趙利鋒 程偉華 雷 達(dá) 楊彥偉 王 鋼

DKK1蛋白表達(dá)與肝內(nèi)膽管細(xì)胞癌患者淋巴結(jié)侵犯及其預(yù)后的相關(guān)性研究

趙利鋒 程偉華 雷 達(dá) 楊彥偉 王 鋼

目的 探討DKK1蛋白表達(dá)與肝內(nèi)膽管細(xì)胞癌患者淋巴結(jié)侵犯及其預(yù)后的相關(guān)性。方法 選擇2005年1月—2012年12月來(lái)我院行切除治療肝內(nèi)膽管癌患者78例，制作肝內(nèi)膽管細(xì)胞癌組織及癌旁組織的組織芯片，并于術(shù)前進(jìn)行生化指標(biāo)測(cè)定?；颊咝g(shù)后每隔3個(gè)月復(fù)查1次，并結(jié)合患者的臨床資料和病歷資料，采用Kaplan-Meier法進(jìn)行無(wú)復(fù)發(fā)生存曲線及總生存曲線的繪制，采用Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型進(jìn)行多因素分析，確定影響預(yù)后無(wú)復(fù)發(fā)生存時(shí)間(Relapse-free survival，RFS)和總生存時(shí)間(Overall survival，OS)的因素。結(jié)果 DKK1蛋白表達(dá)陰性與表達(dá)陽(yáng)性的患者間GGT、肝門(mén)淋巴結(jié)侵犯、Child-Pugh分級(jí)、MMP9差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。78例肝內(nèi)膽管細(xì)胞癌患者組織芯片結(jié)果發(fā)現(xiàn)DKK1蛋白在肝內(nèi)膽管細(xì)胞癌的陽(yáng)性表達(dá)率為35.90%(28/78)，在癌旁組織中的陽(yáng)性表達(dá)率為14.10%(11/78)。78例肝內(nèi)膽管細(xì)胞癌患者的1、3、5年的總生存率和無(wú)復(fù)發(fā)生存率分別為51.28%(40/78)與50.00%(38/78)、41.03%(32/78)與38.46%(30/78)、25.64%(20/78)與23.08%(18/78)。相關(guān)危險(xiǎn)性因素經(jīng)單因素、多因素分析后，研究結(jié)果顯示GGT、CA19-9、CEA、腫瘤大小、DKK1、肝門(mén)淋巴結(jié)侵犯是影響肝內(nèi)膽管細(xì)胞癌患者RFS的預(yù)后因素；CEA、腫瘤大小、DKK1、肝門(mén)淋巴結(jié)侵犯是影響肝內(nèi)膽管細(xì)胞癌患者DFS的預(yù)后因素。DKK1蛋白表達(dá)陽(yáng)性與陰性的OS與RFS曲線顯示，5年后肝內(nèi)膽管細(xì)胞癌患者DKK1蛋白表達(dá)陽(yáng)性與陰性的總生存率分別為28.20%與20.51%；無(wú)復(fù)發(fā)生存率分別為24.36%與21.79%。結(jié)論 肝內(nèi)膽管細(xì)胞癌患者淋巴結(jié)侵犯與否與DKK1蛋白表達(dá)密切相關(guān)，DKK1蛋白表達(dá)可能是影響肝內(nèi)膽管細(xì)胞癌患者OS和RFS的預(yù)后因素。

