郝小軍 王傳卓 趙相軒 辛 鶴 劉兆玉

·基礎(chǔ)研究·

miR-34a對結(jié)腸癌細胞SW480增殖、遷移和侵襲能力的影響及機制探討

郝小軍 王傳卓 趙相軒 辛 鶴 劉兆玉

目的 探討miR-34a對結(jié)腸癌細胞株SW480增殖、侵襲和遷移能力的影響及可能的作用機制。方法 將miR-34a過表達慢病毒、空病毒載體轉(zhuǎn)染SW480細胞，未做處理細胞作為空白對照組。Real-time PCR檢測各組細胞內(nèi)miR-34a的表達；CCK8法檢測細胞增殖能力；劃痕實驗、Transwell小室實驗檢測細胞遷移和侵襲能力；Western blot實驗檢測細胞內(nèi)E-cadherin和Vimentin蛋白表達。結(jié)果 與空病毒載體組及空白對照組相比，轉(zhuǎn)染組細胞中miR-34a的表達增高，且細胞增殖效率、侵襲和遷移能力降低(P<0.05)，miR-34a使E-cadherin蛋白表達增加、Vimentin蛋白表達降低。結(jié)論 miR-34a可抑制結(jié)腸癌細胞SW480增殖、侵襲和遷移能力，并能影響E-cadherin和Vimentin的表達，miR-34a有望成為干預(yù)結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的分子靶點。

結(jié)直腸癌；miR-34a；EMT；增殖；侵襲

結(jié)直腸癌是消化道最常見的惡性腫瘤之一，近年來，其在我國的發(fā)病率和死亡率呈上升趨勢[1]，轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)是其預(yù)后差的重要原因。miRNA是一類內(nèi)源性非編碼小RNA分子，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因的表達，參與眾多生理及病理過程。大量研究表明，miRNA在腫瘤發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，包括調(diào)控腫瘤細胞的增殖、凋亡、分化、侵襲和轉(zhuǎn)移等生物學(xué)過程[2]。結(jié)直腸癌發(fā)生轉(zhuǎn)移的分子機制復(fù)雜，文獻報道上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(Epithelial-mesenchymal transition，EMT)是腫瘤轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵步驟之一，機制在于細胞間的黏附性下降，細胞獲得更強的運動、侵襲遷移能力[3]。研究表明，相對比正常結(jié)腸組織，miR-34a在結(jié)腸癌組織中表達下調(diào)[4]。但miR-34a在結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)中的作用機制并未研究透徹。miR-34a與EMT相關(guān)蛋白上皮鈣黏蛋白(E-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)研究尚少。本研究擬通過慢病毒轉(zhuǎn)染技術(shù)，研究miR-34a的過表達對結(jié)腸癌細胞SW480增殖、遷移和侵襲的影響及細胞中EMT相關(guān)蛋白表達的變化，探討可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 細胞與試劑

結(jié)腸癌細胞SW480(上海中科院細胞庫)，RPMI1640培養(yǎng)基、胎牛血清(Gbico公司)，miR-34a過表達慢病毒、空載慢病毒(上海吉凱基因公司)，Matrigel基質(zhì)膠、Transwell小室(Corning公司)，CCK8試劑(北京碧云天公司)，miRNA提取分離、cDNA合成及熒光定量檢測試劑盒(北京天根公司)，miR-34a和U6引物(上海生工公司)，E-cadherin、Vimentin及β-actin抗體(Santa cruz公司)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 用含10%胎牛血清和1%青-鏈霉素雙抗的RPMI 1640在37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，常規(guī)換液、傳代。

1.2.2 細胞轉(zhuǎn)染 按照慢病毒操作手冊進行預(yù)實驗，確定轉(zhuǎn)染的最佳MOI值，然后正式轉(zhuǎn)染。具體為：選取對數(shù)生長且狀態(tài)良好的細胞，以1×105/孔的細胞數(shù)接種到六孔板中，待細胞融合20%～30%時，將miR-34a過表達慢病毒、空載慢病毒按照預(yù)實驗確定的MOI值感染細胞，加入polybrene增強感染效率，12 h后換液，感染72～96 h后，觀察GFP熒光。待細胞生長狀態(tài)良好，且熒光率≥90%時，對細胞收集、擴大培養(yǎng)，用于后續(xù)試驗。轉(zhuǎn)染率(%)=熒光視野綠色細胞數(shù)/對應(yīng)白光視野細胞總數(shù)×100%。

