崔曉霞，黃 兵,3，趙其平，韓紅玉，朱順海，徐帥兵，謝雨翔，唐 敏,2，楊志遠,2，董 輝

（1.中國農業(yè)科學院上海獸醫(yī)研究所 農業(yè)部動物寄生蟲學重點開放實驗室，上海 200241；2.上海師范大學生命與環(huán)境科學學院，上海 200234；3. 江蘇省動物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，揚州 225009）

·研究論文·

柔嫩艾美耳球蟲頂膜抗原-1潛在子孢子互作蛋白的篩選

崔曉霞1，黃 兵1,3，趙其平1，韓紅玉1，朱順海1，徐帥兵1，謝雨翔1，唐 敏1,2，楊志遠1,2，董 輝1

（1.中國農業(yè)科學院上海獸醫(yī)研究所 農業(yè)部動物寄生蟲學重點開放實驗室，上海 200241；2.上海師范大學生命與環(huán)境科學學院，上海 200234；3. 江蘇省動物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，揚州 225009）

為了篩選與柔嫩艾美耳球蟲頂膜抗原-1（Eimeria tenella apical membrance antigen 1，EtAMA1）存在互作的子孢子蛋白，以柔嫩艾美耳球蟲子孢子cDNA為模板，PCR擴增EtAMA1基因胞外區(qū)，將擴增產物與pGEX-6P-1連接，構建原核表達質粒pGEX-6P-1-EtAMA1，表達、純化重組蛋白EtAMA1-GST。純化的重組蛋白經Western blot驗證，結果顯示在75 kDa處有單一的目的條帶，證實了所獲得的蛋白為EtAMA1-GST融合蛋白。將EtAMA1-GST蛋白、GST蛋白和PBS分別與谷胱甘肽瓊脂糖珠孵育后，再分別與子孢子裂解物共孵育，洗脫液經SDS-PAGE分析后，結果顯示三者之間的條帶明顯不同。將差異條帶切下進行質譜分析，對獲得的蛋白質肽段與Uniprot中雞球蟲蛋白質數(shù)據(jù)庫進行Blast比對，初步獲得了10個與EtAMA1存在潛在互作的柔嫩艾美耳球蟲子孢子蛋白，包括微線體蛋白、糖酵解酶類、肌動蛋白相關因子以及一些保守蛋白等，他們廣泛參與了蟲體的入侵、發(fā)育、能量代謝等生物學過程。研究結果為進一步闡明EtAMA1在球蟲入侵宿主細胞中發(fā)揮重要作用的分子機制奠定了基礎。

柔嫩艾美耳球蟲；頂膜抗原-1；GST pull-down；相互作用蛋白

球蟲病是集約化養(yǎng)雞業(yè)中最多發(fā)、危害嚴重且防治困難的疾病之一[1]，全世界每年因球蟲病造成的損失及其防治的費用達20億英鎊[2]。目前，控制球蟲病主要依靠抗球蟲藥物和活疫苗的使用[3]，但由于球蟲耐藥性的產生，藥物殘留問題日益受到關注以及活疫苗潛在散毒等問題的產生，促使研究人員迫切地尋找新的防治手段來控制球蟲病。雞球蟲的生活史包括細胞外的入侵階段和細胞內的繁殖階段，其中子孢子是球蟲從體外入侵宿主細胞建立感染的第一個階段。阻斷子孢子入侵宿主細胞，是防治球蟲病的一種有效方法。因此，分離鑒定與球蟲子孢子入侵宿主細胞相關的關鍵分子，對闡明球蟲入侵的分子機制，研制抗球蟲病疫苗和治療新藥物都具有積極意義[4]。

