郇貝麗，劉 珂，馬改妮，魏建超，邵東華，李蓓蓓，邱亞峰，石元元，馬志永

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所，上海200241）

·研究論文·

豬血清淀粉樣蛋白3分子SYBR GreenⅠ實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測方法的建立及初步應(yīng)用

郇貝麗，劉 珂，馬改妮，魏建超，邵東華，李蓓蓓，邱亞峰，石元元，馬志永

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所，上海200241）

分別根據(jù)豬血清淀粉樣蛋白3（serum amyloid A3，SAA3）基因序列以及豬三磷酸甘油醛脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）基因全長序列設(shè)計(jì)特異性擴(kuò)增引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并將PCR擴(kuò)增片段連接至相應(yīng)載體上構(gòu)建重組質(zhì)粒。兩個(gè)重組質(zhì)粒經(jīng)測序鑒定和純化后，倍比稀釋作為標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品，用于實(shí)時(shí)熒光定量PCR中SAA3、GAPDH標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備，并進(jìn)行反應(yīng)的靈敏性、特異性和重復(fù)性檢測。結(jié)果顯示，標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系 R2均在0.98以上；特異性檢測顯示該引物可以特異性檢測到豬 SAA3、GAPDH擴(kuò)增曲線；組內(nèi)和組間變異系數(shù)均小于5%，說明本研究成功建立豬SAA3的熒光定量PCR檢測方法。運(yùn)用建立的熒光定量RT-PCR對(duì)正常以及感染豬繁殖與呼吸綜合征病毒的肺泡巨噬細(xì)胞和豬組織進(jìn)行檢測，可檢測到豬SAA3的表達(dá)，正常組與接毒組之間顯示出明顯的表達(dá)差異。本研究初步建立了檢測豬SAA3基因的SYBR Green熒光定量RT-PCR的方法，為后續(xù)對(duì)豬傳染性疾病與豬 SAA3之間相互關(guān)系的研究提供了一種特異、靈敏的檢測方法。

豬血清淀粉樣蛋白3；SYBR GreenⅠ；實(shí)時(shí)熒光定量PCR

血清淀粉樣蛋白3（serum amyloid A3，SAA3）是血清淀粉樣蛋白（serum amyloid A，SAA）家族的一員。SAA是一類多基因編碼的多形態(tài)蛋白家族，屬于急性時(shí)相反應(yīng)蛋白, 在醫(yī)學(xué)上是炎性反應(yīng)的重要指標(biāo)。SAA基因含有4個(gè)外顯子和3個(gè)內(nèi)含子，包括SAA1、SAA2、SAA3、SAA4四個(gè)基因，豬的SAA基因位于2號(hào)染色體上，基因長度大約為60 kb。SAA3基因位于第4個(gè)外顯子處。SAA3是一種分泌蛋白，由130個(gè)氨基酸組成，其中1~18位氨基酸為信號(hào)肽。目前研究表明，SAA3是豬血液循環(huán)中主要的SAA蛋白。

本實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)SAA3可能是一種與PRRSV復(fù)制密切相關(guān)的因子，但是其與病毒相互作用的具體機(jī)制卻沒有相關(guān)報(bào)道。為進(jìn)一步研究SAA3與病毒相互作用機(jī)制及其與PRRSV臨床發(fā)病的關(guān)系，建立一種能高效檢測SAA3的方法非常必要。本研究針對(duì)豬SAA3基因保守區(qū)設(shè)計(jì)1對(duì)引物，擬建立一種能夠穩(wěn)定精確檢測豬SAA3基因表達(dá)的熒光定量RT-PCR方法，為針對(duì)SAA3分子的進(jìn)一步研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 豬組織樣品 所有豬組織樣品均由上海奉賢區(qū)某豬場提供。

1.2 主要試劑 Trizol 試劑、反轉(zhuǎn)錄酶MLV、RNA酶抑制劑、ExTaq DNA 聚合酶、pMD 18T載體、SYBR Green Ex Taq II及快速反轉(zhuǎn)錄試劑盒均購自大連TaKaRa公司；膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒購自康寧Axygen公司；動(dòng)物組織RNA試劑盒、大腸桿菌DH5α購自TIANGEN公司。

