謝 蓓, 趙 磊, 孫 婧, 張麗娟, 庫本高志, 魏虎來

(1. 蘭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院, 甘肅省新藥臨床前研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 蘭州 730000;

2. 中牧實(shí)業(yè)股份有限公司蘭州生物藥廠, 蘭州 730046;

3. 京都大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所, 日本京都 6068501)

二乙基亞硝胺誘導(dǎo)建立Apc基因突變大鼠與F344大鼠肝癌模型的比較

謝 蓓1, 趙 磊2, 孫 婧1, 張麗娟1, 庫本高志3, 魏虎來1

(1. 蘭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院, 甘肅省新藥臨床前研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 蘭州 730000;

2. 中牧實(shí)業(yè)股份有限公司蘭州生物藥廠, 蘭州 730046;

3. 京都大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所, 日本京都 6068501)

目的 采用二乙基亞硝胺(DEN)在F344大鼠、Kyoto Apc Delta(KAD)大鼠體內(nèi)誘發(fā)制備肝癌模型，并比較其優(yōu)劣。 方法 KAD大鼠25只，隨機(jī)法分組，陰性對照組(5只)給予正常飲水; DEN造模組(20只)前5周飲水中添加40 mg/mL DEN，6～20周給予正常飲水; 定期解剖大鼠，肉眼觀察肝臟病變并取病變組織及癌旁組織制作病理切片。25只F344大鼠采用相同方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。結(jié)果 F344大鼠和KAD大鼠均可成功誘發(fā)肝癌，且肝癌發(fā)生病理過程與人類相似。造模16周時(shí)KAD大鼠就可見灰白色病灶點(diǎn)，3/4大鼠成瘤，平均病灶數(shù)為1.00±0.82 個(gè); 造模20周時(shí)，KAD大鼠全部(4/4)成瘤, 病灶數(shù)為3.50±1.29 個(gè); 而F344大鼠遲至20周時(shí)才可觀察到類似病灶，3/4大鼠成瘤，病灶數(shù)為1.25±0.96 個(gè)。KAD大鼠的誘導(dǎo)成瘤性顯著高于親代F344大鼠(P<0.05)。結(jié)論 與親代F344大鼠相比，抑癌基因Apc突變的KAD大鼠經(jīng)DEN誘導(dǎo)更易發(fā)生肝癌，且該模型具有肝癌誘發(fā)時(shí)間短、相同誘導(dǎo)時(shí)間肝癌發(fā)生率高、誘發(fā)病灶數(shù)多等優(yōu)點(diǎn)，是化學(xué)誘發(fā)制備肝癌動(dòng)物模型的良好模式動(dòng)物。

KAD大鼠; F344大鼠; 肝癌誘導(dǎo); 二乙基亞硝胺(DEN)

肝癌是我國最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)生涉及多因素、多階段包含啟動(dòng)、促進(jìn)和癌變的復(fù)雜病理過程，發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明。類似肝癌發(fā)病特點(diǎn)及過程的動(dòng)物模型在研究肝癌發(fā)病機(jī)制中起著重要的作用，建立一種理想的肝癌動(dòng)物模型，不僅有助于探索肝癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制，而且對肝癌的預(yù)防、臨床治療肝癌藥物的開發(fā)等具有重要意義。目前，肝癌動(dòng)物模型建立的方法多樣，有自發(fā)、誘發(fā)、移植、轉(zhuǎn)基因等[1,2]，其中以誘發(fā)性肝癌模型應(yīng)用最廣。該模型接近于人類肝癌的發(fā)病特點(diǎn)和過程，但由于其誘導(dǎo)時(shí)間長(需3～5個(gè)月甚至1～2年)、動(dòng)物死亡率高等因素制約其廣泛應(yīng)用[3]，迫切需要探索開發(fā)短時(shí)高效誘發(fā)肝癌模型的模式動(dòng)物。二乙基亞硝胺(diethylnitrosamine, DEN)誘癌特點(diǎn)是成功率高，對肝臟專一，癌變過程與人類肝癌發(fā)生過程十分相似，是迄今應(yīng)用最廣泛的肝癌誘發(fā)化學(xué)物之一[4-7]。