頂膜抗原1（apical membrane antigen 1，AMA1 ）于1982年在瘧原蟲（Plasmodium）裂殖子中發(fā)現(xiàn)，是頂復器門原蟲中一種高度保守的微線蛋白[5]。大量研究表明，AMA1在瘧原蟲、弓形蟲（Toxoplasma）等裂殖子/速殖子入侵宿主過程中，能與多個棒狀體頸部蛋白（RON2/4/5/8）相互作用，形成復合物，在蟲體入侵宿主細胞過程中發(fā)揮重要的功能[6-8]。本實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)，柔嫩艾美耳球蟲AMA1（Eimeria tenella AMA1，EtAMA1）在子孢子中的蛋白表達水平明顯高于未孢子化卵囊、孢子化卵囊和裂殖子階段，其抗體能明顯抑制子孢子入侵[9]，但具體分子機制尚不清楚。本研究旨在利用GST pull-down聯(lián)合質譜技術，篩選出與EtAMA1發(fā)生相互作用的子孢子蛋白，為闡明EtAMA1在球蟲入侵宿主細胞中發(fā)揮重要作用的分子機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料 柔嫩艾美耳球蟲（資源編號：CAAS2111 1611）和pGEX-6P-1載體由中國農業(yè)科學院上海獸醫(yī)研究所動物原蟲病創(chuàng)新團隊保存；宿主菌TOP10、BL21（DE3）感受態(tài)細胞、DNA Marker（DL2000）、DNA Marker（DL5000）、2×Taq PCR MasterMix、瓊脂糖凝膠回收試劑盒、質粒小提試劑盒購自上海天根生物技術有限公司；Trizol、反轉錄試劑盒、限制性內切酶BamH I和EcoR I購自大連TaKaRa公司；鼠源GST標簽抗體、RIPA裂解液、銀染試劑購購自上海碧云天生物技術有限公司；T4 DNA連接酶購自美國Promega公司；Cocktail 蛋白酶抑制劑、羊抗鼠IgG-Cy3二抗購自Sigma公司；GST·BindTMResin 購自Novagen公司；PierceTM GST Protein Interaction Pull-Down Kit購自美國Themo scientific公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 子孢子的收集與純化 柔嫩艾美耳球蟲孢子化卵囊按劑量為2.0×105個/只，接種7日齡無球蟲的雛雞，收集接種后d 6~8糞便中的卵囊[10]，在28℃的生化培養(yǎng)箱中通氧進行孢子化。待卵囊孢子化率達到90%以上時，用飽和食鹽水漂浮法進行純化。在純化好的卵囊沉淀中加入少量PBS，混勻后加入含有玻璃珠的離心管中[11]，漩渦震蕩5 min。鏡檢發(fā)現(xiàn)有大量孢子囊釋放且卵囊破壁率達到95%以上時，960×g離心10 min，沉淀用HBBS緩沖液重懸，轉移至三角錐形瓶中，向其中加入0.5%的胰蛋白酶和5%的雞膽汁[12]，混勻后置于41℃水浴鍋中消化至95%以上的子孢子逸出，用砂芯漏斗過濾純化子孢子，收集濾液，離心。子孢子沉淀用PBS洗滌3次后，計數(shù)，按每管1×106個子孢子進行分裝，置于液氮中保存。

1.2.2 cDNA模板的制備 取0.5×106個子孢子，加入Trizol，按照說明書的步驟提取總RNA，取少量總RNA進行瓊脂糖凝膠電泳鑒定其完整性，利用紫外分光光度計測定濃度。符合要求后，使用反轉錄試劑盒制備cDNA。

1.2.3 PGEX-6P-1-EtAMA1原核表達質粒的構建與鑒定 對EtAMA1（GenBank登錄號：JN032081）的胞外區(qū)序列（1327 bp）設計引物，上游引物：5'-CGGGATCCGGGGTGCAGCACAA-3'，下游引物：5'-CGGAATTCGCCCCCTTTAGA-3'），上下游引物分別引入BamH I、EcoR I酶切位點（下劃線處）[9]。以柔嫩艾美耳球蟲子孢子的cDNA產物為模板，進行EtAMA1基因的擴增。PCR反應條件：94℃預變性3 min；94℃ 變性30 s，53℃ 退火30 s，72℃延伸 2 min，40個循環(huán)；72℃延伸 10 min。用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物，切膠回收目的片段。將回收的基因片段和載體pGEX-6P-1質粒分別經BamH I和EcoR I雙酶切后回收目的片段，按物質的量之比為4:1的比例混合，用T4 DNA連接酶4℃連接過夜。將連接產物轉化至TOP10感受態(tài)大腸桿菌中，涂布于含有氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基上，于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h，挑取單克隆菌落于5 mL含有氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基內，置于37℃恒溫搖床中，180 r/min振蕩培養(yǎng)過夜，菌液經PCR和雙酶切鑒定后，送至上海生工公司進行測序。