1.3 引物 根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫中的豬三磷酸甘油醛脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）、SAA3基因序列，利用Beacon Designer 7針對(duì)其保守區(qū)設(shè)計(jì)特異性引物。Sus scrofa GAPDH 1r：TCTGGCAAAG TGGACATT，Sus scrofa GAPDH 2r：GGTGGAATC ATACTGGAACA；Sus scrofa SAA3 1r：ATGGGC ATCATTCCTCAA，SAA3 2r：TTTGTAATTGG CTTCTCTCAT。利用Primer Premier 5.0引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)豬GAPDH、SAA3擴(kuò)增引物，Sus scrofa GAPDH 1R：TATAAATTCCGGCTGCAGCCTTCCC CTGCGCTCTCTGCTCCT，Sus scrofa GAPDH 2R：GGGTACAGTGTACTTTATTGATGGTACATGAC GAGGCAGGTCTCCCT，擴(kuò)增全長為1304 bp。Sus scrofa SAA3 1R：GCGTCGACATGAAGCTTTCCA CGGGCATCATTTTCTGCTTCCT，Sus scrofa SAA3 2R：CGGGATCCGTACTTGTCAGGCAGGCCACG AGGTCTGAAGTGGT，擴(kuò)增全長為393 bp。引物均由上海Invitrogen公司合成。

1.4 標(biāo)準(zhǔn)品的制備

1.4.1 細(xì)胞RNA的提取及反轉(zhuǎn)錄 細(xì)胞樣品按照Trizol法說明書提取總RNA，以2μL總RNA為模板進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，體系為20μL，包含1μL Random Primer隨機(jī)引物、4μL 5×反轉(zhuǎn)錄Buffer、2μL DTT，1μL dNTP mix(10 mmol/L)、1μL反轉(zhuǎn)錄酶（200 U/ μL）、1μL RNA RNase Inhibiton（20 U/μL），混勻后于37℃水浴作用1.5 h，用于豬SAA3、GAPDH擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)。

1.4.2 標(biāo)準(zhǔn)品目的片段PCR及重組質(zhì)粒的構(gòu)建 豬GAPDH基因擴(kuò)增體系：cDNA模板2 μL、上下游引物各0.25 μL（50 pmol/μL）、dNTP Mixture（2.5mmol/μL）4 μL、Ex Taq酶0.5 μL，10×PCR Buffer 2.5 μL，加水至25 μL。反應(yīng)程序：98℃預(yù)變性5 min；98℃變性1 min，56℃退火30 s，72℃延伸2 min，共35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。反應(yīng)結(jié)束后，取50 μL PCR 產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠上電泳檢測擴(kuò)增結(jié)果?；厥占兓康钠危cpMD 18 T載體連接，轉(zhuǎn)化至DH5α大腸桿菌，提取質(zhì)粒進(jìn)行PCR鑒定和序列測定，挑選結(jié)果正確的質(zhì)粒并測定其濃度。

豬SAA3基因擴(kuò)增體系：cDNA模板2 μL、上下游引物各0.25 μL（50 pmol/μL）、dNTP Mixture（10 mmol/μL）0.5 μL、Q5高保真酶0.5 μL、10×PCR Buffer 2.5μL，加水至25 μL。反應(yīng)程序：98℃預(yù)變性5 min；98℃變性1 min，56℃退火30 s，72℃延伸30 s，共35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。反應(yīng)結(jié)束后，取50 μL PCR產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠上電泳檢測擴(kuò)增結(jié)果?；厥占兓康钠危cpFlag7.1載體連接，轉(zhuǎn)化至DH5α大腸桿菌，提取質(zhì)粒進(jìn)行PCR鑒定和序列測定，挑選結(jié)果正確的質(zhì)粒并測定其濃度。

1.5 實(shí)驗(yàn)樣品的制備 將PAM細(xì)胞鋪于24孔板，貼壁后，實(shí)驗(yàn)組接種0.1MOI的豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV），對(duì)照組接種等量的PBS，每組3個(gè)重復(fù)。24 h后，按照Trizol法說明書提取總RNA。然后按照上述標(biāo)準(zhǔn)品的反轉(zhuǎn)錄體系進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)產(chǎn)物用于實(shí)時(shí)熒光定量實(shí)驗(yàn)。

選取30日齡健康小豬，實(shí)驗(yàn)組頸部肌肉注射1 mLPRRSV（病毒滴度107），鼻腔灌注1 mL PRRSV，對(duì)照組接種等量的PBS。接毒后2周，分別采集豬各種組織，按照Trizol法說明書提取總RNA，然后按照上述反轉(zhuǎn)錄體系進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。

1.6 SYBR GreenⅠ實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測方法的建立

1.6.1 SYBR GreenⅠ熒光定量PCR 反應(yīng)體系的建立及優(yōu)化 以質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品為模板，反應(yīng)體系為20μL，分別對(duì)引物、模板、SYBR GreenⅠmix的最佳使用量，以及反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化并繪制熔解曲線。