1.2.3 RT-PCR 按照試劑盒說明書提取各組細胞總RNA、合成cDNA，進行RT-PCR反應(yīng)。RT-PCR反應(yīng)條件：94℃起始模板變性2 min，94℃循環(huán)中模板變性20 s，60℃退火、延伸34s，共40個循環(huán)，以U6為內(nèi)參。miR-34a引物序列：上游5′-CCCACATTTCCTTCTTATCAACAG-3′，下游5′-TGGCAGTGTCTTAGCTGGTTGTG-3′。U6引物序列：上游5′-CGCTTCGGCAGCACATATACTA-3′，下游5′-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCA-3′。得到各樣本的Ct值，以2-ΔΔCt法計算每組細胞miR-34a的相對表達量，每組設(shè)3個復(fù)孔。

1.2.4 CCK-8實驗 將細胞以5×103個/孔接種到96孔板上，連續(xù)培養(yǎng)4d，每孔加入10 μL CCK8試劑與90 μL培養(yǎng)液，培養(yǎng)箱內(nèi)反應(yīng)2 h后，酶標儀測定在490 nm處波長的吸光度(A)，每組設(shè)6個復(fù)孔，取平均值，實驗重復(fù)3次。

1.2.5 劃痕實驗 將細胞以5×105/孔接種到6孔板中，待細胞匯合90%時，用10 μL移液槍槍頭垂直于每孔中軸線劃直線，PBS洗3次，加入無血清培養(yǎng)液，并拍照(0 h)，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后觀察各組細胞遷移情況并拍照，實驗重復(fù)3次。

1.2.6 Transwell侵襲實驗 用無血清培養(yǎng)基稀釋Matrigel膠，以50 μL/孔的體積鋪于Transwell小室聚碳酸酯膜上，37℃放置4 h，使Matrigel聚合成膠。細胞饑餓24 h后調(diào)整濃度為5×105個/mL，上室加入200 μL細胞懸液，下室加入600 μL含20%FBS的培養(yǎng)液。孵箱中培養(yǎng)24 h后取出小室，用濕棉簽擦去上室Matrigel膠和未穿過膜的細胞，4%多聚甲醛固定15 min，0.1%結(jié)晶紫染色15 min，PBS清洗3次、干燥，取下微孔濾膜，倒置顯微鏡下隨機選取5個視野計數(shù)穿過膜的細胞并拍照，取平均數(shù)，實驗重復(fù)3次。

1.2.7 Western blot實驗 細胞長滿后，提取總蛋白，BCA法蛋白定量，電泳、轉(zhuǎn)膜、脫脂奶粉封閉后，分別加入各目標蛋白一抗4℃孵育過夜，與辣根過氧化酶標記二抗室溫反應(yīng)、孵育后，利用膠片曝光、顯影、定影，圖像分析儀行膠片掃描，分析灰度值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 轉(zhuǎn)染及各組miR-34a的表達

當MOI值為50 TU/mL，轉(zhuǎn)染SW480細胞72 h后，miR-34a轉(zhuǎn)染組與空病毒載體組均可觀察到GFP綠色熒光，轉(zhuǎn)染率達90%以上(圖1)。RT-PCR檢測各組細胞miR-34a的表達，假設(shè)空白對照組表達為1，轉(zhuǎn)染組miR-34a的相對表達量為9.29±0.48，空病毒載體組相對表達量為1.13±0.06，轉(zhuǎn)染組miR-34a的表達高于其他兩組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，而空載體組與空白對照組比較無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)(圖2)。

2.2 miR-34a對細胞增殖能力影響

CCK8法結(jié)果顯示隨培養(yǎng)時間的延長，過表達miR-34a組細胞的增殖能力從第3天后開始比空載體組和空白對照組下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，提示miR-34a具有抑制結(jié)腸癌細胞SW480增殖的能力(圖3)。

圖1 SW480細胞轉(zhuǎn)染后的細胞狀態(tài)及GFP綠色熒光表達(200×)Figure 1 W480 cells were transfected with miR-34a and observed cell morphology with white bright(left)and green fluorescence(right)(200×)

圖2 RT-PCR檢測轉(zhuǎn)染后miR-34a的相對表達量Figure 2 Relative expression levels of miR-34a in blank，empty virus vector and transfected cells were detected by RT-PCR.Note：Compared with blank group and vector group，*P<0.05.

