武吉強(qiáng)，徐晶晶，童 武，王 濤，葉 超，鄭 浩，單同領(lǐng)，童光志,2，李國(guó)新,2

（1. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所，上海 200241；2. 江蘇高校動(dòng)物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，揚(yáng)州 225009）

·研究論文·

偽狂犬病病毒變異株gE蛋白單克隆抗體的制備與鑒定

武吉強(qiáng)1，徐晶晶1，童 武1，王 濤1，葉 超1，鄭 浩1，單同領(lǐng)1，童光志1,2，李國(guó)新1,2

（1. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所，上海 200241；2. 江蘇高校動(dòng)物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，揚(yáng)州 225009）

為制備偽狂犬病病毒變異株gE蛋白的單克隆抗體，PCR擴(kuò)增偽狂犬病病毒gE蛋白主要抗原表位區(qū)的基因片段，并將其克隆至原核表達(dá)載體pCold-TF。經(jīng)1 mmol/L IPTG低溫誘導(dǎo)，表達(dá)了約90 kDa的gE融合蛋白。融合蛋白用鎳離子金屬親和層析柱純化后，免疫6周齡BALB/c雌性小鼠，經(jīng)細(xì)胞融合和篩選，獲得了2株穩(wěn)定分泌抗gE蛋白單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞（5B2和6E6）。間接免疫熒光試驗(yàn)（indirect immunof uorescence assay，IFA）顯示2株單克隆抗體均能與PRV變異株（JS-2012）反應(yīng)，但與gE缺失的疫苗毒Bartha-K61株無(wú)反應(yīng)。Western blot結(jié)果顯示5B2和6E6與gE蛋白不反應(yīng)，提示2株單克隆抗體針對(duì)的可能是gE蛋白的構(gòu)象表位。本研究獲得的gE蛋白單克隆抗體為偽狂犬病病毒變異株的鑒定與功能研究以及野毒株和疫苗株的鑒別診斷提供了良好的工具。

偽狂犬病毒；變異株；gE蛋白；單克隆抗體

偽狂犬?。╬seudorabies，PR），是由偽狂犬病毒（Pseudorabies virus，PRV）引起多種動(dòng)物發(fā)熱、奇癢、腦脊髓炎為主要特征的一種急性烈性傳染病，又稱Aujeszky's病[1,2]。PRV屬于皰疹病毒科，α皰疹病毒亞科成員，雙鏈線狀DNA病毒。豬是該病原的主要宿主和傳染源，成年豬大多為隱性感染，仔豬發(fā)病主要表現(xiàn)為發(fā)熱，食欲不振，精神萎靡，伴有明顯的神經(jīng)癥狀。妊娠母豬感染會(huì)導(dǎo)致流產(chǎn)，產(chǎn)死胎及木乃伊胎[3]。隨著養(yǎng)殖業(yè)的規(guī)?；l(fā)展，該病的發(fā)生及流行日趨嚴(yán)重，癥狀愈發(fā)明顯[4]。該病也給全世界養(yǎng)豬業(yè)帶來(lái)了極大的經(jīng)濟(jì)損失。

偽狂犬病毒的gE基因位于US區(qū)，全長(zhǎng)1.7 kb，是偽狂犬病毒的主要毒力基因之一[5]。偽狂犬病自我國(guó)發(fā)現(xiàn)以來(lái)一直在豬群中流行，gE基因缺失活疫苗的廣泛使用使得該病得到了有效控。但由于偽狂犬病有著高度的潛伏感染特性，易在體內(nèi)外環(huán)境變化的應(yīng)激下爆發(fā)疫情[6]。gE-ELISA配合gE基因缺失疫苗使用，能用血清學(xué)方法鑒別出疫苗接種豬和野毒感染住，對(duì)于偽狂犬病的防控與凈化具有重要意義。隨著2011年偽狂犬病在中國(guó)爆發(fā)[7,8]，偽狂犬病毒毒力增強(qiáng)，傳統(tǒng)疫苗不能對(duì)新出現(xiàn)的變異毒株提供完全保護(hù)，這提示單純使用疫苗不可能根除偽狂犬病[9]。為了有效控制直至根除偽狂犬病，需建立一種有效快速的血清學(xué)診斷方法以區(qū)分野毒株感染豬與疫苗免疫豬。本研究研制了針對(duì)偽狂犬病毒變異株gE蛋白的單克隆抗體，這為偽狂犬病病毒變異株的鑒定、及建立血清學(xué)鑒別診斷方法奠定了良好的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 毒株、細(xì)胞和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 偽狂犬病病毒JS-2012株，Bartha-K61株，SP2/0骨髓瘤細(xì)胞，PK-15細(xì)胞，Vero細(xì)胞均由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所保存。BALB/c雌性小鼠購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物公司。

