連大衛(wèi) ，任文康，扶麗君，許藝飛，黃萍，操紅纓

（廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，廣州 510405）

幽門螺桿菌感染細胞炎癥模型的建立及評價

連大衛(wèi) ，任文康，扶麗君，許藝飛，黃萍，操紅纓*

（廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，廣州 510405）

目的建立和評價幽門螺桿菌（H.pylori）感染的2種細胞感染模型，為進一步研究H.pylori感染及其相關(guān)機制奠定基礎(chǔ)。方法培養(yǎng)人胃癌細胞株MKN45細胞，與H.pylori共孵育6h、12h和24h建立MKN45細胞H.pylori感染模型，臺盼藍染色和乳酸脫氫酶（LDH）法測定感染細胞存活率，熒光顯微鏡照相和流式細胞儀檢測Rhodamine123染色的細胞線粒體膜電位；培養(yǎng)小鼠巨噬細胞株RAW 264.7細胞，與H.pylori共孵育6h、12h和24h建立RAW 264.7細胞H.pylori感染模型，Griess法檢測感染細胞上清液中NO的含量變化，RT-qPCR法檢測感染細胞中Tnf-α，Inos和Cox-2基因表達變化。結(jié)果在MKN45細胞H.pylori感染模型中，感染12h和24h均可顯著降低細胞存活率并降低細胞線粒體膜電位，即H.pylori作用于MKN45細胞12h即產(chǎn)生明顯的細胞毒性作用；在RAW 264.7細胞H.pylori感染模型中，感染6h、12h和24h均可增加細胞上清液中NO含量和細胞Tnf-α，Inos和Cox-2基因表達，即H.pylori作用于巨噬細胞后可明顯增加其促炎因子的表達，并隨著時間的延長而加強。結(jié)論H.pylori 感染MKN45細胞和RAW 264.7巨噬細胞可作為理想的H.pylori感染細胞模型。

幽門螺桿菌；細胞模型；細胞毒性；促炎因子

幽門螺桿菌（Helicobacter pylori, H.pylori）是世界范圍內(nèi)常見的、具有強傳染性的病原菌之一，全球有超過50%的人群感染此菌[1]，通過對我國大量人群調(diào)查，H.pylori感染率為60%，兒童H.pylori感染率為 54.76%，并且以每年0.5%～1%的速度遞增[2,3]。H.pylori感染可以誘發(fā)包括慢性胃炎、消化性潰瘍在內(nèi)等常見胃部疾病的發(fā)生，其中以損傷胃上皮細胞與激活免疫細胞產(chǎn)生炎癥反應(yīng)和免疫應(yīng)答為主要誘因[4,5]。因此建立H.pylori感染細胞模型對于探討其致病機理、篩選治療藥物與研究藥物作用靶點等具有重要意義。本實驗將H.pylori與不同的細胞株共同孵育，觀察細胞的生存狀態(tài)和感染情況，為建立和優(yōu)化H.pylori感染細胞模型奠定基礎(chǔ)。

材料與方法

1 主要試劑

Brain-Heart Infusion（Oxoid，Lot：1677862）；Campylobacter agar base (Oxoid，Lot：1589242)；革蘭氏染色液試劑盒（海博生物，Lot：HB8278）；細菌基因組DNA提取試劑盒（天根生物，Lot：DP302-2）；RPM I Medium 1640 basic（Gibco，Lot：8115250）；胎牛血清（Gibco，Lot：730840）；Super Real Pre M ix × Plus(SYBR Green)（天根生物，Lot：03120）；FastQuant RT Kit (With gDNase)（天根生物，Lot：03326）；Trizol Reagent（Thermo Life technology，Lot：28218）； 乳酸脫氫酶（LDH）測試盒（南京建成，Lot：20160406）；一氧化氮試劑盒（碧云天，Lot：S0021）；臺盼藍（sigma，Lot：T6146）； Rhodam ine 123（碧云天，Lot：C2007）