Kyoto Apc Delta大鼠，即KAD大鼠，為Kuramoto Takashi實(shí)驗(yàn)室使用F344大鼠經(jīng)N-乙基-N-亞硝基脲(ethylnitrosourea, ENU)誘發(fā)制備的結(jié)腸腺瘤樣息肉(adenomatous polyposis coli, Apc)基因S2523位點(diǎn)發(fā)生無義突變的基因突變大鼠[8]。KAD大鼠的APC蛋白缺少堿基區(qū)(basic domain, BD)、EB1結(jié)合區(qū)及PDZ區(qū)域，但仍保留完整的b-catenin蛋白結(jié)合區(qū)。雖然，KAD大鼠Apc基因發(fā)生了無義突變，編碼的APC蛋白翻譯提前終止，但該大鼠體內(nèi)并無任何疾病發(fā)生；經(jīng)誘癌物氧化偶氮甲烷(zaoxymethane, AOM)和葡聚糖硫酸鈉(dextran sodium sulfate, DSS)誘發(fā)后，KAD大鼠能高效快速的誘發(fā)結(jié)腸癌[8]; 經(jīng)4-硝基喹啉N-氧化物(4-nitroquinoline 1-oxide, 4-NQO)誘導(dǎo)KAD大鼠易發(fā)生舌癌等[9]。

基于KAD大鼠使用不同誘癌劑誘發(fā)制備的腫瘤模型具有腫瘤誘發(fā)時(shí)間短、成功率高等優(yōu)點(diǎn)，這些腫瘤動(dòng)物模型對疾病的發(fā)生機(jī)制[10,11]及抗腫瘤藥物的篩選具有重要意義[12]，且KAD大鼠是否經(jīng)誘導(dǎo)易于發(fā)生肝癌目前尚未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)擬以F344大鼠和KAD大鼠為研究對象，探索使用誘癌劑DEN在兩種大鼠體內(nèi)短期高效誘發(fā)肝癌模型的方法并比較其優(yōu)劣。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

誘癌劑: 二乙基亞硝胺(diethylnitrosamine, DEN)，分子式(C2H5)2NNO，密度: 0.95 g/mL，購自Sigma-Aldrich(上海)貿(mào)易有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

5對SPF級(jí)4周齡KAD大鼠由日本京都大學(xué)Kuramoto Takashi教授購自日本 SLC Inc.公司并贈(zèng)送本實(shí)驗(yàn)室。經(jīng)1～2周隔離檢疫后, 大鼠飼養(yǎng)于蘭州大學(xué)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心屏障系統(tǒng)設(shè)施 [SCXK(甘) 2013-0002]中繁殖傳代, 定期使用實(shí)時(shí)熒光定量多聚核苷酸鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(qRT-PCR)方法檢測KAD大鼠中Apc基因突變是否仍存在。SPF級(jí)F344大鼠由蘭州大學(xué)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心供給 [SCXK(甘)2013-0002]。實(shí)驗(yàn)時(shí)取SPF級(jí)5周齡雄性KAD大鼠(體質(zhì)量90～100 g)和SPF級(jí)F344大鼠(體質(zhì)量110～120 g)各25只，實(shí)驗(yàn)在蘭州大學(xué)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心屏障系統(tǒng)設(shè)施[SYXK(甘)2013-0003]中進(jìn)行，光照周期明12 h∶12 h暗，自由攝食和飲水。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方案經(jīng)蘭州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理機(jī)構(gòu)審查，符合科技部《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見》的要求。

