袁雅璐，程遠雄△，曹 靜，賴文巖，蔡開燦

(南方醫(yī)科大學南方醫(yī)院：1.呼吸科；2.心血管內科；3.心胸外科，廣州 510515)

論著·基礎研究

苯并芘激活ERK1/2信號通路促進氣道平滑肌細胞外基質蛋白沉積對氣道重塑的影響

袁雅璐1，程遠雄1△，曹 靜1，賴文巖2，蔡開燦3

(南方醫(yī)科大學南方醫(yī)院：1.呼吸科；2.心血管內科；3.心胸外科，廣州 510515)

目的 探討苯并芘對人氣道平滑肌細胞(HASMC)細胞外基質(ECM)蛋白沉積的影響及相關通路機制。方法 原代培養(yǎng)HASMC，將2～6代細胞用于實驗。用實時熒光定量PCR和Western Blot法分別檢測ECM的基因及蛋白的表達量；用Western Blot法分析ERK1/2的磷酸化水平。結果 苯并芘可以誘導HASMC膠原蛋白Ⅰα1(P<0.01)及ECM蛋白(包括膠原蛋白Ⅰα1、多功能蛋白聚糖、纖連蛋白、層粘連蛋白α2)mRNA表達增加(P<0.05)。苯并芘可引起ERK1/2磷酸化水平快速增高(P<0.01)；ERK通路抑制劑PD98059能顯著抑制苯并芘誘導的膠原蛋白Ⅰα1(P<0.01)及ECM蛋白(包括膠原蛋白Ⅰα1、纖連蛋白、多功能蛋白聚糖、層粘連蛋白α2)mRNA表達增加(P<0.01)。結論 苯并芘通過激活ERK1/2通路誘導HASMC中ECM蛋白沉積，阻斷ERK1/2信號通路可以抑制苯并芘誘導的氣道重塑。

肌細胞，平滑??；細胞外基質；苯并芘；ERK信號通路；氣道重塑

近幾年來，我國多個地區(qū)都曾遭受霧霾天氣的危害，細顆粒物(PM2.5)作為大氣污染物的主要來源已成為各領域專家學者們的研究熱點。已有多篇臨床研究表明，PM2.5及生物燃料煙霧的暴露會增加多種慢性氣道疾病如慢性阻塞性肺疾病(COPD)、支氣管哮喘等的危險性[1-3]。

目前全球共有3億余名COPD患者，流行病學數(shù)據(jù)表明COPD排在全球死因第4位，并將在2030年上升到第3位[4]。COPD 是一種以持續(xù)性、進行性發(fā)展的氣流受限為特征的慢性氣道疾病，患者病情的反復和病程的進展與長期暴露于香煙煙霧及有害顆粒物環(huán)境中相關。氣道重塑是多種慢性炎癥性氣道疾病的重要病理特征，在COPD患者中其主要表現(xiàn)為上皮細胞增生、黏液腺增生、氣道壁細胞外基質(ECM)組分及數(shù)量的改變及血管增生等[5]。研究表明ECM的過度沉積在COPD患者病程末期氣道壁的纖維化中占有重要地位[6-7]。人氣道平滑肌細胞(HASMC)可通過表達和分泌不同類型的ECM蛋白，調節(jié)細胞外基質蛋白的動態(tài)平衡。因此，研究HASMC分泌ECM蛋白的機制，對控制氣道重塑，延緩COPD病程而言具有十分重要的意義。

苯并芘是一種多環(huán)芳烴化合物，人類每天都會通過各種途徑比如吸煙，接觸污染的空氣、食物及水源等攝入一定量的苯并芘。苯并芘除了其備受關注的致癌毒性作用外，新近研究表明其在肺部炎癥和損傷性疾病進程中同樣發(fā)揮作用[8]。因此，本文將探討PM2.5和香煙煙霧中的代表成分苯并芘在氣道平滑肌細胞ECM蛋白沉積中的作用，明確經典的ERK信號通路是否是其下游調節(jié)通路，為進一步研究大氣污染對COPD的影響提供實驗依據(jù)，為氣道重塑的防治提供新的可能。