DKK1蛋白；肝內(nèi)膽管細(xì)胞癌；淋巴結(jié)侵犯；預(yù)后

肝內(nèi)膽管細(xì)胞癌是一種肝內(nèi)膽管細(xì)胞惡性增生性疾病，在全球范圍內(nèi)是第二常見(jiàn)的原發(fā)惡性腫瘤[1]。有報(bào)道指出，腫瘤分化、手術(shù)方式和手術(shù)部位等是其發(fā)生的危險(xiǎn)因素[2]。但是不同地區(qū)，其危險(xiǎn)因素有很大變異，如在東亞地區(qū)，此病的發(fā)病與吸蟲(chóng)感染密切相關(guān)，而在西方國(guó)家，原發(fā)性膽管硬化性炎癥是肝內(nèi)膽管細(xì)胞癌的危險(xiǎn)性因素[3]。近年來(lái)，行手術(shù)切除治療肝內(nèi)膽管細(xì)胞癌患者自然生存期僅為6～12個(gè)月，主要原因是手術(shù)切除率低，且術(shù)后高轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)率影響患者長(zhǎng)期生存[4]。所以，尋找肝內(nèi)膽管細(xì)胞癌發(fā)生以及轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)中的關(guān)鍵因素，對(duì)于改善患者預(yù)后有重要意義。DKK1作為一種分泌性蛋白，在胚胎早期發(fā)育過(guò)程中最先表達(dá)[5]。大量文獻(xiàn)報(bào)道證實(shí)，DKK1在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用[6]。Ruo等的研究表明DKK1在肝癌的侵襲與復(fù)發(fā)中發(fā)揮重要作用，并可作為預(yù)后指標(biāo)的重要預(yù)測(cè)因素[7]。本研究為探討DKK1蛋白表達(dá)與肝內(nèi)膽管細(xì)胞癌患者淋巴結(jié)侵犯及其預(yù)后的相關(guān)性，對(duì)78例肝內(nèi)膽管細(xì)胞癌患者的標(biāo)本進(jìn)行組織芯片檢測(cè)。

1 資料與方法

1.1 臨床病理資料

選擇2005年1月—2012年12月來(lái)我院行切除治療肝內(nèi)膽管癌患者78例。其中，男45例，女33例。年齡34～79歲，平均(58.21±16.96)歲，中位年齡59歲。本研究獲得我院醫(yī)學(xué)倫理學(xué)委員會(huì)批準(zhǔn)，且所有研究對(duì)象均知情同意。

1.2 納入和排除標(biāo)準(zhǔn)

納入標(biāo)準(zhǔn)：按照世界衛(wèi)生組織《肝內(nèi)膽管癌診斷標(biāo)準(zhǔn)》術(shù)前均未接受放療或化療，且術(shù)后經(jīng)病理切片染色證實(shí)肝內(nèi)膽管細(xì)胞癌[8]；切除標(biāo)準(zhǔn)符合外科腫瘤完整切除、邊緣未發(fā)現(xiàn)癌組織、局部受侵犯淋巴結(jié)清掃的標(biāo)準(zhǔn)，手術(shù)邊緣>1 cm；肝內(nèi)膽管細(xì)胞癌患者的標(biāo)本蠟塊包埋完整；隨訪資料完整準(zhǔn)確；腫瘤的分化參照Edmondson分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)[9]；腫瘤的分期參照國(guó)際抗癌聯(lián)合會(huì)第七版標(biāo)準(zhǔn)[10]。排除標(biāo)準(zhǔn)：混合型肝癌；合并其他惡性腫瘤；未獲得隨訪。

1.3 試驗(yàn)耗材及儀器

兔抗人DKK1多克隆抗體購(gòu)自Santa Cruz公司；SP免疫組化試劑盒和DAB顯色試劑購(gòu)自上海通蔚科技有限公司；3%過(guò)氧化氫、二甲苯、無(wú)水乙醇、1%鹽酸乙醇購(gòu)自北京九州天瑞科技有限公司；水溶性封片劑、蘇木素液購(gòu)自上海威奧生物科技有限公司；圖像分析儀購(gòu)自Alpha Innotech公司；光學(xué)顯微鏡、倒置顯微鏡購(gòu)自O(shè)lympus公司；-70℃冰箱購(gòu)自無(wú)錫倍斯特儀器有限公司。

1.4 組織芯片制作及判定標(biāo)準(zhǔn)

