韓駿飛，李明軍，孫凌峰，王崇禧

(佳木斯大學附屬第一醫(yī)院，黑龍江 佳木斯 154003)

大鼠在不同力度打擊造成彌漫性軸索損傷后腦脊液NGF的表達①

韓駿飛，李明軍，孫凌峰，王崇禧

(佳木斯大學附屬第一醫(yī)院，黑龍江 佳木斯 154003)

目的：探究大鼠腦脊液中神經(jīng)生長因子(Nervegrowthfactor,NGF)在不同力度打擊造成彌漫性軸索損傷(Diffuseaxonalinjury,DAI)后的表達及其與損傷嚴重水平的相關性。方法：選取48只SD大鼠(雌雄不限)，隨機分為A、B、C、D、E和假手術組F。在Marmarou等研究的基礎上，制作不同力度DAI模型致傷裝置，分別采用A組(砝碼懸掛高度及質(zhì)量：70cm×400g)(下同)，B組(80cm×400g)，C組(90cm×400g)，D組(100cm×400g)，E組(110cm×400g)沖擊力擊打大鼠頭部，以造出DAI模型以及F假手術組(無沖擊力損傷)，共6組。于造模成功后第24h，取腦脊液采用酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測，后處死大鼠制作腦組織標本，觀察選取符合DAI模型的大鼠腦脊液標本進行統(tǒng)計。結(jié)果：在正常大鼠腦脊液中存在NGF，且DAI后腦脊液NGF含量較正常增多，與假手術組有差別(P<0.05)；損傷后各組間也有差別(P<0.05)，隨損傷程度加重，大鼠腦脊液中NGF含量增加。結(jié)論：NGF水平與大鼠彌漫性軸索損傷的嚴重程度密切相關，NGF的水平可以作為評估DAI嚴重程度的一種方法。

彌漫性軸索損傷；神經(jīng)生長因子；酶聯(lián)免疫吸附試驗；大鼠

NGF是研究較為廣泛的神經(jīng)生長因子，通過整體實驗模型發(fā)現(xiàn)NGF作用巨大，可以保護和修復變性以及壞死的腦缺血神經(jīng)細胞[1]。NGF結(jié)合受體trkA進而產(chǎn)生作用。成熟神經(jīng)細胞的存活需要其維持，其對損傷細胞的修復有促進作用并且參與細胞凋亡。顱內(nèi)NGF的量在個體生長、衰老歷程中有著復雜的變化，可能與神經(jīng)細胞分化、功能聯(lián)系的建立和維持及衰老有密切關系。探求腦脊液及腦組織中NGF在不同力度DAI后表達的變化，目的為臨床上判斷DAI后患者損傷程度水平提供新思路。

1 材料與方法

1.1 實驗對象

選取48只SD大鼠(雌雄不限)，體重(310±10)g，不同性別大鼠隨機分成A組(砝碼懸掛高度及質(zhì)量：70cm×400g)(下同)，B組(80cm×400g)，C組(90cm×400g)，D組(100cm×400g)，E組(110cm×400g)DAI模型以及假手術組F組(無沖擊力損傷)，各組數(shù)目一致。

1.2 制作模型和相關檢測

DAI模型制作參照Marmarou等的基礎上，制作不同力度DAI模型。質(zhì)量分數(shù)為10%的水合氯醛(400mg/kg)腹腔注射麻醉后，頭頂部去毛，分離組織至骨膜暴露顱骨冠狀縫與人字縫之間的顱骨穹隆。術區(qū)安放不銹鋼墊片，移至自制致傷設備有機玻璃管正下端，使砝碼處于玻璃管中心位置。待大鼠出現(xiàn)角膜反射及刺痛反應確證蘇醒后，分別按規(guī)定的打擊高度使砝碼自由落體，打擊不銹鋼墊片后即時移走大鼠，避免再次損傷。A組(70cm×400g)、B組(80cm×400g)、C組(90cm×400g)、D組(100cm×400g)、E組(110cm×400g)以及假手術組F組(無沖擊力損傷)。大鼠打擊后，將各組大鼠分籠飼養(yǎng)，意識障礙恢復后自行進食水。于造模成功后第24h，取腦脊液采用酶聯(lián)免疫法檢測，記錄各數(shù)據(jù)后處死大鼠制作腦組織標本，觀察指標：(1)生命體征及神經(jīng)系統(tǒng)表現(xiàn)；(2)應用光學顯微鏡和透射電鏡觀察腦組織標本形態(tài)及病理學變化。選取符合DAI模型SD大鼠腦脊液標本進行統(tǒng)計。

1.3 統(tǒng)計學方法

2 結(jié)果

NGF在正常大鼠腦脊液中會有少量的存在，SD大鼠DAI后腦脊液中NGF含量均較正常增多，與假手術組有顯著差異(P<0.05)；損傷后各組間也有顯著差異(P>0.05)，隨實驗損傷程度水平加重，大鼠腦脊液中NGF含量呈增多變化，見表1。

圖1 腦脊液酶聯(lián)免疫法檢測標準曲線圖

腦脊液酶聯(lián)免疫法檢測標準曲線圖：標準品2000、1000、500、250、125、62.5、31.2、0pg/mL為橫坐標，OD值為縱坐標，在坐標紙上作圖，畫出標準曲線，見圖1。