1 材料與方法

1.1 材料 胎牛血清(Gibco)、DMEM(Hyclone)、PBS(Hyclone)、胰蛋白酶(Gibco)；苯并芘(Aladdin)、TGF-β1(Prospec)；PD98059(Sigma-Aldrich)、BCA100蛋白定量試劑盒和全蛋白提取試劑盒(上海碧云天生物技術研究所)；Trizol(Sigma-Aldrich)、反轉錄試劑盒(TOYOBO)、SYBR?Premix Ex TaqTM及PrimeScript?RtreagentKit(TOYOBO)；小鼠抗平滑肌肌動蛋白(α-SMA)(上海碧云天生物技術研究所)、小鼠抗GAPDH抗體(北京博奧森生物技術有限公司)、兔抗膠原蛋白Ⅰα1(北京博奧森生物技術有限公司)、兔抗ERK1/2(CST)、兔抗p-ERK1/2(CST)、FITC-山羊抗小鼠(上海碧云天生物技術研究所)、山羊抗兔、小鼠IgG-HRP二抗(上海碧云天生物技術研究所)；DAPI(Sigma-Aldrich)；ECL化學發(fā)光染色液(Merck Millipore)。

1.2 方法

1.2.1 原代人氣道平滑肌細胞的培養(yǎng)與鑒定 采用組織塊貼壁法原代培養(yǎng)HASMC，具體方法同本課題組已發(fā)表文獻[9-10]。實驗前征得患者及其家屬同意簽署知情同意書后，取南方醫(yī)院胸外科肺葉切除術手術標本，于超凈臺中分離葉、段支氣管中膜平滑肌層，在青霉素小瓶中剪成約1 mm3大小，吸取組織轉移至含20%FBS的完全培養(yǎng)基中，均勻分散盡可能布滿培養(yǎng)瓶瓶底，置于37 ℃、5% CO2孵箱中培養(yǎng)。每3～5天換液，鏡下觀察細胞從組織塊周圍爬出，待其生長融合后傳代，下調完全培養(yǎng)基中FBS濃度至10%，取第2～6代對數(shù)期細胞用于本研究。采用細胞免疫熒光α-SMA特異性染色法鑒定平滑肌細胞。

1.2.2 Western Blot檢測蛋白表達量及磷酸化水平 待細胞生長至85%左右接種于6 cm培養(yǎng)皿中，饑餓12 h后進行分組。(1)膠原蛋白Ⅰα1。①對照組：不加任何刺激劑；②苯并芘刺激濃度梯度(0.1、0.5、1.0、1.5 μmol/L)組；③苯并芘刺激時間梯度(12、24、48、72 h)組；④陽性對照TGF-β1(2 ng/mL)組。(2)ERK及p-ERK。①對照組：不加任何刺激劑；②苯并芘刺激時間梯度(0、0.5、1、3、6 h)組。(3)膠原蛋白Ⅰα1+ERK及p-ERK。①對照組：不加任何刺激劑；②PD98059(10 μmol/L)組；③苯并芘(1.0 μmol/L)組；④PD98059+苯并芘組，提前30 min加入PD98059。培養(yǎng)相應時間后用4 ℃預冷的PBS洗2～3次，加入蛋白裂解混合液(含RIPA、PMSF及磷酸酶抑制劑，比例為100∶1∶1)，置于4 ℃搖床充分裂解30 min，用細胞刮刮取細胞，收集至EP管，提前預冷離心機至4 ℃，設置條件：12 000×g離心20 min。吸取上清液棄沉淀，BCA法測定總蛋白濃度。加入5×loading buffer(體積比為4∶1)，100 ℃變性7 min。取20 μg總蛋白以10%聚丙烯酰胺凝膠電泳，濕轉至PVDF膜，以5%BSA室溫下封閉1～2 h后，分別加入相應一抗：兔抗膠原蛋白Ⅰα1(1∶500稀釋)、ERK1/2(1∶1 000稀釋)、p-ERK1/2(1∶1 000稀釋)，小鼠抗GAPDH(1∶1 000稀釋)，4 ℃搖床中孵育過夜。次日加入相應二抗：山羊抗兔、鼠IgG-hRP二抗(1∶5 000稀釋)，置于室溫搖床上孵育1 h，采用ECL化學發(fā)光法顯示結果。用Gel-Pro-Analyzer圖像分析軟件分析各條帶灰度值,以目的蛋白與GAPDH條帶灰度值之比表示相應蛋白表達水平；p-ERK1/2與ERK1/2條帶灰度值之比表示ERK1/2磷酸化水平。