參照余杏娟等人的組織芯片設(shè)計(jì)與制作程序[11]。主要分為受體蠟塊的制作、供體蠟塊的取樣及點(diǎn)樣、組織芯片制備、切片。DKK1判定標(biāo)準(zhǔn)參照文獻(xiàn)[7]。

1.5 生化指標(biāo)測(cè)定

抽取患者術(shù)前的清晨空腹靜脈血2～10 mL，應(yīng)用深圳雷杜公司RT7200全自動(dòng)血液分析儀檢測(cè)血常規(guī)。應(yīng)用日本奧林巴斯公司AU2700型全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定乙肝表面抗原(HBsAg)、丙型肝炎病毒(HCV)、γ谷氨?；D(zhuǎn)移酶(GGT)、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、血清糖類(lèi)抗原19-9(CA19-9)、癌胚抗原(CEA)、甲胎蛋白(AFP)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子C(VEGF-C)、基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP9)等指標(biāo)。

1.6 隨訪

患者術(shù)后每隔3個(gè)月復(fù)查1次胸部X線、超聲、腫瘤標(biāo)志物(CA19-9、AFP、CEA)，若結(jié)果異常則增強(qiáng)CT或MRI復(fù)查。根據(jù)CT和MRI結(jié)果診斷是否復(fù)發(fā)，必要時(shí)行穿刺或手術(shù)確診。臨床醫(yī)師結(jié)合本院門(mén)診復(fù)查病例資料及電話進(jìn)行隨訪，隨訪至患者死亡或2015年12月31日。其中，手術(shù)至復(fù)發(fā)的時(shí)間間隔為RFS，手術(shù)至死亡或末次隨訪日期為OS。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 患者臨床特征

78例ICC患者中DKK1蛋白表達(dá)陰性47例，表達(dá)陽(yáng)性31例，DKK1蛋白表達(dá)陰性與表達(dá)陽(yáng)性的患者間性別、年齡、HBsAg、HCV、ALT、CA19-9、CEA、AFP、腫瘤大小、腫瘤分化、腫瘤數(shù)量、TNM分型、VEGF-C差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；GGT、肝門(mén)淋巴結(jié)侵犯、Child-Pugh分級(jí)、MMP9差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(表1)。

2.2 DKK1蛋白表達(dá)與肝內(nèi)膽管細(xì)胞癌臨床病理特征的關(guān)系

78例肝內(nèi)膽管細(xì)胞癌患者組織芯片結(jié)果顯示，DKK1蛋白呈棕黃色或棕褐色，染色比較均一，且DKK1蛋白定位于肝內(nèi)膽管癌細(xì)胞胞漿(圖1，圖2)。DKK1蛋白在肝內(nèi)膽管細(xì)胞癌的陽(yáng)性表達(dá)率為35.90%(28/78)，在癌旁組織中的陽(yáng)性表達(dá)率為14.10%(11/78)。

圖1 免疫組化檢測(cè)DKK1蛋白表達(dá)Figure 1 Immunohistochemical detection of DKK1 protein expressionNote：a.HE immunohistochemical staining(100×)；b，c，d and e.DKK1 protein expression from low to high in cholangiocarcinoma tissues(100×)；f.The low expression of DKK1 protein in the adjacent tissues of intrahepatic cholangiocarcinoma(100×).

圖2 DKK1蛋白表達(dá)預(yù)測(cè)肝內(nèi)膽管癌患者OS及RFS作用Figure 2 Expression of DKK1 protein in the prediction of OS and RFS in patients with intrahepatic cholangiocarcinoma