1.3 KAD大鼠突變基因的鑒定

取SPF級(jí)KAD大鼠和SPF級(jí)F344大鼠各3只，體質(zhì)量200～220 g，剪尾法取大鼠尾部尖端組織。常規(guī)方法提取基因組DNA，使用Apc基因引物采用定量RT-PCR方法擴(kuò)增基因，Apc基因引物序列：上游5'-ATCTGTTCAGGCAGGTGGAT-3'，下游5'-TCACTCGAGGAAGGGATGAG-3'。MnlI內(nèi)切酶剪切基因擴(kuò)增產(chǎn)物，瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.4 KAD大鼠和F344大鼠體內(nèi)肝癌模型的制備

雄性KAD大鼠25只，采用隨機(jī)法分組，1組(5只)為陰性對照組，給予正常飲水，飼養(yǎng)20周;另一組(20只)為DEN造模組，前5周飲水中添加40 mg/mL DEN，5周后給予正常飲水，繼續(xù)飼養(yǎng)15周至共20周; 期間分別于4、8、12、16及20周分批次分別處死陰性對照組KAD大鼠1只，DEN造模組大鼠4只(隨機(jī)選擇)。雄性F344大鼠25只，使用與KAD大鼠相同的分組及造模方法處理。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物乙醚麻醉、頸椎脫臼處死后迅速開腹，肉眼觀察肝臟是否發(fā)生病變后完整摘取肝臟組織，稱其重量；切取部分腫瘤組織和癌旁組織分別放入體積分?jǐn)?shù)10%中性甲醛溶液中進(jìn)行固定，其余組織放入-80 ℃冰箱中備用。

1.5 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物整體觀察

每日隨時(shí)觀察動(dòng)物的精神、毛色、飲食、糞便及活動(dòng)情況并進(jìn)行記錄。動(dòng)物處死后，立即進(jìn)行解剖學(xué)檢查，稱體質(zhì)量、肝臟重量，觀察肝臟大小、色澤、質(zhì)地及有無腫瘤結(jié)節(jié)形成，無癌灶者取肝組織，出現(xiàn)癌灶者取癌結(jié)節(jié)及距癌灶邊緣0.5～1 cm癌旁組織。

1.6 病理組織學(xué)顯微結(jié)構(gòu)觀察

對所取組織常規(guī)行體積分?jǐn)?shù)10%中性甲醛固定、脫水、石蠟包埋、切片, 蘇木精-伊紅(HE)染色后進(jìn)行病理組織學(xué)檢查, 光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS16.0 軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以表示，組間分析比較采用方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 KAD大鼠突變基因鑒定

F344大鼠和KAD大鼠剪取鼠尾，分別提取DNA，經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增和內(nèi)切酶剪切后，產(chǎn)物由瓊脂糖凝膠電泳檢測KAD大鼠Apc基因突變狀況。結(jié)果顯示: KAD大鼠因Apc基因發(fā)生突變，基因中MnlI酶切位點(diǎn)消失、基因擴(kuò)增產(chǎn)物不能被剪切；F344大鼠Apc基因未發(fā)生突變，MnlI酶切位點(diǎn)仍存在，經(jīng)MnlI內(nèi)切酶作用后Apc基因片段被剪切發(fā)生斷裂(圖1)，檢測結(jié)果證實(shí)KAD大鼠中Apc基因突變并穩(wěn)定遺傳。

圖1 KAD大鼠Apc基因突變鑒定Figure 1 Authentication results of Apc gene in F344 rats and KAD rats

