電極檢測(cè)CaMV35S啟動(dòng)子基因[J].中國(guó)無(wú)機(jī)分析化學(xué),2017,7(2):78-82.

ZHANG Na,XU Jigui, TAN Shengfu, et al. Preparation of Label-free Electrochemical CaMV35S Transgene Gene Sensor Based on ZrO2/poly(methelene blue) Modified Electrode[J].Chinese Journal of Inorganic Analytical Chemistry,2017,7(2):78-82.