楊德強(qiáng)，李慧春，陳鵬飛，王 康，李先斌，張文超，虞凌雪，姜一峰，高 飛，黃勤峰，于 海，童光志,2，周艷君,2

（1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所，上海 200241；2. 江蘇高校動物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，揚(yáng)州 225009）

·研究論文·

豬流行性腹瀉病毒S1基因在昆蟲細(xì)胞中的表達(dá)與鑒定

楊德強(qiáng)1，李慧春1，陳鵬飛1，王 康1，李先斌1，張文超1，虞凌雪1，姜一峰1，高 飛1，黃勤峰1，于 海1，童光志1,2，周艷君1,2

（1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所，上海 200241；2. 江蘇高校動物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，揚(yáng)州 225009）

本文以豬流行性腹瀉病毒（Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）流行毒株FJzz1/2011株的S1蛋白的切割位點(diǎn)設(shè)計合成特異性引物，通過RT-PCR擴(kuò)增獲得S1基因，將其克隆至轉(zhuǎn)移載體pFastBacHTA中，獲得了重組質(zhì)粒pFastBacHTA-S1，將該重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E.coli DH10Bac感受態(tài)細(xì)胞，得到重組穿梭質(zhì)粒rBacmid-S1，再將重組穿梭質(zhì)粒rBacmid-S1轉(zhuǎn)染Sf9細(xì)胞，48 h后即可觀察到明顯的細(xì)胞病變。將收獲的rBac-S1-P1代病毒在Sf9細(xì)胞上連續(xù)傳3代后，收獲細(xì)胞培養(yǎng)物，分別用間接免疫熒光鑒定（indirect immunofluorescence assay，IFA）、SDS-PAGE電泳和Western blot分析。結(jié)果顯示，P3代重組病毒rBac-S1感染的細(xì)胞均呈現(xiàn)亮綠色熒光，證實(shí)表達(dá)產(chǎn)物可以被PEDV陽性血清和抗S1蛋白的單抗特異性識別；SDS-PAGE電泳結(jié)果顯示在大約120 kDa左右可觀察到特異性條帶；Western blot結(jié)果證實(shí)該蛋白可以被抗S1蛋白的特異性單抗識別。綜上研究結(jié)果，證明利用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)在Sf9細(xì)胞中成功表達(dá)了PEDV的S1蛋白，為進(jìn)一步研究PEDV S蛋白的抗原性奠定了基礎(chǔ)。

豬流行性腹瀉病毒；S1蛋白；桿狀病毒；Sf9細(xì)胞

豬流行性腹瀉（porcine epidemic diarrhea，PED）是由豬流行性腹瀉病毒（Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）引起的一種可感染各年齡段豬的急性、高度接觸性傳染病，哺乳仔豬感染后典型臨床表現(xiàn)為急性水樣腹瀉、嘔吐和脫水等，在新生仔豬中發(fā)病率和致死率較高[1]。該病在1978年被發(fā)現(xiàn)以來，主要在歐洲和亞洲地區(qū)流行[2,3]，且以散發(fā)為主。2010年變異的PEDV襲擊了我國大部分地區(qū)，造成了豬流行性腹瀉疫情的大面積爆發(fā)和流行[4,5]，2013年又跨界出現(xiàn)在美國，隨后在北美地區(qū)爆發(fā)和流行[6]。這種疫病的流行對新生仔豬的生存造成了極大威脅，對養(yǎng)豬產(chǎn)業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[7]。PEDV為具有囊膜的單股正鏈RNA病毒，屬于冠狀病毒科（Coronaviridae），冠狀病毒屬（Coronavirus），α冠狀病毒亞屬的成員[8,9]。PEDV編碼4種結(jié)構(gòu)蛋白：纖突蛋白（S）、小膜蛋白（E）、囊膜蛋白（M）和核衣殼蛋白（N）[10]。其中PEDV的S蛋白是I型跨膜蛋白，其主要功能是與細(xì)胞表面受體結(jié)合介導(dǎo)病毒侵入宿主細(xì)胞[11]，同時可以誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體[12]。S蛋白的細(xì)胞外部分由3個結(jié)構(gòu)域組成，即N-末端結(jié)構(gòu)域（N-terminal domain，NTD），S1結(jié)構(gòu)域和S2結(jié)構(gòu)域。在S1和S2結(jié)構(gòu)域中含有一些潛在的病毒中和性抗原表位，因此該抗原區(qū)域常常成為人們開展抗PEDV研究的首選靶標(biāo)[12,13]。然而，由于S蛋白位于病毒粒子的表面，受外界環(huán)境刺激、免疫壓力等因素的影響，該基因容易發(fā)生變異。近幾年在我國新流行的PEDV毒株其變異的主要特征是病毒的S基因發(fā)生了缺失和插入突變，這些突變對S蛋白的抗原性是否會有影響尚不得知，本研究擬利用桿狀病毒-昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)對分離獲得的PEDV流行毒株FJzz1/2011株S蛋白進(jìn)行了表達(dá)和鑒定，為進(jìn)一步研究S蛋白的抗原性奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 質(zhì)粒、菌株和細(xì)胞株 PEDV FJzz1/2011株[14]、pFastBacHTA質(zhì)粒、含AcMNPV的E.coli DH10Bac菌種和草地貪夜蛾Sf9細(xì)胞株由本實(shí)驗(yàn)室保存；E.coli DH5α購自天根生化科技（北京）有限公司