1.2 載體、試劑和菌株 pCold-TF載體，大腸桿菌BL21（DE3）購(gòu)自TaKaRa（上海）公司；HRP標(biāo)記的山羊抗鼠IgG、FITC標(biāo)記的山羊抗鼠IgG和FBS購(gòu)于Sigma（上海）公司；核酸內(nèi)切酶EcoR I購(gòu)自NEB（上海）公司。

1.3 pCold-gE重組質(zhì)粒的構(gòu)建 根據(jù)NCBI發(fā)表的PRV（JS-2012）gE基因序列（序列號(hào)：KP257591.1），設(shè)計(jì)特異性引物擴(kuò)增gE基因第151~750位核苷酸。gE-F：5'-accctcgagggatccgaattcATGACCGAGGCCG ACGAC-3'，gE-R：5'-caggtcgacaagcttgaattcTTAG ACCACGCGCGGCAT-3'。小寫核苷酸為與pCold-TF進(jìn)行同源重組的同源臂序列，擴(kuò)增產(chǎn)物為600 bp。按照天根DNA小量提取試劑盒說(shuō)明書提取PRV（JS-2012）DNA（-20℃保存），用PrimeSTAR HS（TaKaRa）高保真酶擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增程序：95℃預(yù)變性5 min；98℃變性10 s，68℃退火10 s，72℃延伸1 min（35個(gè)循環(huán)）；72℃延伸10 min。將PCR產(chǎn)物通過(guò)同源重組（諾唯贊）的方法，與pCold-TF載體多克隆位點(diǎn)的相應(yīng)位置重組，質(zhì)粒測(cè)序正確后，陽(yáng)性質(zhì)粒命名為pCold-gE。

1.4 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)與純化 將重組質(zhì)粒pColdgE轉(zhuǎn)化到BL21（DE3）大腸桿菌中，37℃振蕩培養(yǎng)至OD600值達(dá)到0.6~0.8時(shí)，加入終濃度為1 mmol/ L的IPTG誘導(dǎo)，16℃振蕩24 h。收集菌體加入PBS進(jìn)行超聲裂解，加入5×SDS buffer煮沸10 min后進(jìn)行SDS-PAGE電泳，對(duì)SDS-PAGE蛋白膠進(jìn)行考馬斯亮藍(lán)染色，觀察蛋白表達(dá)情況，同時(shí)設(shè)置空載體表達(dá)組作為對(duì)照。之后將pCold-gE轉(zhuǎn)化表達(dá)菌按1:1000比例接種到4 mL含100 μg/mL Amp的LB培養(yǎng)基中，37℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)12 h。然后再按1:100將復(fù)蘇的菌液接種于100 mL含100 μg/mL Amp的LB培養(yǎng)液中，37℃、200 r/min培養(yǎng)，至OD600達(dá)到0.6~0.8時(shí)停止，加入終濃度為1 mmol/L IPTG，16℃誘導(dǎo)24 h后，離心收集菌體。表達(dá)后的菌體進(jìn)行超聲破碎，差速離心后收集上清蛋白。采用帶His標(biāo)簽的磁珠（Biotool）根據(jù)說(shuō)明書進(jìn)行純化，純化的蛋白分裝后保存于-80℃。