圖3 CCK-8檢測miR-34a對結(jié)腸癌SW480增殖能力的影響Figure 3 Effect of miR-34a on proliferation SW480 cellsNote：*P<0.05，compared to the blank and vector group.

2.3 劃痕實驗檢測miR-34a對細胞遷移能力影響

劃痕實驗結(jié)果顯示，劃痕48 h后，空白對照組、空病毒載體組及miR-34a轉(zhuǎn)染組劃痕區(qū)域相對寬度分別為(57.33±2.85)%、(52.54±1.77)%、(70.79±3.35)%。miR-34a轉(zhuǎn)染組劃痕細胞兩端距離較其他兩組寬，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(圖4)，而空白對照和空病毒載體組無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)，表明miR-34a可抑制SW480細胞的遷移能力。

2.4 Transwell小室檢測miR-34a對細胞侵襲能力影響

Transwell小室結(jié)果顯示，miR-34a轉(zhuǎn)染組穿過濾膜的數(shù)量(83.00±7.44個)，較空白對照組(116.20±9.58個)、空病毒載體組(113.20±6.28個)減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，而空白對照組與空病毒載體組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，表明miR-34a可以抑制結(jié)腸癌SW480的侵襲能力(圖5)。

2.5 各組細胞E-cadherin和Vimentin蛋白表達

Western blot結(jié)果顯示，上調(diào)miR-34a水平后，與空病毒載體組及空白對照相比，轉(zhuǎn)染組E-cadherin的表達增加，而Vimentin表達降低(P<0.05)，而空病毒載體組及空白對照則無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)(圖6)。

圖4 劃痕實驗檢測miR-34a對SW480遷移能力影響Figure 4 Effects of miR-34a on the mobility in SW480 cells

圖5 Transwell小室檢測miR-34a對SW480侵襲能力影響Figure 5 Effect of miR-34a on invasion ability of SW480 cellsNote：1.Blank group；2.Vector group；3.MiR-34a group；*P<0.05 compared with vector and blank group

圖6 Western blot檢測E-cadherin和Vimentin的表達Figure 6 The expression of E-cadherin and Vimentin protein in SW480 cells

3 討論

結(jié)直腸癌是全球范圍內(nèi)致死性最高的惡性腫瘤之一，復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移是患者預(yù)后不良的重要原因，其中遠處轉(zhuǎn)移以肝轉(zhuǎn)移最常見，文獻報道約有30%的患者會發(fā)生肝轉(zhuǎn)移[5]。結(jié)直腸癌的轉(zhuǎn)移分子機制復(fù)雜，它是一個多步驟、多階段、多途徑、多個因素共同調(diào)控的生物學(xué)過程。miRNA是一類高度保守的非編碼小RNA分子，可與下游靶基因3′UTR區(qū)序列互補配對，引起靶基因的降解或抑制靶基因的翻譯。miRNA的表達異常與腫瘤的發(fā)生、侵襲轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)密切相關(guān)，扮演抑癌基因或致癌基因的角色[6]。因此miRNA可能是復(fù)雜基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵節(jié)點，是腫瘤診斷、治療新的分子標志及作用靶點。

miR-34a是一個受抑癌基因p53調(diào)節(jié)的小分子RNA，研究顯示miR-34a在多種惡性腫瘤組織中呈低表達，參與調(diào)控多種腫瘤細胞的生物學(xué)行為，如抑制胃癌、乳腺癌、肝癌等細胞的增殖及遷移侵襲[7-9]，miR-34a也與結(jié)直腸癌的臨床分期、分化和浸潤程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)密切有關(guān)[11]。本研究通過慢病毒技術(shù)，成功構(gòu)建了miR-34a穩(wěn)定過表達的結(jié)腸癌SW480細胞系，應(yīng)用CCK8法、劃痕實驗及Transwell侵襲實驗證實miR-34a可抑制SW480細胞的增殖、遷移及侵襲。