1.2.3 qRT-PCR檢測mRNA表達量 待細胞生長至85%左右接種于3.5 cm培養(yǎng)皿中，饑餓12 h后進行分組。(1)對照組：不加任何刺激劑；(2)PD98059(10 μmol/L)；(3)苯并芘(1.0 μmol/L)；(4)PD98059+苯并芘組，提前30 min加入PD98059。經相應處理培養(yǎng)6 h后，使用Trizol試劑冰上提取細胞總RNA，經TOYOBO反轉錄試劑盒于Thermo Fisher反轉錄儀中反轉錄為cDNA，選用GAPDH作為內參基因，采用實時熒光定量法檢測ECM蛋白基因的相對表達量。各基因編號及引物序列詳細見下：

GAPDH(NM_002046)：5′-GCA CCG TCA AGG CTG AGA A-3′，5′-TGG TGA AGA CGC CAG TGG A-3′；膠原蛋白Ⅰα1(NM_000088)：5′-AGC CAG CAG ATC GAG AAC AT-3′,5′-TCT TGT CCT TGG GGT TCT TG-3′；纖連蛋白(NM_212482)：5′-TCGA GGA GGA AAT TCC AAT G-3′，5′-ACA CAC GTG CAC CTC ATC AT-3′；多功能蛋白聚糖(NM_004385)：5-GGA ACC TGG TGA AGA AAC A-3′，5′-CTT CCA CAG TGG GTG GTC TT-3′；核心蛋白多糖(NM_001920)：5′-AAT TGA AAA TGG GGC TTT CC-3′，5′-GCC ATT GTC AAC AGC AGA GA-3′；層粘連蛋白α2(NM_000426)：5′-GCC TTC TTC TCG GTG ACT TG-3′，5′-CCC TCT GCC AGC TGA ATA AG-3′。

按照TOYOBO逆轉錄試劑盒操作手冊設定程序如下：37 ℃變性15 min，98 ℃退火5 min，逆轉錄為cDNA。應用Roche Light Cycler 480進行PCR反應:第一階段:95 ℃預變性60 s；第二階段:95 ℃變性15 s，60 ℃延伸45 s；第三階段：95 ℃變性15 s，65 ℃退火15 s，95 ℃復溫，0 s，重復40個循環(huán)，冷卻至40 ℃，30 s。觀察各組基因的溶解曲線有無明顯“雙峰”，擴增曲線到達平臺期時的CT值等，并且以2-△△CT值為指標計算各組目的基因的相對表達水平。

1.3 統(tǒng)計學處理 應用SPSS13.0軟件統(tǒng)計，采用One-Way ANOVA法，先進行方差齊性檢驗，確定方差齊且組間差異有統(tǒng)計學意義后進一步采用LSD法進行多重比較。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 原代HASMC培養(yǎng)與鑒定 顯微鏡下觀察到，正常的HASMC呈長梭形，細胞核呈卵圓形位于中央，生長融合后的HASMC呈現(xiàn)出典型“峰谷征”，見圖1A；細胞經免疫熒光處理后，特異性α-SMA染色陽性并且均勻分布于胞質內，鑒定為平滑肌細胞，見圖1B。

A:普通光可見“峰谷征”；B：免疫熒光染色可見α-SMA為綠色熒光。

圖1 原代培養(yǎng)的HASMC形態(tài)及表型鑒定(×100)

2.2 苯并芘誘導HASMC膠原蛋白Ⅰα1及ECM蛋白基因表達增加 用遞增濃度的苯并芘(0.1～1.5 μmol/L)刺激細胞24 h，不同濃度的苯并芘均能引起ECM蛋白中的重要代表膠原蛋白Ⅰα1表達量增加，且與對照組相比差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01，圖2A)。另外，0.5～1.5 μmol/L的苯并芘刺激效應顯著高于陽性對照TGF-β1組，選取1.0 μmol/L作為苯并芘的最適刺激濃度；用1.0 μmol/L的苯并芘刺激細胞不同時間(12～72 h)，膠原蛋白Ⅰα1在一定時間范圍內(12～48 h)表達增加，且與對照組相比差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01，圖2B)，并在24 h到達峰值，在72 h表達較前有所下降，選取24 h作為最適刺激時間；用苯并芘(1.0 μmol/L)刺激細胞6 h，膠原蛋白Ⅰα1、多功能蛋白聚糖、纖連蛋白mRNA表達均顯著增加(P<0.01)，層粘連蛋白α2表達增加(P<0.05)，而核心蛋白多糖mRNA表達與對照組無明顯差異，見圖2C。