1.6.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 將豬的SAA3、GAPDH標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒按 10倍梯度稀釋，分別取5個(gè)連續(xù)稀釋度：SAA3標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒為1.9×107~1.9×103copies/μL， GAPDH標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒為9.4×107~9.4×103copies/μL。分別將這些稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒作為模板進(jìn)行熒光定量PCR，每個(gè)稀釋度設(shè)3個(gè)重復(fù)。標(biāo)準(zhǔn)曲線由ABi7500熒光定量PCR儀自動(dòng)生成，橫坐標(biāo)代表拷貝數(shù)，縱坐標(biāo)代表Ct值。

1.7 敏感性試驗(yàn) 分別選取1.9 ×107~1.9 ×103copies/ μL SAA重組質(zhì)粒，以及9.4×107~9.4×103copies/ μL GAPDH重組質(zhì)粒進(jìn)行敏感性試驗(yàn)，同時(shí)將熒光定量PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.8 重復(fù)性試驗(yàn) 對(duì)3份不同批次的陽性標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行批內(nèi)重復(fù)試驗(yàn)和批間重復(fù)試驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 豬SAA3,GAPDH基因克隆結(jié)果 將反轉(zhuǎn)錄、PCR擴(kuò)增獲得的豬GAPDH、SAA3基因分別與pMD 18 T載體和pFlag7.1載體連接，對(duì)構(gòu)建的重組載體進(jìn)行PCR鑒定，分別獲得大小為393 bp的SAA3基因片段，以及1304 bp的GAPDH的基因片段，測序結(jié)果與GenBank數(shù)據(jù)庫中豬SAA3、GAPDH基因相符，表明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

圖1 豬SAA3、GAPDH的PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 PCR-amplif ed result of porcine SAA3,GAPDHM: DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)(DL2000); 1:SAA3基因; 2: GAPDH基因M: DNA Marker(DL2000); 1: PCR products of SAA3 gene; 2: PCR products of GAPDH

2.2 質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的制備 鑒定正確的重組質(zhì)粒經(jīng)核酸濃度檢測儀檢測，SAA3重組質(zhì)粒的質(zhì)量濃度為419 ng/μL，換算成拷貝數(shù)為1.94×1010，按1:10梯度稀釋成1.94×107~1.94×103copies/μL的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品，作為標(biāo)準(zhǔn)曲線制作的模板。GAPDH重組質(zhì)粒的質(zhì)量濃度9.44×1010，按1:10梯度稀釋成9.44×107~9.44×103copies/μL的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品，作為標(biāo)準(zhǔn)曲線制作的模板。

2.3 反應(yīng)體系中各組分的優(yōu)化和條件的優(yōu)化

2.3.1 反應(yīng)體系中各組分的優(yōu)化 向Real-time PCR 檢測體系中分別逐次加入不同終濃度的引物和模板，分析檢測結(jié)果的重復(fù)性和擴(kuò)增效率，最終篩選出最佳反應(yīng)體系（20 μL）：2×SYBR Green Premix Ex Taq II 10 μL、上下游引物各0.4 μL（25 pmol/L）、模板（質(zhì)?；騝DNA）1μL、ROX Reference Dye（50×）0.4 μL、DEPC水7.8 μL。

2.3.2 反應(yīng)體系中反應(yīng)條件的優(yōu)化 分別選取SAA3重組質(zhì)粒模板1.94×105copies/μL、GAPDH重組質(zhì)粒9.44×105copies/μL，進(jìn)行Real-time PCR 檢測，改變退火延伸溫度，每種溫度分別重復(fù)4次，最終篩選出最佳循環(huán)參數(shù)：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性5 s，60℃退火及延伸34 s，擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)，用此參數(shù)進(jìn)行擴(kuò)增重復(fù)性較好且擴(kuò)增效率較高。

2.4 SYBR Green I 實(shí)時(shí)熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 對(duì)SAA3陽性重組質(zhì)粒進(jìn)行10倍稀釋，獲得1.9 ×107、1.9 ×106、1.9 ×105、1.9 ×104、1.9 ×103copies/μL五個(gè)濃度梯度，同時(shí)對(duì)GAPDH陽性重組質(zhì)粒進(jìn)行10倍梯度稀釋，獲得9.4×107、9.4×106、9.4×105、9.4×104、9.4×103copies/μL五個(gè)濃度梯度，作為標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)。擴(kuò)增曲線見圖2A（橫坐標(biāo)為循環(huán)數(shù)，縱坐標(biāo)為熒光值），根據(jù)擴(kuò)增結(jié)果分別繪制了SAA3和GAPDH的標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖2B），（橫坐標(biāo)為拷貝數(shù)，縱坐標(biāo)為Ct值）。由SAA3標(biāo)準(zhǔn)曲線可知：斜率為-3.418，相關(guān)系數(shù)為0.985，擴(kuò)增效率為96.145%。由GAPDH標(biāo)準(zhǔn)曲線可知：斜率為-3.442，相關(guān)系數(shù)為0.984，擴(kuò)增效率為95.23%。