2.2 大鼠一般狀況觀察

KAD大鼠和F344大鼠在誘癌過程中精神狀態(tài)均良好，活動(dòng)自如，毛色光亮，排糞排便自如，糞便形態(tài)良好，無稀釋樣，亦不干燥。大鼠在整個(gè)肝癌誘發(fā)過程中攝食、飲水自由，至造模結(jié)束攝食量變化如表1所示: 因KAD大鼠前期體型偏小,攝食量偏少(P<0.01), 后期體質(zhì)量增至200～300 g時(shí),各時(shí)間段攝食量無明顯差異; 因F344大鼠對誘癌劑比較敏感, 造模組攝食量明顯少于對照組(P<0.05或P<0.01); 而KAD大鼠對誘癌劑敏感性較弱，造模組KAD大鼠攝食量與對照組相比無明顯差異。飲水量變化見表2: KAD大鼠和F344大鼠DEN造模組飲水量與陰性對照組相比均無明顯差異，只是隨大鼠體質(zhì)量增長飲水量增加。至造模結(jié)束無任何動(dòng)物意外死亡，大鼠存活率均為100%。肝癌誘發(fā)過程中，大鼠體質(zhì)量增長變化如表3所示，隨造模時(shí)間延長，KAD大鼠和F344大鼠造模組及陰性對照組體質(zhì)量均增長; 因F344大鼠對DEN比較敏感，造模初期體質(zhì)量增長緩慢(P<0.05)，后期兩種大鼠的造模組與對照組相比體質(zhì)量增長均無明顯差異; KAD大鼠的體質(zhì)量增長慢于同期F344大鼠。

2.3 KAD大鼠和F344大鼠誘發(fā)肝癌比較

定期選取大鼠，乙醚麻醉、頸椎脫臼處死后開腹, 觀察肝臟的表觀變化，結(jié)果如圖2所示: 陰性對照組KAD大鼠和F344大鼠肝臟均顏色鮮紅, 表面光滑，色澤明亮均一; 造模組前期，F(xiàn)344大鼠和KAD大鼠肝臟表觀亦正常; 造模后期，F(xiàn)344大鼠和KAD大鼠肝臟均經(jīng)歷略失光澤－肝臟偏黃－色澤不均一不光亮－灰白色病灶出現(xiàn)等過程。造模16周時(shí)KAD大鼠肝臟實(shí)質(zhì)中就已可見單發(fā)、圓形、邊界清晰的灰白色病灶點(diǎn), 體積較小。3/4大鼠成瘤, 平均病灶數(shù)為1.00±0.82個(gè); 造模20周時(shí), KAD大鼠全部(4/4)成瘤, 病灶數(shù)為3.50 ± 1.29個(gè),且病灶體積明顯增大，肝臟邊緣部分亦可見病灶出現(xiàn)。而F344大鼠遲至20周時(shí)才可觀察到類似病灶, 3/4大鼠成瘤, 病灶數(shù)為1.25 ± 0.96個(gè)。KAD大鼠的誘導(dǎo)成瘤性顯著高于親代F344大鼠(P<0.05)。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果初步提示抑癌基因Apc突變的KAD大鼠更易經(jīng)DEN誘導(dǎo)發(fā)生肝細(xì)胞肝癌, 且具有誘發(fā)時(shí)間短、相同誘導(dǎo)時(shí)間成瘤率高、成瘤病灶明顯且數(shù)目多等優(yōu)點(diǎn)。整個(gè)造模過程中, 取樣時(shí)未見KAD大鼠和F344大鼠的肝臟／體質(zhì)量比有明顯差異(表4)。

表1 F344和KAD大鼠在DEN誘發(fā)肝癌過程中攝食量變化Table 1 The food intake of F344 and KAD rats during DEN inducing hepatocarcinoma g

表2 F344和KAD大鼠在DEN誘發(fā)肝癌過程中飲水量變化Table 2 The water intake of F344 and KAD rats during DEN inducing hepatocarcinoma mL

表3 F344和KAD大鼠在DEN誘發(fā)肝癌過程中體質(zhì)量增長變化Table 3 The body weight gains of F344 and KAD rats during DEN inducing hepatocarcinoma g

圖2 DEN誘發(fā)肝癌形成時(shí)F344大鼠和KAD大鼠肝臟的表觀變化Figure 2 The appearance of livers in F344 and KAD rats when the hepatocarcinomas were induced