2 實驗細胞和細菌

MKN45細胞和RAW 264.7巨噬細胞廣東省中醫(yī)院饋贈；H.pylori（SS1）由澳大利亞莫納什大學(xué)Richard Ferrero教授饋贈。

3 細菌培養(yǎng)與鑒定

3.1 幽門螺桿菌的復(fù)蘇和傳代

將H.pylori（SS1）復(fù)蘇于彎曲桿菌瓊脂培養(yǎng)基為基礎(chǔ)、含7% 脫纖維新鮮羊血及聯(lián)合抗生素( 萬古霉素10mg/L，甲氧芐氨嘧啶5mg/L、頭孢磺啶5mg /L、兩性霉素5mg/L) 的平板上。倒置平板置于37 ℃、5%O2、10%CO2、85%N2的培養(yǎng)箱中復(fù)蘇48～72 h。待細菌長滿平板后，傳代于新的培養(yǎng)基上，再生長48～72 h。

3.2 幽門螺桿菌菌株的鑒定

使用革蘭染色試劑盒染色細菌，于顯微鏡下使用油鏡觀察細菌形態(tài)。油鏡下觀察H. pylori形態(tài)呈紅色彎曲桿狀，無球變（圖1A）。同時，取少量菌液置于快速脲素酶試劑里，1m in后觀察試劑顏色變化（變?yōu)樽霞t色，圖1B）。

圖1 幽門螺桿菌鑒定。A，H.pylori革蘭染色；比例尺，10μm；B，快速尿素酶試驗（空白對照為黃色，紅色為細菌陽性反應(yīng)）Fig. 1 Identif cation of H. pylori. A, Gram staining of H. pylori; scale bar, 10μm; B, rapid urease test; yellow, control group; red, positive reaction

4 細胞培養(yǎng)與傳代

將RAW 264.7和MKN45細胞株從液氮罐取出后置于37 ℃水浴中迅速震搖解凍后， 1000 r/m in、5 m in離心，棄上清，加入含有雙抗（青霉素100U/m l和鏈霉素100U/m l）和10% FBS的1640培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶中，置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h～48h。待細胞鋪滿瓶底后，傳代于新的培養(yǎng)瓶中，在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)24h～48 h。

5 造模方法及檢測

5.1 細胞分組及造模

取對數(shù)生長期的MKN45和RAW 264.7細胞消化后，調(diào)節(jié)細胞濃度至2×106/孔種于6孔板中，分為空白對照組、模型6h組、12h組和24h組，每組3個復(fù)孔。無血清1640培養(yǎng)4h，模型組再加入2×108的H.pylori（MOI=100）共同孵育6h、12h和24h。

5.2 細胞存活率和線粒體膜電位檢測

按說明書配制0.4%臺盼藍染色液，將各組MKN45細胞消化之后與染色液混合，在顯微鏡下分別計數(shù)活細胞和死細胞的數(shù)量，計算細胞活力[細胞活力（%）=活細胞數(shù)量/（活細胞數(shù)量+死細胞數(shù)量）×100%]。取各組MNK45細胞上清液12000r/min離心5min，取上清液按說明書檢測上清LDH；同時向各孔中加入細胞裂解液，冰上裂解10m in后12000r/min離心5m in，取上清液檢測細胞內(nèi)LDH，并計算LDH釋放率[LDH釋放率（%）=細胞上清液中LDH/（細胞內(nèi)LDH+細胞上清液LDH）×100%]。按說明書配制5mmol/L Rhodam ine 123染色液，棄去各組MKN45細胞上清液后，用PBS輕輕清洗3次，加入染色液37℃培養(yǎng)箱孵育20m in，再用PBS輕輕洗滌3次立即在熒光顯微鏡下觀察、攝片。選取3個不同的視野用Image J圖像分析軟件分析熒光強度/細胞；同時消化收集染色液孵育后的細胞，用預(yù)冷的無血清培養(yǎng)液漂洗2次，充分除去細胞外的染料，加入流式細胞儀中檢測細胞熒光強度（激發(fā)波長為507nm，發(fā)射波長為529nm），實驗重復(fù)3 次。