A：苯并芘誘導HASMC膠原蛋白Ⅰα1表達增加的濃度梯度；B：苯并芘誘導HASMC膠原蛋白Ⅰα1表達增加的時間梯度；C：苯并芘誘導HASMC ECM蛋白基因表達增加。**：P<0.01、*：P<0.05。

圖2 苯并芘誘導HASMC膠原蛋白Ⅰα1及ECM蛋白基因表達增加

2.3 苯并芘引起ERK1/2磷酸化 用苯并芘(1.0 μmol/L)刺激細胞不同時間(0～6 h)，p-ERK1/2表達量在0.5～6 h內明顯增加，且在3 h達到峰值(P<0.01)，說明苯并芘可引起ERK1/2快速活化，見圖3。

*：P<0.01，與0 h比較。

圖3 苯并芘刺激HASMC不同時間ERK1/2蛋白磷酸化水平的改變

2.4 ERK1/2信號通路在苯并芘誘導的膠原蛋白表達中的作用 苯并芘(1.0 μmol/L)刺激細胞24 h后膠原蛋白Ⅰα1表達量明顯增加(P<0.01)，見圖2；而用ERK激酶抑制劑PD98059(10 μmol/L)提前干預細胞30 min，可顯著抑制苯并芘誘導的膠原蛋白Ⅰα1表達(P<0.01)，見圖4。

*：P<0.01，與對照組比較；#：P<0.01，與苯并芘+PD98059組比較。

圖4 PD98059對苯并芘誘導的膠原蛋白表達的抑制作用

2.5 ERK1/2信號通路在苯并芘誘導ECM基因表達中的作用 苯并芘(1.0 μmol/L)刺激細胞6 h后，ECM基因mRNA表達量明顯增加，見圖2C；而用ERK激酶抑制劑PD98059(10 μmol/L)提前干預30 min后，膠原蛋白Ⅰα1、多功能蛋白聚糖和纖連蛋白mRNA的表達增加受到了顯著抑制(P<0.01)，見圖5。

*：P<0.01，與對照組比較；#：P<0.01，與苯并芘+PD98059組比較。

圖5 PD98059對苯并芘誘導的ECM基因表達的抑制作用

3 討 論

氣道重塑是COPD的重要病理特征，是導致患者肺功能持續(xù)性、進行性下降的主要原因。關于COPD的藥物治療盡管有較多選擇，但從目前的臨床數(shù)據(jù)來看，這些藥物對患者的療效并不盡如人意，其具體機制尚缺乏明確報道，有文獻認為COPD患者氣道重塑末期的纖維化可能限制了藥物的作用效果[6]。

目前大氣污染是全社會高度關注的研究熱點，苯并芘作為香煙煙霧及PM2.5中代表性的有毒化學物質,廣泛存在于各類化工業(yè)尾氣和生活污染物中。既往對苯并芘的研究主要集中在致癌及對神經、免疫系統(tǒng)的毒性作用上，其主要通過中間代謝物反氏二氫二醇環(huán)氧苯并芘-DNA 和氧自由基的形成實現(xiàn)其致癌性[11]。近年來，有研究表明苯并芘還與某些增生性疾病有關，如動脈粥樣硬化等[12]。目前認為苯并芘在氣道重塑中也起著重要作用，例如其可以促進上皮細胞分泌黏蛋白[11]、促進肺成纖維細胞分泌IL-8等[13-14]。另外，有文獻報道苯并芘可通過誘導上皮細胞分泌IL-8進而促進上皮下ASMC的增殖和遷移[15]。本研究從基因和蛋白兩個水平證實了苯并芘可以刺激HASMC異常分泌ECM蛋白(圖2)，這與以上苯并芘促進氣道重塑的研究結果相一致。另外，本研究驗證了1.0 μmol/L的苯并芘刺激HASMC培養(yǎng)24 h能達到異常分泌ECM蛋白的最大效應，與文獻[11]報道的苯并芘促進上皮細胞分泌黏蛋白的最適刺激濃度及時間基本相符。雖然在時間梯度實驗中在苯并芘刺激細胞72 h小時后膠原蛋白Ⅰα1表達量較前有所下降，并與對照組無明顯差異，這可能與細胞持續(xù)長時間無營養(yǎng)狀態(tài)下膠原蛋白降解及刺激耐受有關。