1.5 小鼠免疫 取100 μg純化蛋白與弗式完全佐劑1:1混合乳化，接種6周齡健康雌性BALB/c小鼠，此后每隔2周用等量純化蛋白與弗氏不完全佐劑乳化進(jìn)行第二和第三次免疫，第三次免疫后第10天采血，測(cè)定ELISA抗體效價(jià)，效價(jià)在1:10000以上的小鼠，在細(xì)胞融合前3~4 d經(jīng)腹腔注射純抗原200 μg，進(jìn)行加強(qiáng)免疫。

1.6 McAbs的制備 融合前1 d取小鼠腹腔巨噬細(xì)胞作為飼養(yǎng)層細(xì)胞，之后選取免疫效價(jià)最高的小鼠進(jìn)行脾細(xì)胞與SP2/0細(xì)胞融合。將雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)在鋪有飼養(yǎng)層細(xì)胞的96孔板里，于37℃、5% CO2在HAT選擇性培養(yǎng)基條件下培養(yǎng)。在雜交瘤細(xì)胞長(zhǎng)滿96孔板1/3~1/2面積時(shí)，通過(guò)間接ELISA、IFA方法檢測(cè)來(lái)篩選陽(yáng)性細(xì)胞克隆株。將篩選的陽(yáng)性細(xì)胞克隆株經(jīng)3~5輪細(xì)胞亞克隆之后，對(duì)能穩(wěn)定分泌抗體的雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，液氮凍存。將篩選的雜交瘤細(xì)胞株連續(xù)傳代20代，分別取第5、10、15和20代細(xì)胞上清液，用間接ELISA的方法進(jìn)行檢測(cè)，鑒定雜交瘤細(xì)胞分泌抗體穩(wěn)定性。

1.7 間接免疫熒光試驗(yàn)檢測(cè)單克隆抗體 將Vero細(xì)胞鋪在12孔板中，1 MOI PRV感染18 h后，棄去上清后，用PBS洗3遍，用丙醇在-20℃固定細(xì)胞20 min，5% BSA室溫封閉1 h，PBS洗板之后加入收集的雜交瘤細(xì)胞上清液，室溫孵育1 h。PBS洗3遍，避光加入FITC標(biāo)記的羊抗鼠IgG（1:800 PBS稀釋）室溫避光孵育1 h。在熒光顯微鏡下觀察熒光。

1.8 Western blot檢測(cè)單克隆抗體 將PRV（JS-2012）病毒感染Vero細(xì)胞，12 h后用細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞，收取細(xì)胞蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳。使用Trans-Blot? SD cell system （BIO-RAD，USA）轉(zhuǎn)印NC膜，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，用1:500稀釋的雜交瘤細(xì)胞上清4℃孵育10 h，TBST洗膜3次后，20 min/次。加入1: 5000稀釋的HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG，室溫反應(yīng)1 h，TBST洗膜后，經(jīng)過(guò)發(fā)光、曝光、顯影、定影之后掃描圖片。

2 結(jié)果

2.1 pCold-gE重組質(zhì)粒的構(gòu)建 PCR擴(kuò)增得到了偽狂犬病毒gE基因片段，大小約600 bp（圖1A），將目的片段純化回收并克隆到pCold-TF表達(dá)載體中。重組質(zhì)粒酶切鑒定結(jié)果顯示，陽(yáng)性質(zhì)粒出現(xiàn)與預(yù)期大小一致的片段（圖1B）。測(cè)序結(jié)果顯示陽(yáng)性質(zhì)粒攜帶目的基因與預(yù)期序列一致，陽(yáng)性質(zhì)粒pCold-gE可以用于下一步的試驗(yàn)研究。

圖1 gE基因擴(kuò)增和重組質(zhì)粒pCold -gE酶切鑒定Fig.1 Amplif cation of gE gene and identif cation of recombination plasmid pCold-gE by restriction enzymes digestionA: gE基因的PCR擴(kuò)增. 1: gE基因 PCR擴(kuò)增結(jié)果; 2:陰性對(duì)照; M: DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)(DL2000)B: 重組質(zhì)粒pCold-gE酶切鑒定. 1: pCold-TF; 2: pCold-gE; M: DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)(DL2000)A: PCR amplif cation of gE gene. 1: PCR amplif cation result of gE gene; 2: Negative control; M: DNA Marker(DL2000)B: Identif cation of recombination plasmid pCold-gE by restriction enzymes digestion. 1: pCold-TF; 2: pCold-gE; M: DNA Marker(DL2000)