2.5 SYBR Green I實(shí)時(shí)熒光定量PCR的熔解曲線 根據(jù)參數(shù)95℃ 15 s、60℃ 1 min、95℃ 10 s繪制熔解曲線。結(jié)果顯示，標(biāo)準(zhǔn)樣品均出現(xiàn)了窄且尖的單峰，無雜峰出現(xiàn)（圖3），表明該SYBR GreenⅠ實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)為特異性擴(kuò)增。

2.6 敏感性試驗(yàn)結(jié)果 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測梯度稀釋的標(biāo)準(zhǔn)樣品，在35個(gè)循環(huán)內(nèi)的Ct 值> 0，且相鄰稀釋梯度拷貝數(shù)呈10倍關(guān)系。將稀釋5個(gè)梯度的標(biāo)準(zhǔn)樣品用普通PCR進(jìn)行檢測，并進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳（圖4），結(jié)果與實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果相符。

圖2 SYBR Green I實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測豬SAA3和GAPDH的擴(kuò)增曲線和(A)標(biāo)準(zhǔn)曲線（B）Fig. 2 Amplif cation plots (A ) and standard curve (B) of SYBR Green I Real-time f uorescent quantitative RT-PCR

圖3 SYBR Green Ⅰ實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測豬GAPDH和SAA3標(biāo)準(zhǔn)品的熔解曲線Fig. 3 The melting curve of SYBR Green I Real-time f uorescence quantitative RT-PCR for detection of porcine GAPDH and SAA3 standard

圖4 豬GAPDH和SAA3標(biāo)準(zhǔn)品PCR檢測結(jié)果Fig. 4 Result of Real-time PCR for detection of porcine GAPDH and SAA3 standardM: DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)(DL2000); 100、101、102、103、104為GAPDH和SAA3標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋倍數(shù)M:DNA Marker(DL2000); 100, 101, 102, 103, 104were the dilution multiple of GAPDH and SAA3 standard

2.7 SYBR GreenⅠ實(shí)時(shí)熒光定量PCR的重復(fù)性 SAA重復(fù)性實(shí)驗(yàn)（表1）和GAPDH重復(fù)性實(shí)驗(yàn)（表2）結(jié)果顯示，建立的實(shí)時(shí)熒光定量PCR重復(fù)性良好，變異系數(shù)均在5%以下，進(jìn)一步證實(shí)該方法檢測豬GAPDH、SAA3基因高效、可信。

表1 豬SAA3實(shí)時(shí)熒光定量PCR重復(fù)性檢測結(jié)果（n=3）Table 1 Reproducibility assay of Real-time f uorescent quantitative RT-PCR for porcine SAA3

表2 豬GAPDH的實(shí)時(shí)熒光定量PCR重復(fù)性檢測結(jié)果（n=3）Table 2 Reproducibility assay of Real-time f uorescent quantitative RT-PCR for porcine GAPDH

2.8 SYBR Green I實(shí)時(shí)熒光定量PCR對(duì)細(xì)胞樣品和組織樣品的檢測結(jié)果 采用建立的熒光定量PCR方法對(duì)細(xì)胞樣品中SAA3、GAPDH的絕對(duì)量進(jìn)行檢測，然后用SAA3的絕對(duì)量與GAPDH的絕對(duì)量比值代表SAA3最終的相對(duì)含量。結(jié)果顯示，接毒的PAM細(xì)胞中SAA3的含量是正常PAM細(xì)胞中的7倍左右（圖5A）。這一結(jié)果為進(jìn)一步研究PRRRSV感染和SAA3之間的關(guān)系奠定了基礎(chǔ) 。

采用建立的熒光定量PCR方法對(duì)組織樣品中SAA3、GAPDH的絕對(duì)量進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示，感染PRRSV之后，各個(gè)組織中的SAA3含量都有一定量的增加，但是在肺臟中增加最明顯，增加了大約200倍。在肝臟、脾臟以及淋巴結(jié)中也有不同程度的增加（圖5B）。

3 討論

圖5 細(xì)胞和組織樣品中SAA3、GAPDH的SYBR Green I實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測Fig. 5 Detection results of SAA3、GAPDH in cells and tissues by SYBR Green I Real-time f uorescent quantitative RT-PCR