HE染色光學(xué)顯微鏡觀察結(jié)果顯示: 陰性對照組KAD大鼠和F344大鼠細(xì)胞排列均比較整齊, 核/質(zhì)比較接近; 造模組KAD大鼠和F344大鼠均經(jīng)歷脂肪樣變性、脂肪變性空泡化、淋巴細(xì)胞侵潤、嗜酸性小體出現(xiàn)、明顯的癌變等過程。造模8周時(shí)，KAD大鼠脂肪細(xì)胞空泡化明顯，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生了明顯的變化, 可見核/質(zhì)比明顯升高, 核異質(zhì)明顯，細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，排列比較松散; 造模12周時(shí)，出現(xiàn)明顯的淋巴細(xì)胞侵潤; 造模16周時(shí)，出現(xiàn)嗜酸性小體; 造模20周，則可觀察到明顯的癌變(圖3)。F344大鼠造模8～12周時(shí), 脂肪變性加劇; 造模16周,可見淋巴細(xì)胞侵潤; 造模20周，可觀察到嗜酸性小體出現(xiàn)，部分區(qū)域可見小的癌變病灶(圖3)。

表4 DEN誘導(dǎo)KAD和F344大鼠肝癌過程中肝臟系數(shù)變化Table 4 The liver coefficient in F344 and KAD rats during the hepatocarcinoma formation %

圖3 HE染色檢測DEN誘導(dǎo)肝癌過程中F344和KAD大鼠肝臟組織病理變化Figure 3 Monitoring of the pathological changes by HE in F344 and KAD rats

3 討論

肝癌是人類最常見的惡性腫瘤之一，肝癌的發(fā)生是一個(gè)多步驟多因素參與的復(fù)雜過程，迄今為止，有關(guān)肝癌發(fā)生和發(fā)展的生物學(xué)機(jī)制尚未完全闡明[2,13,14]。能真實(shí)反映人類疾病且類似人類疾病狀態(tài)的大鼠、小鼠等肝癌動(dòng)物模型已經(jīng)成功建立, 為肝癌發(fā)生、發(fā)展的機(jī)制研究提供了有力的工具, 同時(shí), 為藥物篩選及臨床治療方法的臨床前測試提供了良好的動(dòng)物模型[2]。肝癌動(dòng)物模型建立的方法多式多樣, 主要有自發(fā)性肝癌動(dòng)物模型、化學(xué)誘導(dǎo)動(dòng)物模型、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型、異種移植性動(dòng)物模型等[1,2]; 每種方法都有其優(yōu)點(diǎn)及缺點(diǎn); 能忠實(shí)反映或者至少部分反映肝癌發(fā)生發(fā)展機(jī)制的動(dòng)物模型的建立仍具挑戰(zhàn)性[14]?；瘜W(xué)誘導(dǎo)肝癌動(dòng)物模型的建立歷經(jīng)啟動(dòng)、促進(jìn)、演進(jìn)和癌變的復(fù)雜過程, 與人類肝癌發(fā)生相似, 都經(jīng)過肝損傷－纖維化－惡性化過程而大受青睞[1,15]。系列抗氧化劑和植物化學(xué)物等各類化合物已經(jīng)作為致癌物在嚙齒類動(dòng)物中誘發(fā)肝癌形成; 如DEN、二甲基亞硝胺(dimethylnitrosamine, DMN)、硫代乙酰胺(thioacetamide, TAA)、四氯化碳(carbon tetrachloride, CCl4)、2-乙酰氨基芴(2-acetylaminofluorene, AAF)、N-亞硝基嗎啉(N-nirosomorpholine, NMOR)、黃曲霉毒素(aflatoxin)等, 它們可通過攝食、飲水、灌胃、呼吸、腹腔注射、皮下注射等方式在嚙齒類動(dòng)物中誘發(fā)肝癌[2,14]。DEN誘發(fā)肝癌動(dòng)物模型的發(fā)病過程不僅與人類肝癌發(fā)生過程相似，且操作比較簡單、誘癌成功率較高，在肝癌及肝硬化癌前病變等研究中廣泛使用[4,6,7]。DEN的致癌能力在于其可烷基化DNA結(jié)構(gòu), 引起DNA損傷及細(xì)胞變性和在肝細(xì)胞中通過激活細(xì)胞色素P450形成活性氧而發(fā)生誘癌功能[16]，主要局限性在于需要長期注射，一般建立肝癌模型的時(shí)間需50周。本實(shí)驗(yàn)使用5周齡雄性大鼠，飲水中加入40 mg/mL DEN, 僅誘導(dǎo)5周, KAD大鼠在16周即可觀察到腫瘤結(jié)節(jié)形成，而F344大鼠16周時(shí)無病灶形成; 至造模結(jié)束20周時(shí), 平均每只KAD大鼠誘發(fā)肝癌病灶數(shù)為3.50 ± 1.29個(gè), 平均每只F344大鼠誘發(fā)病灶數(shù)僅為1.25 ± 0.96個(gè), 兩者間差異顯著(P<0.05), 且兩種大鼠死亡率均為0。KAD大鼠與F344大鼠相比, 不僅誘癌時(shí)間縮短、大鼠存活率100%、相同誘導(dǎo)時(shí)間肝癌發(fā)生率高、誘發(fā)病灶數(shù)多, 且在肝癌誘發(fā)過程中先后出現(xiàn)了肝細(xì)胞損傷－淋巴細(xì)胞浸潤－嗜酸性小體出現(xiàn)－癌變的過程，是化學(xué)誘導(dǎo)建立肝癌動(dòng)物模型的理想模型動(dòng)物。