2.2 重組gE蛋白的表達(dá)純化 pCold-gE載體轉(zhuǎn)化的表達(dá)菌E.coli BL21（DE3）經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，收集菌體超聲裂解進(jìn)行SDS-PAGE凝膠檢測(cè)。結(jié)果顯示，與載體對(duì)照組相比，pCold-gE表達(dá)菌出現(xiàn)了相對(duì)分子量約為90 kDa（TF輔助蛋白約60 kDa）的目的條帶，與重組蛋白大小相符。目的蛋白主要都在裂解物上清中。重組蛋白經(jīng)磁珠純化后，電泳結(jié)果顯示純化目的蛋白純度較高（圖2）。

2.3 間接免疫熒光試驗(yàn)檢測(cè)gE單克隆抗體的特異性

以1 MOI PRV（JS-2012株或Bartha-K61株）感染Vero細(xì)胞24 h，固定細(xì)胞進(jìn)行間接免疫熒光試驗(yàn)，以檢測(cè)單克隆抗體與不同毒株的特異性反應(yīng)。結(jié)果顯示，2株單克隆抗體均能與PRV JS-2012毒株反應(yīng)，而不與Bartha-K61毒株反應(yīng)，也不與Vero細(xì)胞發(fā)生反應(yīng)（圖3）。

圖2 純化前后的gE重組蛋白的SDS-PAGE分析Fig.2 SDS-PAGE analysis of expression and purif cation of recombinant gE protein1: 純化的重組gE蛋白; 2: IPTG誘導(dǎo)的pCold-gE轉(zhuǎn)化菌裂解物上清; 3: IPTG誘導(dǎo)的pCold-gE轉(zhuǎn)化菌裂解物沉淀; 4: IPTG誘導(dǎo)的pCold -TF轉(zhuǎn)化菌; M:蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)1: Purif ed fusion gE protein; 2: Supernatant of lysate of pColdgE induced by IPTG; 3: Pallet of lysate of pCold-gE induced by IPTG; 4: pCold -TF induced by IPTG; M: Protein Marker

圖3 IFA鑒定gE蛋白單克隆抗體的特異性Fig.3 Identif cation of anti-gE McAbs by IFA

2.4 Western blot檢測(cè)gE單克隆抗體的特異性 以1 MOI PRV（JS-2012株或Bartha-K61株）感染Vero細(xì)胞24 h，收集細(xì)胞后，用Western blot方法檢測(cè)單克隆抗體與不同毒株的特異性反應(yīng)。結(jié)果顯示，2株單克隆抗體均不與JS-2012毒株發(fā)生反應(yīng)（圖略）。

3 討論

豬偽狂犬病是由偽狂犬病毒引起的一種烈性傳染病，該病在世界大部分地區(qū)流行。為了徹底凈化偽狂犬病，許多國(guó)家實(shí)施了根除計(jì)劃[10,11]。而gE基因缺失疫苗的廣泛的應(yīng)用使控制和消滅該病是成為可能。2011年以來(lái)，我國(guó)發(fā)生了由偽狂犬病病毒變異株引起的豬偽狂犬病，給我國(guó)養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。2012年，我們分離到1株P(guān)RV變異毒株（JS-2012株），與經(jīng)典強(qiáng)毒株相比，該變異毒株致病力明顯增強(qiáng)，基因序列發(fā)生了改變，主要毒力基因gE也發(fā)生了改變[7]。偽狂犬病潛伏感染能力強(qiáng)，能夠有效區(qū)分疫苗免疫豬與野毒感染豬的血清學(xué)檢驗(yàn)方法是凈化甚至根除PR的重要手段。目前，檢驗(yàn)gE抗體的商品化試劑盒已有多種。本研究研制的抗偽狂犬病病毒變異株gE蛋白單克隆抗體，與PRV具有良好的反應(yīng)性，可以用來(lái)研制具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的檢測(cè)gE抗體的試劑盒。