1.2 主要試劑 Pfu 高保真DNA聚合酶購自Agilent 公司；限制性內(nèi)切酶及T4 DNA連接酶購自NEB公司；核酸凝膠回收試劑盒購自O(shè)MEGA公司；質(zhì)粒中提試劑盒購自QIAGEN公司；辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的山羊抗鼠IgG和FITC標(biāo)記的兔抗豬IgG購自Sigma公司；驢抗鼠IgG-FITC購自Thermo Fisher公司；抗PEDVS蛋白單抗、抗PEDV陽性豬血清由本實(shí)驗(yàn)制備保存。Sf-900TMII SFM細(xì)胞培養(yǎng)基、Grace’s Insect Medium，Unsupplemented和Cellfectin? II Reagent轉(zhuǎn)染試劑購自Invitrogen 公司。

1.3 S1基因的擴(kuò)增 提取PEDV流行毒FJzz1/2011株病毒基因組RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，根據(jù)FJzz1/2011株病毒基因組序列設(shè)計引物（表1），對FJzz1/2011株的S1基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性30 s、55℃退火30 s、72℃延伸90 s，共32個循環(huán)；72℃延伸10 min。

表1 本文所使用的引物Table 1 Primers used in this study

1.4 轉(zhuǎn)座載體的構(gòu)建 將PCR產(chǎn)物經(jīng)膠回收試劑盒純化后，與pFastBacHTA 轉(zhuǎn)移載體同時利用EcoR I和Xho I進(jìn)行雙酶切，回收目的片段，用T4連接酶將其與pFastBacHTA載體連接和轉(zhuǎn)化，獲得的重組質(zhì)粒經(jīng)菌落PCR鑒定、重組質(zhì)粒雙酶切鑒定和測序鑒定，篩選陽性重組質(zhì)粒。

1.5 陽性重組穿梭質(zhì)粒的篩選 將鑒定正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至含AcMNPV 的E.coli DH10Bac 感受態(tài)細(xì)胞中，于同時含有卡那霉素（50 μg/mL）、慶大霉素（7 μg/mL）、四環(huán)素（10 μg/mL）的三種抗性以及含有終濃度為100 μg/mL X-Gal和40 μg/mL IPTG的固體培養(yǎng)基中37℃溫箱進(jìn)行培養(yǎng)，48 h后通過藍(lán)白斑篩選和PCR鑒定的方法篩選出陽性重組穿梭質(zhì)粒。