CharacteristicsDKKIproteinNegativePositivePGender0.96Male2718Female2013Age(year)0.52<4514845～601916>60147HBsAg0.61Positive3018Negative1713GGT(U/L)0.03≤542710>542021HCV1.00Positive00Negative4731ALT(U/L)0.88≤754026>7575CA19-9(U/mL)0.28≤372015>372716CEA(ng/mL)0.61≤53721>51010AFP(ng/mL)0.37≤203218>201513Tumorsize(cm)0.97≤51812>52919Tumordifferentiation0.13Ⅰ～Ⅱ3518Ⅲ～Ⅳ1213Tumorsize0.35Single3520Multiple1211Hepatichilarlymphnodeinvasion<0.01Yes715No4016Child-Pughclassification<0.01A4115B616TNMtype0.35Ⅰ～Ⅱ3520Ⅲ～Ⅳ1211VEGF-C0.28Positive3016Negative1715MMP90.02Positive3213Negative1518

2.3 DKK1的表達(dá)與肝內(nèi)膽管細(xì)胞癌患者預(yù)后的關(guān)系

78例肝內(nèi)膽管細(xì)胞癌患者的1、3、5年的總生存率和無(wú)復(fù)發(fā)生存率分別為51.28%(40/78)與50.00%(38/78)、41.03%(32/78)與38.46%(30/78)、25.64%(20/78)與23.08%(18/78)。將表1中的相關(guān)因素經(jīng)單因素、多因素分析后，研究結(jié)果顯示GGT、CA19-9、CEA、腫瘤大小、DKK1、肝門(mén)淋巴結(jié)侵犯是影響肝內(nèi)膽管細(xì)胞癌患者OS的預(yù)后因素；CEA、腫瘤大小、DKK1、肝門(mén)淋巴結(jié)侵犯是影響肝內(nèi)膽管細(xì)胞癌患者RFS的預(yù)后因素(表2)。DKK1蛋白表達(dá)陽(yáng)性與陰性的OS與RFS的生存曲線顯示，5年后肝內(nèi)膽管細(xì)胞癌患者DKK1蛋白表達(dá)陽(yáng)性與陰性的總生存率分別為29.03%(9/31)與21.28%(10/47)，差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；無(wú)復(fù)發(fā)生存率分別為25.81%(8/31)與21.28%(10/47)，差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖2)。

表2 影響肝內(nèi)膽管細(xì)胞癌患者預(yù)后的多因素分析

3 討論

目前，限制肝癌治療臨床療效的最主要瓶頸是肝癌術(shù)后轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)，而往往肝內(nèi)膽管細(xì)胞癌其根治性切除術(shù)后3、5年內(nèi)的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移者比單純肝細(xì)胞肝癌更差。肝內(nèi)膽管細(xì)胞癌患者接受手術(shù)治療后轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)很大程度上是由于瘤細(xì)胞從原發(fā)灶播散到肝內(nèi)其他部位和遠(yuǎn)處的組織及器官，是患者預(yù)后不佳的最主要原因[12]。因此，探索腫瘤轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的調(diào)控機(jī)制，尋找有效的治療方法是進(jìn)一步提高癌癥患者生存的關(guān)鍵。本研究中，DKK1蛋白表達(dá)陰性與表達(dá)陽(yáng)性的患者間性別、年齡、HBsAg、HCV、ALT、CA19-9、CEA、AFP、腫瘤大小、腫瘤分化、腫瘤數(shù)量、TNM分型、VEGF-C差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；GGT、肝門(mén)淋巴結(jié)侵犯、Child-Pugh分級(jí)、MMP9差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。研究結(jié)果表明，DKK1蛋白表達(dá)與肝內(nèi)膽管細(xì)胞癌患者淋巴結(jié)侵犯相關(guān)，發(fā)生淋巴結(jié)侵犯的患者DKK1蛋白陽(yáng)性表達(dá)率高。