gE基因是PRV主要毒力基因之一，也是基因缺失疫苗的靶基因。gE基因位于基因組的US區(qū)，全長(zhǎng)1.7 kb，是病毒的糖蛋白之一，由N端的胞外區(qū)，中間的跨膜區(qū)及C端的胞內(nèi)區(qū)組成[12]。PRV gE蛋白已經(jīng)鑒定出的6個(gè)抗原表位中，有5個(gè)位于N端的52~238位氨基酸之間[13,14]。本研究表達(dá)的gE蛋白（第150~750位氨基酸）包含了上述5個(gè)抗原表位。間接免疫熒光試驗(yàn)（IFA）結(jié)果顯示，本研究獲得的2株單克隆抗體（5B2和6E6）均能與PRV變異株（JS-2012）反應(yīng)，但與gE缺失的疫苗毒Bartha-K61株無(wú)反應(yīng)。Western blot結(jié)果顯示，5B2和6E6均不能與PRV（JS-2012株）gE蛋白反應(yīng)。上述結(jié)果提示，5B2和6E6單克隆抗體針對(duì)的可能是gE蛋白的構(gòu)象表位，這與本研究表達(dá)的融合蛋白具有良好的可溶性密切相關(guān)，融合蛋白可能形成了簡(jiǎn)單的構(gòu)象結(jié)構(gòu)?？傊?，上述2株單克隆抗體均具有建立檢測(cè)gE抗體的檢測(cè)方法的潛力。

本研究利用pCold-TF表達(dá)載體表達(dá)了偽狂犬病病毒gE可溶性融合蛋白，并制備了2株特異性單克隆抗體。這些抗體為偽狂犬病病毒變異株的鑒定及建立相應(yīng)的gE抗體檢測(cè)方法奠定了良好的基礎(chǔ)。

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GENERATION AND CHARACTERIZATION OF MONOCLONAL ANTIBODIES AGAINST GE PROTEIN OF PSEUDORABIES VIRUS VARIANT STRAIN

WU Ji-qiang1, XU Jing-jing1, TONG Wu1, WANG Tao1, YE Chao1, ZHENG Hao1, SHAN Tong-ling1, TONG Guang-zhi1,2, LI Guo-xin1,2

(1. Shanghai Veterinary Research Institute, CAAS, Shanghai 200241, China; 2. Jiangsu Co-innovation Center for Prevention and Control of Important Animal Infectious Diseases and Zoonoses, Yangzhou 225009, China)

The gene encoding the key antigenic epitope regions of gE of pseudorabies virus (PRV) was amplif ed in PCR and inserted into the pCold-TF expression vector. Expression of the recombinant fusion protein about 90 kDa was observed under 1mmol/L IPTG environment. The recombinant gE protein purified with nickel ion metal affinity chromatography was used to immunize 6-week-old BALB/c female mice for the preparation of monoclonal antibodies (McAbs). Two hybridoma cell lines (5B2 and 6E6) were obtained for stably producing anti-gE protein McAb. These two McAbs reacted with PRV variant strain (JS-2012) but not with the gE deleted vaccine virus Bartha-K61 strain in indirect immunof uorescence assay（IFA). Western blot results showed that 5B2 and 6E6 did not reactwith PRV(JS-2012). The results indicated that 5B2 and 6E6 might be against confomational epitope of gE. These specif c monoclonal antibodies might provide a good tool for the development of PRV diagnostic method.

Pseudorabies virus; variant strain; gE protein; monoclonal antibodies

S852.659.1

A

1674-6422（2017）03-0023-05

2017-03-08

上海市閔行區(qū)人才發(fā)展專項(xiàng)基金；上海市自然科學(xué)基金項(xiàng)目（14ZR1448900)；上海市科技興農(nóng)重點(diǎn)攻關(guān)項(xiàng)目（滬農(nóng)科攻字（2015）第1-7號(hào), 滬農(nóng)科攻字（2016）第4-2號(hào)）；國(guó)家生豬現(xiàn)代產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系項(xiàng)目（CARS-36）

武吉強(qiáng)，男，碩士研究生，預(yù)防獸醫(yī)學(xué)專業(yè)

李國(guó)新，E-mail：guoxinli@shvri.ac.cn