1.2.4 EtAMA1-GST重組蛋白的表達與純化 將測序正確的PGEX-6P-1-EtAMA1表達載體轉化至大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)細菌進行誘導表達。挑取單克隆菌落接種到100 mL含有氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基內，置于37℃恒溫搖床中，180 r/min振蕩培養(yǎng)至OD值達到0.4～0.8之間，加入IPTG至終濃度為0.05 mmol/L，16℃、180 r/min培養(yǎng)24 h后，4℃、10 000×g離心8 min，收集菌體沉淀，加入預冷的PBS重懸菌體，利用超聲破碎的方法裂解菌體，直至菌液透明清亮，條件為超聲2 s，停止2 s，超聲20 min。超聲裂解液于4℃、10 800×g離心10 min，上清和沉淀經SDS-PAGE分析，確定上清中有目的蛋白的表達。使用GST·BindTM Resin 對上清中的目的蛋白進行純化。

1.2.5 EtAMA1-GST純化蛋白的鑒定 以未誘導的菌液作為陰性對照，取部分純化后的蛋白進行Western blot驗證。全濕法電轉移至PVDF膜上，5%脫脂乳4℃封閉過夜；PBST洗滌3次，加入鼠源GST標簽一抗，37℃孵育2 h；PBST洗滌3次，加入1:10 000稀釋的熒光羊抗鼠二抗，37℃孵育1 h，PBST洗滌3次，再經PBS洗滌5次后，用Odyssey雙色紅外激光成像系統(tǒng)進行拍照。

1.2.6 柔嫩艾美耳球蟲子孢子全蛋白的提取 取10×106個子孢子，用預冷的PBS洗滌3次，10 800×g離心10 min；棄上清，沉淀中加入100 μLRIPA裂解液及1% cocktail蛋白酶抑制劑，置于冰上裂解30 min，輕輕地反復吹打裂解液，避免產生氣泡；4℃、10 800 ×g離心10 min，吸取上清液即為子孢子總蛋白，BCA法測定蛋白濃度。

1.2.7 GST pull-down試驗 參照試劑盒的說明書進行，取3個Pierce瓊脂糖純化離心柱，向每個離心柱中加入50 μL谷胱甘肽瓊脂糖凝膠和400 μL的由1:1 TBS和裂解緩沖液配成的洗滌液，上下翻轉離心柱，將柱子放入收集管中，1250×g離心60 s，棄掉收集管中的廢液，用洗滌液反復洗滌5次。向3個離心柱中分別加入150 μg的GST-EtAMA1蛋白液、GST標簽蛋白液以及PBS，用洗滌液補足體積至300 μL，4℃搖床溫和旋轉振蕩1 h，將離心柱放入收集管中，1250×g離心60 s，棄掉收集管中的廢液。加入400 μL洗液，反復顛倒混勻，1250×g離心60 s，棄掉收集管中的廢液，向離心柱中加入洗液，反復洗滌瓊脂糖凝膠5次。每個離心柱中加入150 μg子孢子蛋白，用洗滌液補足體積至800μL，置于搖床溫和轉動，4℃孵育過夜。次日，將離心柱放入收集管中，1250×g離心60 s，棄掉收集管中的廢液，向離心柱中加入洗滌液，反復洗滌瓊脂糖凝膠5次。將250 μL現(xiàn)配制10 mmol/L谷胱甘肽洗脫液（pH=8.0）添加至離心柱中，4℃搖床溫和振蕩至少5 min，將離心柱放入收集管中，1250×g離心60 s，收集管內的洗脫液，進行SDS-PAGE分析，凝膠用銀染試劑盒進行染色。

1.2.8 差異蛋白質條帶的質譜鑒定 將SDS-PAGE分析得到的差異蛋白條帶，切割后送至上海厚基生物科技有限公司進行質譜分析，對獲得的蛋白質肽段，與Uniprot 中球蟲數(shù)據(jù)庫（uniprot_ Eimeria_57563_20151228.fasta，收錄序列 57563條）進行搜索，鑒定蛋白質。