Wnt/b-catenin信號(hào)通路在肝癌發(fā)生過程中會(huì)異常激活，是人類肝癌發(fā)生的主要途徑之一, 但是肝癌發(fā)生過程中此信號(hào)通路的作用仍未完全闡明[17]。已發(fā)現(xiàn)編碼Wnt信號(hào)通路成分的多種基因在肝癌中發(fā)生突變：如b-catenin(19%～44%)，AXIN1 and AXIN2 (5%～14% and 3%～10%)[18-20]; 此外，免疫組織化學(xué)研究結(jié)果顯示17～40%人肝癌中出現(xiàn)異常的b-catenin細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核的大量聚集[20]。80%的結(jié)腸癌中報(bào)道有Apc基因的體細(xì)胞突變和5q21 Apc位點(diǎn)雜合性丟失, 而肝細(xì)胞癌中尚無類似報(bào)道[17]。Colnot等[17]構(gòu)建一種突變的小鼠模型Apclox/lox，即在Apc基因的14號(hào)外顯子中插入loxP序列，發(fā)現(xiàn)肝細(xì)胞中b-catenin大量聚集，同時(shí)肝組織中因b-catenin靶向基因活化而活化b-catenin信號(hào)通路。相反，如在肝癌細(xì)胞中過表達(dá)Apc基因，則會(huì)對肝癌生長起抑制作用[21]。體細(xì)胞Apc基因的敲除可為人類肝癌研究提供一種極有價(jià)值的模型，對肝癌發(fā)生的研究非常必要[17]。本實(shí)驗(yàn)使用的KAD大鼠為Apc基因無義突變的大鼠，編碼的APC蛋白翻譯提前終止，但KAD大鼠體內(nèi)無任何疾病發(fā)生; 經(jīng)

DEN誘導(dǎo)后，Apc基因突變可促進(jìn)肝癌發(fā)生、加快DEN誘導(dǎo)的肝癌發(fā)生進(jìn)程，但具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

[1] Heindryckx F, Colle I, Van Vlierberghe H. Experimental mouse models for hepatocellular carcinoma research [J]. Int J Exp Pathol, 2009, 90(4):367-386.