血清淀粉樣蛋白A（SAA）是一類多基因編碼的多形態(tài)蛋白家族，組織淀粉樣蛋白A的前體物質(zhì)，屬于急性應(yīng)答蛋白。炎癥或感染急性期其在48~72 h內(nèi)即迅速升高現(xiàn)象，并且在疾病的恢復(fù)期迅速下降。目前細(xì)菌、病毒感染、動(dòng)脈粥樣硬化、冠心病、急性移植排斥反應(yīng)、腫瘤等疾病中均檢測到血清SAA升高。某些疾病，如病毒感染、移植排斥反應(yīng)、冠心病等，SAA的敏感性高于CRP，可為臨床提供更好的參考價(jià)值。在人類SAA家族中，SAA1、SAA2屬于急性期蛋白，SAA4屬于組成型表達(dá)蛋白，SAA3屬于假基因。但是研究報(bào)道，豬SAA3蛋白是血液循環(huán)中主要的SAA蛋白，所以建立一種準(zhǔn)確檢測豬SAA3的方法就尤為重要。

SAA蛋白具有多種功能，它不僅是一種急性反應(yīng)蛋白、載脂蛋白，也有相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道顯示，SAA具有抗病毒作用。本實(shí)驗(yàn)室研究發(fā)現(xiàn)，豬SAA3顯示出抗PRRSV的作用，所以建立準(zhǔn)確、穩(wěn)定的豬SAA3分子檢測方法是進(jìn)一步研究SAA3在體內(nèi)與病毒相互作用機(jī)制的重要基礎(chǔ)。本研究建立的實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測方法靈敏度高，特異性強(qiáng)，重復(fù)性好，對(duì)3份不同批次的標(biāo)準(zhǔn)品分別進(jìn)行3個(gè)批內(nèi)重復(fù)和批間重復(fù), 變異系數(shù)均小于5%。用建立的RT-PCR方法對(duì)正常細(xì)胞以及感染PRRSV病毒的細(xì)胞樣品、正常組織以及感染病毒的組織樣品進(jìn)行檢測，都顯現(xiàn)出明顯的差異。

綜上所述，本研究建立的SYBR Green I 熒光定量PCR 檢測方法可以定性和定量檢測豬SAA3的表達(dá)，實(shí)時(shí)分析樣品中SAA3基因的表達(dá)含量，為深入研究豬SAA3的功能和機(jī)制打下基礎(chǔ)。

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DEVELOPMENT AND PRELIMINARY APPLICATION OF SYBR GREEN I REAL-TIME PCR ASSAY FOR DETECTION AND QUANTITATION OF PORCINE SERUM AMYLOID PROTEIN 3 (SAA3)

HUAN Bei-li, LIU Ke, MA Gai-ni, WEI Jian-chao, SHAO Dong-hua, LI Bei-bei, QIU Ya-feng, SHI Yuan-yuan, MA Zhi-yong

(Shanghai Veterinary Research Institute, CAAS, Shanghai 200241, China)

The objective of the present study was to develop a SYBR GreenⅠ Real-time PCR assay for detecting and quantifying porcine serum amyloid protein 3 (SAA3). According to the SAA3 (NM_001044552.1) and GAPDH (AF017079.1) gene sequences, specific primes were designed to their amplif cation. The resulting fragments were cloned into the vector to construct the recombinant plasmids. Using the recombinant plasmids as standard products, a Real-time quantitative RT-PCR was performed to construct the standard curves of porcine SAA and GAPDH and detect the sensitivity, specif city and repeatability. The results showed a precise linear relationship with a correlation coeff cient of R2> 0.98. The amplif cation curves showing a single peak was detected for porcine SAA3 and GAPDH. Thecoeff cient of variation was less than 0.5% within and between the assays. The SYBR GreenⅠ Real time PCR assay was used to detect porcine tissues and PAMs treated with PRRSV(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus). Porcine SAA3 was found in these samples and there was signif cant difference in SAA3 content between infection group and control group. The SYBR GreenⅠ Real-time PCR assay developed here was highly specif c, sensitive, and reproducible and might be a tool for monitoring the relationship between pig infectious diseases and porcine SAA3.

Serum amyloid A3(SAA3); SYBR GreenⅠ; Real-time quantitative RT-PCR

S852.42

A

1674-6422（2017）03-0080-07

2016-08-20

973計(jì)劃（2014CB542702）

郇貝麗，女，碩士研究生，預(yù)防獸醫(yī)學(xué)專業(yè)

馬志永，E-mail：zhiyongma@shori.ac.an