5.3 RAW 264.7細胞炎癥因子檢測

取各組RAW 264.7細胞上清液，按照Griess法檢測NO含量變化，NO含量（%）=模型組NO含量/空白對照組NO含量。棄去各組RAW 264.7細胞上清液后，用PBS輕輕清洗3次，加入Trizol裂解細胞，提取細胞總RNA，檢測D(λ) 260nm/280nm比值合格后，按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒操作方法得到cDNA，再分別檢測tnf-α，inos和cox-2的mRNA表達，實驗重復(fù)3 次。

引物序列：

GAPDH：上 游 引 物5′- AGGTTGTCTCCTGCGACTTCA -3’，下游引物5’- CCAGGAAATGAGCTTGACAAAG -3’；

iNOS：上 游 引 物 5’- GGCAGCCTGTGAGACCTTTG -3’，下游引物5’- CGTTTCGGGATCTGAATGTGA -3’；

COX-2：上游引物5’- CAGGAAGTCTTTGGTCTGGTGCC -3’，下游引物5’- GCTGGTTTGGAATAGTTGCTCATCA -3’；

TNF-α：上游引物5’- GCACCACCATCAAGGACTCA -3’，下游引物5’- TCGAGGCTCCAGTGAATTCG -3’

在Bio-rad熒光定量PCR儀（CFX 96）上進行實時熒光定量PCR（RT-qPCR）擴增（熒光定量檢測試劑盒：Super Real Pre M ix × Plus，天根公司）。擴增條件：95℃預(yù)變性10m in，95℃變性15s，60℃延伸60s，40個循環(huán)。分析結(jié)果，得出各組內(nèi)參基因和目的基因Ct值，運用2-△△Ct公式計算。

6 統(tǒng)計方法

結(jié) 果

1 幽門螺桿菌感染降低MKN45細胞活力和增加LDH釋放率

臺盼藍染色顯示，MKN45細胞感染H.pylori菌12h后，其活細胞比例明顯降低，感染24h后降低更為明顯（圖2A）。LDH檢測顯示，MKN45細胞感染H.pylori菌12 h后，其LDH釋放率較未感染細胞明顯增加，感染24h后增加更加顯著（圖2B）。

圖2 幽門螺桿菌感染對MKN45細胞活力的影響。A，臺盼藍染色檢測細胞活力的統(tǒng)計學(xué)分析；B，LDH檢測細胞活力的統(tǒng)計學(xué)分析；ΔΔ，與未感染細胞比較，P＜0.01；**，與感染12h的細胞比較，P＜0.01；n=9Fig. 2 The ef ect of H. pylori on MKN45 cell viability. A, statistical analysis of cell viability detected by trypan blue staining; B, statistical analysis of cell viability measured by LDH method;ΔΔ, P＜0.01, compared w ith control group;**, P＜0.01, compared w ith 12h model group; n=9

2 幽門螺桿菌感染降低MKN45細胞線粒體膜電位

對感染H.pylori菌的MKN45細胞以Rhodam ine 123染料染色后進行熒光顯微鏡觀察和流式細胞術(shù)分析顯示，與未感染的對照細胞相比，感染12 h后的Rhodam ine 123熒光強度/ 細胞和總熒光強度均顯著下降，24 h后其下降程度更加明顯（圖3），說明感染細胞的線粒體膜電位降低程度隨著時間的延長而加重。