1.6 轉(zhuǎn)染 利用質(zhì)粒中提試劑盒提純陽性重組穿梭質(zhì)粒，在轉(zhuǎn)染前24 h，預(yù)先將Sf9細(xì)胞傳代至6孔板中，使細(xì)胞單層達(dá)到50%左右，取1 μg的重組穿梭質(zhì)粒和8 μL的cellfectin II Reagent轉(zhuǎn)染試劑分別加入Grace’s Insect Medium，Unsupplemented至100 μL，渦旋，將重組穿梭質(zhì)粒和Cellfectin II Reagent轉(zhuǎn)染試劑充分混勻后室溫靜置15 min，再將混合物加入至Sf9細(xì)胞中，同時設(shè)置空白對照組，于27℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)和觀察，72 h后收集細(xì)胞上清，500×g離心5 min，取上清分裝保存于-80℃低溫冰箱中備用，并記為P1代重組病毒rBac-S1。

1.7 Western blot鑒定 取上述獲得的P1代重組病毒在Sf9細(xì)胞上連續(xù)進(jìn)行2次傳代，獲得P3代重組病毒。將P3代重組病毒接種于預(yù)先形成80%單層的Sf9細(xì)胞中，同時設(shè)置未接種病毒的Sf9細(xì)胞作為空白對照，在27℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)和觀察，在感染72 h后用含有蛋白酶抑制劑的細(xì)胞裂解液（RIPA）裂解細(xì)胞，裂解產(chǎn)物經(jīng)過10%的SDS-PAGE電泳后，用考馬斯亮藍(lán)染色，觀察目標(biāo)蛋白的表達(dá)。同時P3代病毒感染后的Sf9細(xì)胞裂解產(chǎn)物經(jīng)過10%的SDS-PAGE電泳后，用半干法轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜（NC膜），用5%的脫脂乳室溫封閉2 h，然后以抗PEDV S蛋白的特異性單抗作為一抗，利用辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的山羊抗鼠IgG為二抗進(jìn)行Western blot鑒定，二抗經(jīng)過TBST充分洗滌后，利用ECL顯影觀察檢測結(jié)果。

1.8 IFA檢測 分別用P1、P2和P3病毒感染Sf9細(xì)胞，在感染72 h后，棄去培養(yǎng)基，用80%冰乙醇4℃固定細(xì)胞1 h，然后分別利用稀釋至工作濃度的抗PEDV S蛋白的特異性單抗和抗PEDV的陽性豬血清作為一抗，37℃溫箱孵育1 h，經(jīng)PBST洗滌3次，分別用FITC標(biāo)記驢抗鼠（1:1000）熒光二抗和FITC標(biāo)記山羊抗豬（1:1000）熒光二抗在37℃溫箱孵育45 min，PBST洗滌3次，置于熒光顯微鏡觀察。

2 結(jié)果

2.1 S1基因的擴(kuò)增 以PEDV FJzz1/2011株為模板，利用引物FJ-S1F/FJ-S1R進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物大小約2400 bp，見圖1。

圖1 PEDV S1基因的RT-PCR擴(kuò)增Fig.1 RT-PCR amplif cation of PEDV S1 gene1: 陰性對照; 2: PEDV S1 基因; M: DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)(DL15000)1: Negative control; 2: PEDV S1 gene; M: DNA Marker(DL15000)

2.2 重組穿梭質(zhì)粒rBacmid-S1的鑒定 將pFastBac HTA-S1質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至E.coli DH10Bac感受態(tài)細(xì)胞中，挑選白色菌落用M13通用性引物進(jìn)行菌落PCR鑒定，結(jié)果顯示未發(fā)生重組的菌落PCR產(chǎn)物大小約為300 bp，而陽性菌落PCR產(chǎn)物大小約為4800 bp，見圖2。

圖2 重組穿梭質(zhì)粒rBacmid-S1的鑒定Fig.2 Identif cation of recombinant shuttle plasmid rBacmid-S11~7: 未重組穿梭質(zhì)粒; 8: 陽性重組穿梭質(zhì)粒rBacmid-S1; M: DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)(DL5000)1-7: No recombinant shuttle plasmid; 2: Positive recombinant shuttle plasmid rBacmid-S1; M: DNA Marker(DL15000)