[2] Wu L, Tang ZY, Li Y. Experimental models of hepatocellular carcinoma: developments and evolution [J]. J Cancer Res Clin Oncol, 2009, 135(8):969-981.

[3] Cortinovis C, Klimek F, Nogueira E. Rat hepatocarcinogenesis induced by N-nitrosodiethylamine and N-nitrosomorpholine continuously administered at low doses [J]. Am J Pathol, 1991, 139(5):1157-1171.

[4] Tanaka T, Kojima T, Kawamori T, et al. Chemoprevention of diethylnitrosamine-induced hepatocarcinogenesis by a simple phenolic acid protocatechuic acid in rats [J]. Cancer Res, 1993, 53(12):2775-2779.

[5] Okubo H, Moriyama M, Tanaka N, et al. Detection of serum and intrahepatic hepatocyte growth factor during DEN-induced carcinogenesis in the rat [J] . Hepatol Res, 2002, 24(4): 385-394.

[6] Jayaprakash R, Ramesh V, Sridhar MP, et al. Antioxidant activity of ethanolic extract of Tinospora cordifolia on N-nitrosodiethylamine (diethylnitrosamine) induced liver cancer in male Wistar albino rats [J] . J Pharm Bioallied Sci, 2015, 7(Suppl 1):S40-S45.

[7] Ma G, Bai R, Jiang H, et al. Assessment of hemodynamics in a rat model of liver cirrhosis with precancerous lesions using multislice spiral CT perfusion imaging [J]. Biomed Res Int, 2013, 813174.

[8] Yoshimi K, Tanaka T, Takizawa A, et al. Enhanced colitisassociated colon carcinogenesis in a novel Apc mutant rat [J]. Cancer Sci, 2009, 100(11):2022-2027.

[9] Tanaka T, Shimizu M, Kochi T, et al. Apc-mutant Kyoto Apc Delta (KAD) rats are susceptible to 4-NQO-induced tongue carcinogenesis [J]. Cancers (Based), 2014, 6(3):1522-1539.

[10] Yoshimi K, Tanaka T, Serikawa T, et al. Tumor suppressor APC protein is essential in mucosal repair from colonic inflammation through angiogenesis [J]. Am J Pathol, 2013, 182(4):1263-1274.

[11] Irving AA, Yoshimi K, Hart ML, et al. The utility of Apcmutant rats in modeling human colon cancer [J] . Dis Model Mech, 2014, 7(11):1215-1225.

[12] Yoshimi K, Hashimoto T, Niwa Y, et al. Use of a chemically induced-colon carcinogenesis-prone Apc-mutant rat in a chemotherapeutic bioassay [J] . BMC Cancer, 2012, 12:448.

[13] Newell P, Villanueva A, Friedman SL, et al. Experimental models of hepatocellular carcinoma [J]. J Hepatol, 2008, 48 (5):858-879.

[14] Hoshida Y, Fuchs BC, Tanabe KK. Prevention of hepatocellular carcinoma: potential targets, experimental models, and clinical challenges [J] . Curr Cancer Drug Targets, 2012, 12(9): 1129-1159.

[15] Park ST, Jang JW, Kim GD, et al. Beneficial effect of metronomic chemotherapy on tumor suppression and survival in a rat model of hepatocellular carcinoma with liver cirrhosis [J]. Cancer Chemother Pharmacol, 2010, 65(6): 1029-1037.

[16] De Minicis S, Kisseleva T, Francis H, et al. Liver carcinogenesis: rodent models of hepatocarcinoma and cholangiocarcinoma [J]. Dig Liver Dis, 2013, 45(6):450-459.

[17] Colnot S, Decaens T, Niwa-Kawakita M, et al. Liver-targeted disruption of Apc in mice activates b-catenin signaling and leads to hepatocellular carcinoma [J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2004, 101(49):17216-17221.