表1 各組造模合格大鼠腦脊液NGF含量測量數(shù)據(jù)統(tǒng)計

*:與假手術組比較，P<0.05，各實驗組之間比較，P<0.05。

3 討論

彌漫性軸索損傷(diffuseaxonalinjury,DAI)，是由于外傷導致，造成顱內(nèi)神經(jīng)軸索腫脹或斷裂，軸漿外溢出現(xiàn)軸索球為特征的腦實質(zhì)損傷。在外力作用下，由于腦白質(zhì)及灰質(zhì)的密度不同而產(chǎn)生的剪應力使顱腦產(chǎn)生旋轉(zhuǎn)和/或角加速度，從而造成神經(jīng)軸索和顱內(nèi)小血管的損傷。目前臨床上判斷腦外傷造成的DAI時，多依靠影像學檢查。CT和MRI應用方便，卻不能直接客觀地辨別受損軸索的嚴重程度，且HRCT也很難分辨非出血性的病灶以及細小的出血點，現(xiàn)尚無統(tǒng)一的診斷標準[2]。這給DAI的診斷及治療方案的選擇上加大了難度。

神經(jīng)損傷修復需要兩個前提：一是內(nèi)源性神經(jīng)纖維的再生基礎；二是神經(jīng)再生的微環(huán)境。即有生長潛能的神經(jīng)元和營養(yǎng)因素及導向因素。營養(yǎng)因素包括促進因子和抑制因子。前者即為神經(jīng)營養(yǎng)因子(Neurotrophicfactors,NTFs)，包含神經(jīng)生長因子、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因素(Brain-derivedneurotrophicfactor,BDNF)、神經(jīng)營養(yǎng)因子—3、4、5、6、7(NT3、4、5、6、7)等。已確證NGF對外周以及中樞神經(jīng)元的存活和生長有重要意義，許多文章指出在神經(jīng)細胞的存活、分化、增殖及受損神經(jīng)元的退行性病變方面，NGF意義巨大[3],近來探究表明,NGF可以保障脊髓神經(jīng)元的存活，增進中樞神經(jīng)細胞的修復[4，5]。

不僅神經(jīng)細胞可以產(chǎn)生NGF，神經(jīng)膠質(zhì)細胞也可以產(chǎn)生NGF。實驗表明，正常狀態(tài)時NGF全部是由神經(jīng)細胞產(chǎn)生，但顱腦損傷后NGF含量會隨之增多，其主要來源是星形膠質(zhì)細胞(astrocyte,Ast)，Guanhua等認為顱腦損傷后由4種轉(zhuǎn)錄因子參與調(diào)控NGF的合成，這些因子主要存在于Ast中,神經(jīng)細胞則幾乎無表達，所以Ast是傷后NGF的主要來源。學者藺鐵認為推進營養(yǎng)因子的分泌，可能比神經(jīng)替代方式改善神經(jīng)功能要越發(fā)重要[6]。左右等研究制造大鼠DAI模型，發(fā)現(xiàn)采用砝碼(高度及質(zhì)量：90cm×400g)(下同)的沖擊力可建立穩(wěn)定的大鼠中度DAI模型，病理學特征明顯并且穩(wěn)定性好[7]。110cm×400g的沖擊力對大鼠損傷則相對較重，導致大鼠意識障礙的時間長，符合重度DAI的特征。本實驗選取5種力度對大鼠進行DAI造模，制作腦組織標本選取符合DAI模型的SD大鼠腦脊液標本進行研究。 周政等在實驗動物腦損傷后從基因以及蛋白表達這兩個方面上對NGF含量隨時間改變進行記錄并研究，發(fā)現(xiàn)NGFmRNA及NGF表達均增高，與對照組差別明顯[8]。NGF可以促進神經(jīng)纖維斷端的再生、保護其周圍尚未死亡的神經(jīng)細胞，對神經(jīng)纖維軸突再生有促進作用，并能促進神經(jīng)細胞的新陳代謝。根據(jù)實驗結(jié)果，推斷NGFmRNA表達的增高可能與神經(jīng)細胞的保護和修復密切相關[9]。學者劉程偉進行深入探索并發(fā)現(xiàn)NGF有協(xié)助血管修復、促進血供重新建立等作用，使臟器缺血得到緩解[10]。

在實驗選取的時間，NGF的表達與損傷程度情況具有相關性。本實驗發(fā)現(xiàn)：1、在正常大鼠腦脊液中存在NGF。2、大鼠DAI后腦脊液中NGF含量較正常增多，與假手術組有差別(P<0.05)；損傷后各組間也有差別(P<0.05)。大鼠DAI后腦損傷程度越重，NGF含量表達越多。準確認識DAI的病理變化及規(guī)律，能夠解釋部分患者的病程進展，提高診治水平。本實驗進一步證實彌漫性軸索損傷后會出現(xiàn)NGF的表達變化，并且認為NGF可能是有效協(xié)助判斷彌漫性軸索損傷嚴重程度的因素之一，今后有望對彌漫性軸索損傷復雜病理變化過程的進一步研究提供指導意義，為臨床上研究彌漫性軸索損傷的機制及診療等方面提供新的思路和方向。

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2016年佳木斯大學研究生科技創(chuàng)新項目，編號：YM2016_037。

韓駿飛(1990～)男， 黑龍江齊齊哈爾人，在讀碩士研究生。

李明軍(1965～)男，黑龍江佳木斯人，學士，主任醫(yī)師，碩士研究生導師。E-mail: 382279194@qq.com。

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