2.3 S1重組蛋白的表達(dá) 將重組穿梭質(zhì)粒rBacmid-S1轉(zhuǎn)染Sf9細(xì)胞72 h后可觀察到明顯的細(xì)胞膨脹變大，胞漿內(nèi)有折光顆粒等細(xì)胞病變，取P3代病毒感染的Sf9細(xì)胞進(jìn)行SDS-PAGE電泳，結(jié)果顯示在大約120 kDa左右出現(xiàn)特異性蛋白條帶，見圖3A。將表達(dá)的S1重組蛋白轉(zhuǎn)印至NC膜上，利用抗PEDV S1蛋白的特異性單克隆抗體做為一抗，進(jìn)行Western blot鑒定，結(jié)果顯示，該單抗可以特異性識別大小約為120 kDa的特異性蛋白條帶，而Sf9細(xì)胞對照呈陰性，見圖3B），表明PEDV S1蛋白在Sf9細(xì)胞中獲得了表達(dá)。

圖3 PEDV S1重組蛋白的SDS-PAGE電泳及Western blot鑒定Fig.3 Identif cation of PEDV S1 recombinant protein by SDS-PAGE analysis and Western blot1: 重組病毒感染的Sf9細(xì)胞; 2: 陰性對照; M: 蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)(170 kDa)1: Sf9 cells infected with recombinant virus; 2: Negative control; M: Protein Marker(170 kDa)

2.4 rBac-S1重組病毒的IFA鑒定 分別用P1、P2和P3代rBac-S1重組病毒感染Sf9細(xì)胞，72 h后，分別利用抗S蛋白特異性單抗和豬源抗PEDV的陽性血清進(jìn)行IFA鑒定。結(jié)果顯示P1、P2和P3代重組病毒rBac-S1感染的Sf9細(xì)胞在熒光顯微鏡均可檢測到特異性綠色熒光，表明重組病毒rBac-S1在感染的Sf9細(xì)胞中所表達(dá)的S1蛋白能被抗S蛋白單抗和豬源抗PEDV的陽性血清所識別，見圖4。

3 討論

PEDV病毒基因組的差異主要集中在S蛋白的S1基因區(qū)域，該區(qū)域容易出現(xiàn)氨基酸突變、插入或缺失等，因此人們推測該區(qū)域氨基酸的突變可能與病毒的嗜性或致病性等相關(guān)，而S2基因區(qū)域相對較保守。而且PEDV S蛋白的S1基因區(qū)域具有一些重要的抗原決定簇，如已有報道證實(shí)499~638 aa和636~789 aa是中和性抗原表位區(qū)域[15]，能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生良好的免疫反應(yīng)，因此S蛋白被認(rèn)為是疫苗或抗病毒藥物篩選的首位候選目標(biāo)蛋白。而近年來出現(xiàn)的流行毒株與以前所流行的以CV777為代表的毒株在S1基因區(qū)域存在較大差異，尚不得知這種變化對該蛋白的抗原特性有怎樣影響，本研究利用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)將PEDV流行毒株FJzz1/2011株的S1基因區(qū)域構(gòu)建到該系統(tǒng)中，并使之獲得表達(dá)。桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)具有可以對表達(dá)的外源蛋白進(jìn)行糖基化修飾等優(yōu)點(diǎn)[16]，在一定程度上模擬了外源蛋白在自然條件下的真實(shí)性，從而該系統(tǒng)常被應(yīng)用于如PCV2等一些病原的亞單位疫苗的研制。本研究在桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)中所表達(dá)的PEDV S1蛋白，與本實(shí)驗(yàn)室此前在原核表達(dá)系統(tǒng)中所表達(dá)的S1蛋白存在明顯不同，原核系統(tǒng)所表達(dá)的S1蛋白無修飾，與蛋白預(yù)期的90 kDa分子量大小基本一致，而在桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)中所表達(dá)的S1蛋白其分子量大小約為120 kDa左右，表明在該系統(tǒng)中表達(dá)的S1蛋白可能被進(jìn)行了糖基化等修飾，這在一定程度的保證了體外人工表達(dá)的S1蛋白更加接近天然狀態(tài)下的PEDV S1蛋白，能夠較好地保留該蛋白在自然狀態(tài)下的活性。本研究我們分別利用抗PEDV S1蛋白的特異性單抗和抗PEDV的豬的陽性血清對該表達(dá)蛋白進(jìn)行了IFA和Western blot鑒定，證實(shí)重組病毒rBac-S1在感染Sf9細(xì)胞中表達(dá)的S1蛋白可以被抗PEDV特異性豬血清和S1蛋白單抗所識別，表明在桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)的S1蛋白具有較好的抗原性。同時IFA檢測發(fā)現(xiàn)該蛋白的表達(dá)量隨著感染時間的延長陽性細(xì)胞數(shù)量明顯增加，SDS-PAGE可以觀察到表達(dá)目標(biāo)蛋白的條帶，但其表達(dá)量仍需要我們今后繼續(xù)通過優(yōu)化細(xì)胞培養(yǎng)條件等方法來使其得到進(jìn)一步提高。