2 結果

2.1 EtAMA1-GST重組蛋白的表達與純化 以柔嫩艾美耳球蟲子孢子cDNA為模板，用所設計合成的特異性引物擴增出1條目的條帶，大小為1260 bp，與預期相符。將目的片段連接到pGEX-6P-1，經PCR和雙酶切鑒定正確后，原核表達質粒pGEX-6P-1-EtAMA1用0.05 mmol/mL IPTG在16℃條件下誘導過夜。將表達后的菌液進行超聲破碎，所獲沉淀和上清分別進行SDS-PAGE分析，結果顯示在上清和沉淀中均有72 kDa目的蛋白存在，其中pGEX-6P-1載體約為26 kDa，AMA1蛋白約為46 kDa（圖1）。用GST-Bing柱對上清中的重組蛋白進行純化，可獲得較純的EtAMA1-GST蛋白（圖1）。

圖1 EtAMA1-GST重組蛋白的表達與純化Fig.1 Expression and purif cation of recombinant protein EtAMA1-GSTM: 蛋白質分子量標準; 1: 重組蛋白上清; 2: 重組蛋白沉淀; 3: 純化后重組蛋白M: Protein Marker; 1: Supernant of EtAMA1-GST; 2: Precipitate of EtAMA1-GST; 3: Purif ed EtAMA1-GST protein

2.2 EtAMA1-GST融合蛋白的鑒定 以GST抗體為一抗，對純化的蛋白進行Western blot鑒定。結果顯示，純化蛋白在72 kDa處有單一的目的條帶，而未誘導菌液無條帶，證實所獲得的蛋白為EtAMA1-GST融合蛋白（圖2）。

圖2 EtAMA1-GST重組蛋白的Western blot鑒定Fig.2 Identif cation of recombinant protein EtAMA1-GST by Western blotM: 蛋白質分子量標準; 1: 純化的EtAMA1-GST蛋白; 2: 陰性對照M: Protein Marker; 1: Purif ed EtAMA1-GST protein; 2: Negative control

2.3 SDS-PAGE分析與質譜分析 對GST pull-down的洗脫液進行SDS-PAGE分析，銀染結果顯示，EtAMA1-GST實驗組、GST空載體對照組以及陰性對照組之間的條帶明顯不同（圖3）。將差異條帶切下進行質譜分析，對獲得的蛋白質肽段，與Uniprot中雞球蟲蛋白質數(shù)據(jù)庫進行比對，初步得到10個與EtAMA1存在潛在相互作用的柔嫩艾美耳球蟲子孢子蛋白（表1）。

圖3 GST pull-down結果的SDS-PAGE分析Fig.3 Analysis of the results of GST pull-down by SDSPAGEM: 蛋白質分子量標準; 1: 陰性對照組; 2: GST空載體對照組; 3: EtAMA1-GST實驗組M: Protein Marker; 1: Negative control group; 2: GST control group; 3: EtAMA1-GST group

表1 GST pull-down篩選到與EtAMA1潛在作用的子孢子蛋白Table 1 Potential sporozoite proteins interacting with EtAMA1 screened by GST pull-down

3 討論

AMA-l 最早由 Deans 等從諾氏瘧原蟲（P. knowlesi）裂殖子的頂端復合體中篩選到[5]，隨后在弓形蟲[13]、泰勒蟲（Theileria）[14]、新孢子蟲（Neospora）[15]、球蟲[16]、巴貝斯蟲（Babesia）[17]等中相繼發(fā)現(xiàn)。在瘧原蟲和弓形蟲中的研究表明，AMA-1與棒狀體頸部蛋白（rhoptry neck protein，RON）復合物結合形成運動連接環(huán)（moving junction，MJ），是蟲體成功入侵宿主細胞的關鍵。Alexander等[18]首先利用惡性瘧原蟲（P. falciparum）AMA-1（PfAMA-1）抗體免疫共沉淀了棒狀體頸部蛋白4（PfRON4），發(fā)現(xiàn)PfAMA-1和PfRON4都位于MJ[19]。隨后又鑒定了PfRON2和PfRON5，發(fā)現(xiàn)PfRON245以復合體形式存在，與PfAMA-1相互作用，在入侵宿主細胞時定位于MJ[20-22]。弓形蟲TgAMA-1通過TgRON2與RON蛋白復合物（TgRON2/4/5/8）連接，結合在MJ上，對速殖子入侵宿主細胞至關重要[23]。在前期研究中，Jiang等[9]對EtAMA1功能進行了初步研究，抗體抑制的結果發(fā)現(xiàn)子孢子入侵率下降了70%，表明EtAMA1是子孢子宿主的關鍵蛋白，但機制尚不清楚。因此，本文對其潛在作用的子孢子蛋白進行了篩選。