組織芯片，也稱組織微陣列，是生物芯片技術(shù)的一個(gè)重要分支，是將許多不同個(gè)體組織標(biāo)本以規(guī)則陣列方式排布于同一載玻片上，進(jìn)行同一指標(biāo)的原位組織學(xué)研究[13]。該技術(shù)自1998年由Kononen等提出以來(lái)，以其大規(guī)模、高通量、標(biāo)準(zhǔn)化等優(yōu)點(diǎn)得到大范圍的推廣應(yīng)用[14]。與傳統(tǒng)方法相比較，組織芯片可保證在同一張玻片上進(jìn)行免疫組化染色，在一定程度上保證其較小的實(shí)驗(yàn)誤差，并可一次性獲取大量研究信息，使效率成百上千提高的同時(shí)縮減研究經(jīng)費(fèi)。組織芯片技術(shù)可以與其他很多常規(guī)技術(shù)如免疫組織化學(xué)、核酸原位雜交、熒光原位雜交、原位PCR等結(jié)合應(yīng)用，目前己大量應(yīng)用于腫瘤、干細(xì)胞研究中。本研究結(jié)果顯示，78例肝內(nèi)膽管細(xì)胞癌患者組織芯片的DKK1蛋白呈棕黃色或棕褐色，染色比較均一，且DKK1蛋白定位于肝內(nèi)膽管癌細(xì)胞胞漿。DKK1蛋白在肝內(nèi)膽管細(xì)胞癌的陽(yáng)性表達(dá)率為35.90%(28/78)，在癌旁組織中的陽(yáng)性表達(dá)率為14.10%(11/78)，表明DKK1蛋白高表達(dá)于肝內(nèi)膽管細(xì)胞癌組織中。

大量文獻(xiàn)報(bào)道有關(guān)于DKK1基因在腫瘤患者中的預(yù)后預(yù)測(cè)價(jià)值。Yamabuki等研究結(jié)果顯示DKK1蛋白在肺癌和食管癌中的表達(dá)是影響預(yù)后的危險(xiǎn)性因素[15]。Forget等研究結(jié)果顯示DKK1蛋白的高表達(dá)預(yù)示著激素抵抗的乳腺癌患者預(yù)后不良[16]。Yamabuki等則在食管鱗癌患者中發(fā)現(xiàn)DKK1蛋白是影響患者預(yù)后的獨(dú)立因素[15]。我國(guó)于彬等的研究則證實(shí)了DKK1蛋白的高表達(dá)預(yù)示著肝細(xì)胞肝癌患者預(yù)后不良[17]。目前，有關(guān)DKK1蛋白對(duì)肝內(nèi)膽管細(xì)胞癌中的預(yù)后價(jià)值的報(bào)道較少。本研究結(jié)果顯示，78例肝內(nèi)膽管細(xì)胞癌患者的1、3、5年的總生存率和無(wú)復(fù)發(fā)生存率分別為51.28%(40/78)與50.00%(38/78)、41.03%(32/78)與38.46%(30/78)、25.64%(20/78)與23.08%(18/78)。將相關(guān)因素經(jīng)單因素、多因素分析后，研究結(jié)果顯示GGT、CA19-9、CEA、腫瘤大小、DKK1、肝門(mén)淋巴結(jié)侵犯是影響肝內(nèi)膽管細(xì)胞癌患者RFS的預(yù)后因素；CEA、腫瘤大小、DKK1、肝門(mén)淋巴結(jié)侵犯是影響肝內(nèi)膽管細(xì)胞癌患者DFS的預(yù)后因素。DKK1蛋白表達(dá)陽(yáng)性與陰性的OS與RFS曲線顯示，5年后肝內(nèi)膽管細(xì)胞癌患者DKK1蛋白表達(dá)陽(yáng)性與陰性的總生存率分別為28.20%與20.51%；無(wú)復(fù)發(fā)生存率分別為24.36%與21.79%。研究結(jié)果表明，DKK1蛋白的表達(dá)是影響肝內(nèi)膽管細(xì)胞癌患者OS和RFS的預(yù)后因素，但不是唯一預(yù)后因素。本研究為分子水平研究DKK1基因價(jià)值奠定臨床研究基礎(chǔ)。本研究結(jié)果還顯示CEA、腫瘤大小、肝門(mén)淋巴結(jié)侵犯是影響肝內(nèi)膽管細(xì)胞癌患者OS和RFS的預(yù)后因素。因此，后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究中還應(yīng)聯(lián)合CEA與DKKl、腫瘤大小與DKKl、肝門(mén)淋巴結(jié)侵犯與DKKl的表達(dá)情況，是否對(duì)提高肝內(nèi)膽管細(xì)胞癌患者預(yù)測(cè)效用的價(jià)值進(jìn)行研究。