圖3 幽門螺桿菌對MKN45細胞的線粒體膜電位的影響。A，幽門螺桿菌感染MKN45細胞后Rhodam ine123染色的熒光顯微鏡觀察（比例尺，50μm）；B，幽門螺桿菌感染MKN45細胞后Rhodam ine123染色熒光強度/ 細胞的統(tǒng)計學(xué)分析；C，幽門螺桿菌感染MKN45細胞后Rhodamine123染色總熒光強度的流式細胞術(shù)檢測；D，流式細胞術(shù)檢測幽門螺桿菌感染MKN45細胞后Rhodamine123染色總熒光強度的統(tǒng)計學(xué)分析；與未處理組比較：Δ， 0.01＜P＜0.05；ΔΔ，P＜0.01；與感染6h組比較：*，0.01＜P＜0.05；**，P＜0.01；與感染12h組比較：#，0.01＜P＜0.05；##，P＜0.01；n=9Fig. 3 The ef ect of H. pylori infection on the MMP of MKN45 cells. A, representative fuorescent images of H. pylori-infected MKN45 cells stained w ith Rhodam ine123; scale bar, 50μm; B, statistical analysis of the f uorescent intensity per cell of H. pylori-infected MKN45 cells stained w ith Rhodam ine123; C, fow cytometry detection of the total f uorescent intensity of H. pylori-infected MKN45 cells stained w ith Rhodam ine123; D, quantitative analysis of the total fuorescent intensity of H. pylori-infected MKN45 cells stained w ith Rhodamine123 detected by fow cytometry. Compared w ith control group:Δ, 0.01＜P＜0.05;ΔΔ, P＜0.01; compared w ith 6h model group:*, 0.01＜P＜0.05;**, P＜0.01; compared w ith 12h model group:#, 0.01＜P＜0.05;##, P＜0.01; n=9

4 幽門螺桿菌感染上調(diào)RAW 264.7細胞的促炎因子表達

Griess法檢測顯示，幽門螺桿菌感染可時間依賴性上調(diào)RAW 264.7細胞NO含量（圖4A）。定量PCR檢測顯示，幽門螺桿菌感染可顯著上調(diào)RAW 264.7細胞Cox-2，Inos基因表達，并隨著時間增加而逐漸上升（圖4B，圖4C）；幽門螺桿菌感染可顯著上調(diào)Tnf-α基因表達，但未見明顯時間依賴性（圖4D）。

圖4 幽門螺桿菌感染對RAW 264.7細胞促炎因子表達的影響。A，幽門螺桿菌感染RAW 264.7細胞后6h、12h和24h時NO含量；B，幽門螺桿菌感染RAW 264.7細胞后6h、12h和24h時Cox-2表達水平；C，幽門螺桿菌感染RAW 264.7細胞后6h、12h和24h時Inos基因表達水平；D，幽門螺桿菌感染RAW 264.7細胞后6h、12h和24h時Tnf-α表達水平；與未處理組比較：Δ，0.01＜P＜0.05；ΔΔ，P＜0.01；與感染6h組比較：*，0.01＜P＜0.05；**，P＜0.01；與感染12h組比較：#，0.01＜P＜0.05；##，P＜0.01；n=9Fig. 4 The ef ect of H. pylori infection on the expression of proinf ammatory factor in RAW 264.7 cells. A, NO contents in RAW 264.7 cells co-cultured w ith H. pylori for 6h, 12h and 24h, respectively; B, the levels of Cox-2 gene expression in RAW 264.7 cells co-cultured w ith H. pylori for 6h, 12h and 24h, respectively; C, the levels of Inos gene expression in RAW 264.7 cells co-cultured w ith H. pylori for 6h, 12h and 24h, respectively; D, the levels of Tnf-α gene expression in RAW 264.7 cells co-cultured w ith H. pylori for 6h, 12h and 24h, respectively. Compared w ith control group:Δ, 0.01＜P＜0.05;ΔΔ, P＜0.01; compared w ith 6h model group:*, 0.01＜P＜0.05;**, P＜0.01; compared w ith 12h model group:#, 0.01＜P＜0.05;##, P＜0.01; n=9