EMT指上皮細胞在特定環(huán)境下，失去上皮特性而獲得間質(zhì)細胞特性的生物學(xué)現(xiàn)象。EMT在個體發(fā)育、傷口修復(fù)、組織再生、干細胞分化及器官纖維化等過程中起著重要作用[11]。近年來，研究發(fā)現(xiàn)EMT是腫瘤細胞發(fā)生侵襲和轉(zhuǎn)移的機制之一。當細胞發(fā)生EMT時，細胞的骨架發(fā)生重組，上皮細胞表型缺失，增強細胞間黏附的蛋白如E-cadherin表達減少，間質(zhì)細胞的分子標志如Vimentin、基質(zhì)金屬蛋白酶(Matrix metalloproteinase，MMPs)及N-鈣黏蛋白(N-cadherin)表達增加，導(dǎo)致細胞間黏附能力下降或喪失、連接松散、失去極性，獲得更強的游走、抗凋亡及降解細胞外基質(zhì)的能力，這是腫瘤發(fā)生周圍侵襲及遠處轉(zhuǎn)移的重要生物學(xué)過程[12]。近年來，多個miRNA被發(fā)現(xiàn)參與調(diào)控EMT過程從而影響腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移，其中以miR-200家族最為經(jīng)典。miR-200家族可與E-cadherin的轉(zhuǎn)錄抑制因子ZEB1和ZEB2的3′UTR互補序列結(jié)合，增強E-cadherin的表達，抑制細胞的侵襲能力[13]。本研究結(jié)果表明過表達的miR-34a能促進SW480細胞E-cadherin的表達，抑制Vimentin的表達。

綜上所述，上調(diào)結(jié)腸癌SW480細胞miR-34a表達后，細胞的增殖、遷移和侵襲能力下降，miR-34a可抑制間質(zhì)細胞相關(guān)蛋白Vimentin的表達，促進細胞間黏附蛋白E-cadherin的表達。由此推斷miR-34a抑制結(jié)腸癌細胞SW480增殖、遷移及侵襲的機制可能是通過抑制EMT過程實現(xiàn)的。由此提示我們，miR-34a的低表達很可能存在高轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)風(fēng)險，miR-34a可能成為結(jié)腸直腸癌治療新的分子靶點。

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(收稿：2016-12-29)

Effects of miR-34a on proliferation，migration and invasion of colon cancer SW480 cell and its possible mechanism

HAOXiaojun，WANGChuanzhuo，ZHAOXiangxuan，XINhe，LIUZhaoyu

Department of Radiology，Shengjing Hospital of China Medical University，Shenyang 110004，China

Objective The objective of this study was to investigate effects of miR-34a on the proliferation，invasion and migration of colon cancer SW480 cell and its possible mechanism.Methods miR-34a overexpressed lentivirus and empty virus vector were transfected into SW480 cells and untreated cells were used as blank control group.Real-time PCR was used to detect the expression of miR-34a in each group.The cell proliferation was detected by CCK8 assay.The cell migration and invasion ability were detected by wound healing and transwell assays.The expression of E-cadherin and Vimentin protein was detected by Western blotting.Results Compared with the empty virus vector group and the blank control group，the expression of miR-34a was increased in the transfected cells，and the cell proliferation efficiency，invasion and migration ability were decreased in the transfected cells(P<0.05).miR-34a significantly increased the expression of E-cadherin protein and decreased Vimentin protein expression in the transfected cells.Conclusion miR-34a can inhibit the proliferation，invasion and migration of colon cancer SW480 cells，and affect the expression of E-cadherin and Vimentin.MR-34a is expected to be a potential molecular target for the metastasis and recurrence of colorectal cancer.

Colorectal cancer；miR-34a；EMT；Proliferation；Invasion

國家自然科學(xué)基金(81470086)

中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院放射科(沈陽 110004)

郝小軍，男，(1990-)，碩士研究生，從事腫瘤介入治療和影像診斷的研究。

劉兆玉，E-mail：liuzy@sj-hospital.org

R735.3

A

10.11904/j.issn.1002-3070.2017.03.001