圖4 不同代次rBac-S1重組病毒感染Sf9細(xì)胞的IFA檢測Fig.4 IFA detection of PEDV S1 protein in sf9 cells infected with different generations of rBac-S1

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CHARACTERIZATIN OF PORCINE EPIDEMIC DIARRHEA VIRUS S1 GENE EXPRESSED IN INSECT CELLS

YANG De-qiang1, LI Hui-chun1, CHEN Peng-fei1, WANG Kang1, LI Xian-bin1, ZHANG Wen-chao1, YU Ling-xue1, JIANG Yi-feng1, GAO Fei1, HUANG Qin-feng1, YU Hai1, TONG Guang-zhi1,2, ZHOU Yan-jun1,2

(1. Shanghai Veterinary Research Institute, CAAS, Shanghai 200241, China; 2. Jiangsu Co-innovation Center for Prevention and Control of Important Animal Infectious Diseases and Zoonoses, Yangzhou 225009, China)

In the present study, we f rst designed primers based on the cleavage site of S1/S2 of Porcine epidemic diarrhea virus. The S1 gene of PEDV was amplif ed in RT-PCR and cloned into pFastBacHTA vector and the resulting recombinant plasmid pFastBacHTA-S1 was transformed into E.coli DH10Bac competent cells to get the recombinant shuttle plasmid rBacmid-S1. The transfected cells developedvisible cytopathic effect (CPE) at 48 h post transfection (hpt). The recombinant virus (P1) was serially passaged to P3 in the Sf9 cells. The cells were collected and examined in indirect immunof uorescence assay(IFA), SDS-PAGE and Western blot. The Sf9 cells infected with recombinant virus rBac-S1-P3 showed bright green f uorescence when stained with PEDV pig antisera and monoclonal antibody (McAb) against PEDV S1 protein. The SDS-PAGE analysis showed a band at around 120 kDa corresponding to the molecular weight of candidate recombinant protein. This protein band was also visualized in Western blot using McAb against S1 protein. All these results showed that the S1 protein of PEDV strain FJzz1/2011 was expressed in the Sf9 cells using baculovirus expression system.

Porcine epidemic diarrhea virus; S1 protein; baculovirus expression system; Sf9 cells

S852.659.6

A

1674-6422（2017）03-0018-05

2017-02-23

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31472207)；國家重點(diǎn)研發(fā)計劃項(xiàng)目（2016YFD0500100）；國家生豬現(xiàn)代產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)項(xiàng)目(CARS-36)

楊德強(qiáng)，男，碩士研究生，預(yù)防獸醫(yī)學(xué)專業(yè)

周艷君，E-mail：yjzhou@shvri.ac.cn；童光志，E-mail：gztong@shvri.ac.cn