ERK通路是一條促進細胞增殖與分化的經典的信號傳導途徑[9]。ERK 在氣道平滑肌上廣泛分布，與氣道重塑中的各種炎癥介質和細胞因子誘導的細胞內信號轉導過程相關，參與COPD的發(fā)生發(fā)展。本研究結果(圖3～5)證實了苯并芘通過激活ERK1/2信號通路促進氣道平滑肌細胞外基質蛋白沉積，這與Pera等[16]有關香煙提取物可通過ERK通路促進HASMC增殖的研究結果相輔相成，說明ERK通路在苯并芘誘導的氣道重塑中發(fā)揮著重要作用。目前的研究顯示，苯并芘主要通過激活芳香烴受體進而發(fā)揮其致癌及致毒性作用，那么該受體在苯并芘誘導氣道重塑中是否同樣發(fā)揮著重要作用將是本課題組未來的研究方向。

臨床上，無論COPD還是支氣管哮喘，常規(guī)的糖皮質激素吸入治療只能達到控制癥狀的效果，文獻表明激素并不能充分抑制ECM蛋白沉積導致的氣道重塑[10]。因此，本研究的結論可為尋找阻止或延緩氣道重塑的療法提供實驗依據(jù)。

綜上所述，在大氣污染日益嚴重的當前環(huán)境下，苯并芘暴露的增加可誘導HASMC激活ERK1/2信號通路異常分泌ECM蛋白，阻斷ERK1/2通路可作為抑制氣道重塑的新靶點。同時，為減少大氣污染相關的肺功能受損，COPD患者在規(guī)范化藥物治療的基礎之上，應盡量減少在霧霾天氣的外出，降低污染物暴露的機會，幫助提高自我的生活質量、延緩病程的進展。

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Benzopyrene activates ERK1/2 signal pathway to promote extracellular matrix protein deposition of airway smooth muscle cells on airway remodeling*

YuanYalu1，ChengYuanxiong1△，CaoJing1，LaiWenyan2，CaiKaican3

(1.DepartmentofRespiration;2.DepartmentofCardiology;3.DepartmentofCardiothoracicSurgery,NanfangHospital,SouthernMedicalUniversity,Guangzhou,Guangdong510515,China)

Objective To investigate the influence of benzopyrene on extracellular matrix(ECM) protein deposition of human airway smooth muscle cells(HASMC) and the related pathway mechanism.Methods HASMC were primarily cultured and the 2-6 generations cells were applied in this experiment.The expression amount of ECM gene and protein was detected by real time PCR and Western Blot the phosphorylation level was analyzed by using the Western Blot method.Results Benzopyrene could to increase the expression of HASMC collagenⅠα1 protein (P<0.01) and ECM protein (including collagen Ⅰα1,versican,fibronectin,laminin α2) mRNA(P<0.05).Benzopyrene could induce the rapid increase of ERK1/2 phosphorylation level (P<0.01).Furthermore,the ERK pathway inhibitor PD98059 could significantly inhibit the increase of benzopyrene-induced collagenⅠα1(P<0.01)and ECM protein(including collagen Ⅰα1,versican,fibronectin,laminin α2) mRNA expression(P<0.01).Conclusion Benzopyrene induces the ECM protein deposition of HASMC by activating the ERK1/2 pathway,blocking the ERK1/2 signal pathway can inhibit the benzopyrene-induced airway remodeling.

myocytes,smooth muscle；extracellular matrix；benzopyrene；ERK1/2 pathway；airway remodeling

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.16.005

廣東省自然科學基金資助項目(s2012010009036)；南方醫(yī)院院長基金資助項目(2014A001)。 作者簡介：袁雅璐(1991-)，在讀碩士，主要從事慢性氣道疾病研究。△

，E-mail：drchengyx@126.com。

R563

A

1671-8348(2017)16-2174-04

2017-01-10

2017-03-14)