目前，用于篩選蛋白質互作蛋白的方法主要包括酵母雙雜交技術、噬菌體展示技術、GST pulldown技術、免疫共沉淀、串聯(lián)親和純化技術以及蛋白質芯片技術等[24]。GST pull-down 技術是將GST融合蛋白作為探針，與溶液中的特異性搭檔蛋白結合，然后根據(jù)谷胱甘肽瓊脂糖球珠能夠沉淀GST 融合蛋白的能力來確定相互作用的蛋白[25]。由于該技術具有可以使靶蛋白保持“天然”狀態(tài)，在體外驗證蛋白間直接的相互作用時有較強的特異性。同時，含有的GST標簽融合蛋白具有高通量和高選擇性等特點，使得GST pulldown 技術被廣泛應用到互作蛋白篩選中。利用這一技術，Shen等[26]成功篩選出了肝細胞癌Nck1 蛋白的結合蛋白dermcidin；Zhang等[27]篩選出能與乙型肝炎病毒X 蛋白發(fā)生相互作用的apoA-I蛋白；李一柯[28]從12周齡人胎腦組織中“釣取”了4個與IE286相互作用的宿主蛋白：II型角蛋白（K2C1）、I型角蛋白（KIC10）、組蛋白H2B以及波形蛋白；柴政斌等[29]篩選到了與類風濕性關節(jié)炎易感基因肽?；彼崦搧啺访涪粝嗷プ饔玫牡鞍诪镠L-60；鄭斌等[30]初步篩選出與弓形蟲微線體蛋白6羧基端MIC6C相互作用的蛋白為醛縮酶；趙文等[31]篩選出31個只在 PID3 介導的抗稻瘟病反應中能與其特異結合的 PID3 互作蛋白，包括受體激酶、LRR類蛋白、ATP 酶、磷酸羧化酶和離子通道蛋白等。

GST pull-down 技術在篩選相互作用蛋白時存在一定的局限性，因此，在進行GST pull-down 試驗時，要充分考慮GST融合蛋白的純度、GST標簽等因素可能對實驗結果造成的影響，以減少假陽性的出現(xiàn)[32]。為了能最大程度地保證融合蛋白原有的生物學活性，一般在獲取融合蛋白時傾向于可溶性融合蛋白，因此獲得高純度可溶性融合蛋白對GST pull-down的結果很關鍵[33]。本研究在表達EtAMA1-GST融合蛋白的初期，目的蛋白是以包涵體形式表達，通過改變溫度、時間以及IPTG濃度等誘導條件，確定當IPTG終濃度為0.05 mmol/L條件下，16℃180 r/min培養(yǎng)24 h時，目的蛋白在上清中得以表達，獲得了可溶性蛋白。對純化獲得的融合蛋白，進行Western blot鑒定，結果顯示在75 kDa處有單一的目的條帶，進一步證實了所獲得的蛋白為EtAMA1-GST融合蛋白。同時，本研究在利用GST pull-down篩選與EtAMA1發(fā)生互作的子孢子蛋白時，設置了GST空載體組和PBS組作為對照，以減少GST標簽蛋白等對試驗結果的影響。