綜上所述，DKK1蛋白表達(dá)與肝內(nèi)膽管細(xì)胞癌患者淋巴結(jié)侵犯相關(guān)，發(fā)生淋巴結(jié)侵犯的患者DKK1蛋白陽(yáng)性表達(dá)率高。DKK1蛋白的表達(dá)可能是影響肝內(nèi)膽管細(xì)胞癌患者OS和RFS的預(yù)后因素，但不是唯一預(yù)后因素。

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(收稿：2016-10-24)

The relationship between DKK1 protein expression and lymph node invasion，and prognosis in patients with intrahepatic cholangiocarcinoma

ZHAOLifeng，CHENGWeihua，LEIDa，YANGYanwei，WANGGang

Department of Hepatobiliary Surgery，Central Hospital of Baoji，Baoji 721008，China

Objective The objectives of this study were to investigate the relationship between DKK1 protein expression and lymph node invasion，and prognosis in patients with intrahepatic cholangiocarcinoma.Methods From January 2005 to December 2012，78 patients with intrahepatic cholangiocarcinoma were treated with endoscopic resection.Tissue microarray of intrahepatic cholangiocarcinoma and adjacent tissues were done and biochemical indexes were measured before operation.The patients were recruited every 3 months after operation.The Kaplan-Meier method was used to analyze the recurrence-free survival curve and the overall survival curve.The Cox proportional hazards regression model was used to analyze the multivariate analysis and to determine the factors that affect the disease-free survival(RFS)and overall survival(OS).Results There were significant differences in the expression of GGT，hepatic portal lymph node invasion，Child-Pugh grade，MMP9 and DKK1 protein in the negative and positive expression of intrahepatic cholangiocarcinoma(P<0.05).The positive expression rate of DKK1 protein in intrahepatic cholangiocarcinoma was 35.90%(28/78)，and the positive expression rate of DKK1 protein in hilar cholangiocarcinoma was 14.10%(11/78).RFS and OS in 78 cases of intrahepatic cholangiocarcinoma were 51.28%(40/78)and 50.00%(38/78)，41.03%(32/78)and 38.46%(30/78)，25.64%(20/78)and 23.08%(18/78)after surgery for 1，3 and 5 years，respectively.The results from univariate and multivariate analysis showed that GGT，CA19-9，CEA，tumor size，DKK1 and hilar lymph node invasion were the prognostic factors of OS in patients with intrahepatic cholangiocarcinoma.CEA，tumor size，DKK1 and hilar lymph node involvement were prognostic factors for RFS in patients with intrahepatic cholangiocarcinoma.DKK1 protein expression positive and negative OS curve or RFS curve showed that 5 years after intrahepatic cholangiocarcinoma patients DKK1 protein expression positive and negative OS were 28.20% and 20.51%；RFS were 24.36% and 21.79%.Conclusion The expression of DKK1 protein is closely related to lymph node invasion in patients with intrahepatic cholangiocarcinoma.The expression of DKK1 protein is the prognostic factor of OS and RFS in patients with intrahepatic cholangiocarcinoma.

DKK1 protein；Intrahepatic cholangiocarcinoma；Lymph node invasion；Prognosis

寶雞市中心醫(yī)院肝膽外科(寶雞 721008)

趙利鋒，男，(1978-)，本科，主治醫(yī)師，從事肝膽疾病外科治療方面的研究。

王鋼，E-mail：wangg1971@163.com

R735.7

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10.11904/j.issn.1002-3070.2017.03.007