[18] Thompson MD, Monga SP. WNT/b-catenin signaling in liver health and disease [J] . Hepatology, 2007, 45(5):1298-1305.

[19] Shang N, Arteaga M, Zaidi A, et al. FAK is required for c-Met/b-catenin-driven hepatocarcinogenesis [J]. Hepatology, 2015, 61(1):214-226.

[20] Hoshida Y, Nijman SM, Kobayashi M, et al. Integrative transcriptome analysis reveals common molecular subclasses of human hepatocellular carcinoma [J]. Cancer Res, 2009, 69 (16):7385-7392.

[21] Liu LJ, Xie SX, Chen YT, et al. Aberrant regulation of Wnt signaling in hepatocellular carcinoma [J]. World J Gastroenterol, 2016, 22(33):7486-7499.

Comparison on Hepatocarcinoma Model Induced by Diethylnitrosamine in Apc-mutant Rat and F344 Rat

XIE Bei1, ZHAO Lei2, SUN Jing1, ZHANG Li-juan1, KURAMOTO Takashi3, WEI Hu-lai1
(1. Key Laboratory of Preclinical Study for New Drugs of Gansu Province, School of Basic Medical Sciences, Lanzhou University, Lanzhou 730000, China;
2. CAHIC Lanzhou Biological Pharmaceutical Factory, Lanzhou 730046, China;
3. Institute of Laboratory Animals, Graduate School of Medicine, Kyoto University, Kyoto 6068501, Japan)

ObjectiveTo establish hepatocarcinoma models induced by diethylnitrosamine (DEN) in F344 rats, KAD (Kyoto Apc Delta) rats and compare the advantages and disadvantages between them .MethodsTwenty-five KAD rats were randomly divided into 2 groups. The 5 rats in control group were given the normal water. The 20 rats in experimental group were given the water containing 40 mg/mL DEN for 5 weeks, and the remaining 15 weeks they were given the normal water. Every 4 weeks, part of KAD rats was sacrificed to undergo pathological examination and make pathological sections of liver tissues and tumor tissues. Twenty-five F344 rats were treated the same as KAD rats .ResultsHepatocarcinoma could be induced successfully in KAD rats and F344 rats. The same pathological developing process was found in them, which was similar with human. The average of 1.00±0.82 grey-white lesions could be found in 3 KAD rats (3/4) when they were induced in the 16th week, while no lesions could be found in F344 rats (0/4) at that time. Until the end of the experiments (20 weeks), 3.50 ±1.29 cancers and gray-white lesions had been developed in KAD rats, while only 1.25±0.96 could be found in F344 rats. The success rate of hepatocarcinoma induction in KAD rats was better than that in F344 rats significantly (P<0.05) .ConclusionComparing to F344 rats, KAD rats could be a better hepatocarcinoma induction model, with shorter induction time, higher sucess rate and numbers of hepatocarcinoma. KAD rat may be an ideal model for dynamically researching the hepatocarcinoma induction.

KAD rat; F344 rat; Hepatocarcinoma induction; Diethylnitrosamine (DEN)

Q95-33

A

1674-5817(2017)03-0191-07

10.3969/j.issn.1674-5817.2017.03.004

2017-01-05

甘肅省自然科學(xué)研究基金計(jì)劃項(xiàng)目(1208RJZA190)

謝 蓓(1980-), 女, 講師, 博士, 研究方向: 腫瘤分子生物學(xué)。E-mail: xieb@lzu.edu.cn

趙 磊(1980-), 共同第一作者, 男, 獸醫(yī)師, 研究方向: 動(dòng)物醫(yī)學(xué)。E-mail: leilei8071@hotmail.com

魏虎來(1962-), 男, 教授, 研究方向: 腫瘤分子生物學(xué)。E-mail: weihulai@lzu.edu.cn