EtAMA1是典型的I型跨膜蛋白，可分為 N-端的胞外區(qū)、跨膜區(qū)和 C-端胞內區(qū)，為了獲得可溶性蛋白，本研究僅對其胞外區(qū)域進行原核表達，并以EtAMA1-GST蛋白作為探針蛋白，通過GST pull-down技術篩選到了10個與EtAMA1存在潛在相互作用的子孢子蛋白，包括微線體蛋白（microneme protein，MIC）、糖酵解酶類、肌動蛋白相關因子等，廣泛參與了蟲體的入侵、發(fā)育、能量代謝等生物學過程。在獲得的10個子孢子蛋白中，未見有已知的能與AMA1發(fā)生作用的蛋白，但有能與其他蟲體或宿主蛋白發(fā)生作用的蛋白。柔嫩艾美耳球蟲EtMIC4是一種血小板反應蛋白相關蛋白（thrombospondin-related anonymous protein， TRAP），與Rhomboid蛋白存在一定的相互作用，且Rhomboid蛋白能夠切割底物EtMIC4蛋白[34]；其 EGF-like 結構域與雞表皮表皮生長因子受體（chicken epidermal growth factor receptor，CER）存在相互作用[35]。柔嫩艾美耳球蟲14-3-3 蛋白能與粒酶逆轉錄酶（TERT）RNA 結合域（TRBD）發(fā)生相互作用，可能對端粒酶活性具有負向調節(jié)的作用[36]。下一步，我們將對獲得蛋白的基因進行克隆，利用酵母雙雜交、免疫共沉淀、BiFC等技術驗證其與EtAMA1之間的關系，以獲得真正能與EtAMA1發(fā)生相互作用的子孢子蛋白，為闡明EtAMA1在球蟲入侵宿主過程中發(fā)揮作用的分子機制奠定基礎。

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SCREENING OF THE POTENTIAL SPOROZOITE PROTEINS INTERACTING WITH EIMERIA TENELLA APICAL MEMBRANCE ANTIGEN-1

CUI Xiao-xia1, HUANG Bing1,3, ZHAO Qi-ping1, HAN Hong-yu1, ZHU Shun-hai1, XU Shuai-bing1, XIE Yu-xiang1, TANG Min1,2, YANG Zhi-yuan1,2, DONG Hui1

(1. Key Laboratory of Animal Parasitology of Ministry of Agriculture, Shanghai Veterinary Research Institute, CAAS, Shanghai 200241, China; 2. College of Life and Environment Sciences, Shanghai Normal University, Shanghai 200234, China;3. Jiangsu Co-innovation Center for Prevention and Control of Important Animal Infectious Diseases and Zoonoses, Yangzhou 225009, China)

In order to screen the potential sporozoite proteins interacting with Eimeria tenella apical membrance antigen 1(EtAMA1), the ectodomain of EtAMA1was amplifed in PCR with the cDNAs of the E. tenella sporozoite as template. The PCR products were subcloned to pGEX-6P-1 vector for expression of the recombinant protein. The purif ed recombinant protein EtAMA1-GST was identif ed in Western blot. The results showed that a protein about 75 kDa in accordance with molecular weight of target protein was recognized by anti-GSTantibody, which conf rmed that the expressed product was EtAMA1-GST fusion protein. Glutathione sepharose beads were incubated with EtAMA1-GST, GST protein or PBS and then the beads were incubated with sporozoite lysates. Bound proteins were eluted by using the sample buffer and eluants were subject to SDS-PAGE. The separated bands were digested and analyzed by mass spectrometry. The resulting protein peptides were blasted with Eimeria proteins database deposited in Uniprot and 10 potential sporozoite proteins were obtained. These proteins, mainly including microneme proteins, glycolytic enzymes, actin-related proteins and some hypothetical proteins, are involved in many molecular processes, such as invasion, development and energy metabolism. These results were informative for further elucidating the molecular mechanism of EtAMA1 that plays an important role in Eimeria host invasion.

Eimeria tenella; apical membrance antigen 1; GST pull-down; interacting protein

S852.723

A

1674-6422（2017）03-0061-07

2017-02-22

國家自然科學基金（31672551，31272557）；上海市閔行區(qū)人才發(fā)展專項基金（201351）

崔曉霞，女，碩士研究生，獸醫(yī)學專業(yè)

董輝，E-mail：donghui@shvri.ac.cn