討 論

H.pylori的長期感染可以導(dǎo)致發(fā)生胃黏膜萎縮和腸化生等相關(guān)慢性胃炎的主要誘因之一[6,7]，這些病變的發(fā)生不僅是由于H.pylori自身可產(chǎn)生毒力因子，例如細胞毒性相關(guān)蛋白A和空泡細胞毒素A等，會使宿主細胞在增殖，細胞骨架重排，細胞連接，形態(tài)延伸與散射等方面的改變，進而損傷胃粘膜上皮細胞，而且由于其具有特殊的逃逸機制使機體免疫系統(tǒng)無法徹底清除[8]，導(dǎo)致過度累積活性氧/活性氮及各類促炎因子造成炎癥的持續(xù)發(fā)生，繼而引發(fā)慢性炎癥反應(yīng)[9,10]。

本實驗探討了兩種感染H.pylori（SS1）的細胞模型，其中感染MKN45細胞模型模擬細菌入侵機體黏附于細胞后產(chǎn)生的毒性作用，感染RAW 264.7巨噬細胞模型模擬了機體固有免疫抵抗細菌的作用。MKN45細胞感染H.pylori 12h即出現(xiàn)明顯的存活率下降，線粒體膜電位下降的現(xiàn)象；24h后產(chǎn)生的細胞毒性更加嚴重。巨噬細胞通常在感染部位聚集并吞噬細菌，分泌TNF-α、COX-2，iNOS等促炎因子介導(dǎo)免疫反應(yīng)，同時生成NO參與清除入侵的細菌[11]。模型感染6h后即可出現(xiàn)NO含量和促炎因子COX-2，iNOS，TNF-α的基因表達均增加，并且隨著時間的延長而增加，表現(xiàn)出更嚴重的炎癥程度。

因此H.pylori 感染MKN45細胞和RAW 264.7巨噬細胞24h后可分別出現(xiàn)顯著的細胞毒性和明顯炎癥表達，可考慮作為理想的H.pylori感染細胞模型。

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Establishment and evaluation of infammation models induced by Helicobacter pylori in culture

Lian Dawei, Ren Wenkang, Fu Lijun, Xu Yifei, Huang Ping, Cao Hongying*
（College of Traditional Chinese Medicine, Guangzhou University of Chinese Medicine，Guangzhou 510405, China）

ObjectiveTo establish and evaluate two infammation models infected w ith Helicobacter pylori (H. pylori) in 2 cell lines to provide a basis method for further studying H. pylori infection and its mechanism.M ethodsH. pylori-infected MKN45 cell models were established by co-culturing MKN45 cells and H. pylori for 6h, 12h and 24h, respectively. The cell viability was measured by trypan blue staining and lactate dehydrogenase (LDH) method; the m itochondrial membrane potential (MMP) was detected by rhodamine123 staining w ith fuorescent m icroscopy and fow cytometry. H. pylori-infected RAW 264.7 cell models were established by the same procedures as above. The content of nitric oxide (NO) in the supernate was measured by Griess method; the expression of Tnf-α, Inos and Cox-2 genes in the cells was detected by RT-qPCR.ResultsIn MKN45 models, 12h and 24h co-culture w ith H. pylori signif cantly reduced cell viability and MMP, suggesting that 12h H. pylory infection could generate remarkable cytotoxic ef ect. In RAW 264.7 models, co-cultured w ith H. Pylori for 6h, 12h and 24h, the NO content in the supernate and the expression of Tnf-α, Inos and Cox-2 all increased, suggesting that H. pylori infection promoted the expression of proinfammatory factors in macrophages and this ef ect strengthened w ith time.ConclusionH. pylori-infected MKN45 cells and RAW 264.7 macrophages are ideal cell models for studying H. pylori infection and its mechanism.

Helicobacter pylori; cell model; cytotoxicity; proinfammatory factor

R573

A

10.16705/ j. cnki. 1004-1850.2017.03.006

2016-12-23

2017-06-02

廣東省科技計劃資助項目（2016A020217019）；廣州市科技計劃資助項目（201607010336）資助；國家自然科學(xué)基金資助項目（81374043）

連大衛(wèi)，男（1988年），漢族，博士在讀

*通訊作者(To whom correspondence should be addressed)：1171629708@qq.com