丁紹卿，楊紹明，李玲玲，楊 杰，曹 嬙，查文玲

(華東交通大學(xué) 材料學(xué)院，江西 南昌 330013)

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基于石墨烯基復(fù)合物和聚天青Ⅰ的HRP傳感器檢測(cè)有機(jī)過(guò)氧化物的研究

丁紹卿，楊紹明*，李玲玲，楊 杰，曹 嬙，查文玲

(華東交通大學(xué) 材料學(xué)院，江西 南昌 330013)

利用電化學(xué)還原氧化石墨烯(GO)的方法將石墨烯(rGO)固定在電極表面上，然后電沉積氫氧化銅和氫氧化鎳復(fù)合物，構(gòu)成石墨烯/金屬氫氧化物復(fù)合納米材料修飾的玻碳電極(GCE)，并通過(guò)電聚合天青Ⅰ將辣根過(guò)氧化酶(HRP)固定在GCE/rGO/Cu(OH)2-Ni(OH)2表面，制得GCE/rGO/Cu(OH)2-Ni(OH)2/HRP-PA。對(duì)石墨烯/金屬氫氧化物復(fù)合納米材料進(jìn)行了SEM和能譜表征。通過(guò)電化學(xué)阻抗法和循環(huán)伏安法對(duì)傳感器的制備過(guò)程和電化學(xué)性能進(jìn)行了研究，并進(jìn)一步分別對(duì)過(guò)氧化氫叔丁基(BHP)及過(guò)氧化氫異丙苯(CHP)進(jìn)行了分析測(cè)定。該傳感器對(duì)BHP和CHP具有良好的檢測(cè)效果，在2.0×10-5～9.2×10-4mol/L范圍內(nèi)響應(yīng)電流與BHP濃度呈良好的線性關(guān)系，檢出限為 9.9×10-6mol/L；在3.0×10-6～1.0×10-4mol/L范圍內(nèi)響應(yīng)電流與CHP濃度呈良好的線性關(guān)系，檢出限為 6.9×10-7mol/L。

石墨烯；金屬氫氧化物；天青Ⅰ；有機(jī)過(guò)氧化物；HRP傳感器

過(guò)氧化物被廣泛用作紡織和造紙工業(yè)中的漂白劑、有機(jī)合成的氧化劑、環(huán)氧化劑、引發(fā)劑等，從而對(duì)環(huán)境造成了很大危害[1]。因此，分析檢測(cè)過(guò)氧化物顯得十分重要。目前，已報(bào)道的過(guò)氧化物檢測(cè)方法有分光光度法、化學(xué)發(fā)光法以及色譜法等。但這些方法或樣品處理過(guò)程繁雜，或檢測(cè)設(shè)備價(jià)格高昂。采用電化學(xué)酶?jìng)鞲衅鲗?duì)過(guò)氧化物進(jìn)行分析檢測(cè)可以克服上述缺點(diǎn)，且電化學(xué)傳感器靈敏度高、選擇性好和抗干擾能力強(qiáng)的特點(diǎn)使其能更好地實(shí)現(xiàn)對(duì)過(guò)氧化物的檢測(cè)?；诶备^(guò)氧化物酶(HRP)的電化學(xué)傳感器在過(guò)氧化氫的檢測(cè)中已得到廣泛的應(yīng)用，但在檢測(cè)有機(jī)過(guò)氧化物方面的報(bào)道較少[2-3]。

石墨烯(rGO)修飾電極能降低過(guò)電位，促進(jìn)電極表面的電子傳遞[4]，而且石墨烯修飾電極具有較高的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性，可對(duì)過(guò)氧化物進(jìn)行測(cè)定。氫氧化鎳(Ni(OH)2)和氫氧化銅(Cu(OH)2)是兩種多功能材料，具有較好的電化學(xué)穩(wěn)定性和電極兼容性，對(duì)有機(jī)物質(zhì)具有強(qiáng)烈的吸附作用，并能促進(jìn)有機(jī)分子的氧化，已廣泛應(yīng)用于氨基酸、葡萄糖和甲醛等的測(cè)定[5-9]。

天青Ⅰ是一種生物染料，單體在導(dǎo)電基質(zhì)上具有良好的電子轉(zhuǎn)移能力。將天青Ⅰ單體在電極表面聚合可得到導(dǎo)電性能好、穩(wěn)定性好的聚天青Ⅰ(PA)電子介體薄膜[10-12]。制備生物傳感器時(shí)，可以聚天青Ⅰ為電子媒介體，通過(guò)電化學(xué)聚合法將HRP固定在電極上，既能提高電極表面的電子傳遞速度，也可以提高酶電極的選擇性和穩(wěn)定性。

本文通過(guò)電化學(xué)還原的方法將rGO固定在電極上，然后通過(guò)電化學(xué)沉積Cu(OH)2-Ni(OH)2復(fù)合物在電極表面構(gòu)建石墨烯/氫氧化銅-氫氧化鎳(rGO/Cu(OH)2-Ni(OH)2)復(fù)合納米材料。rGO/Cu(OH)2-Ni(OH)2復(fù)合納米材料具有較大的比表面積和較強(qiáng)的吸附能力，能提高酶的附著量，也能較好提高電極的催化活性和穩(wěn)定性，有利于HRP和PA電子介體的固定。最后通過(guò)電聚合天青Ⅰ將HRP固定于復(fù)合納米材料修飾的電極表面，構(gòu)建了用于有機(jī)過(guò)氧化物檢測(cè)的生物傳感平臺(tái)，從而實(shí)現(xiàn)了對(duì)有機(jī)過(guò)氧化物的高靈敏、高選擇性以及強(qiáng)抗干擾能力的快速檢測(cè)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

辣根過(guò)氧化物酶(250 U/mg，上海三杰生物技術(shù)有限公司)；過(guò)氧化氫叔丁基(BHP)、過(guò)氧化氫異丙苯(CHP)均購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；硝酸銅(西隴化工股份有限公司)；天青Ⅰ(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；硝酸鎳(天津市大茂化學(xué)試劑廠);CHI660電化學(xué)分析儀(上海辰華儀器公司)；JSM-6701型掃描電鏡(日本電子JEOL公司)。實(shí)驗(yàn)用水為蒸餾水。

1.2 氧化石墨烯(GO)的制備

采用改進(jìn)Hummers法[13]將石墨粉轉(zhuǎn)化為GO。用分析天平稱取2 g石墨粉，在0 ℃冰水浴下加入25 mL濃硫酸并攪拌使其充分混合后，向混合物中緩慢加入6 g五氧化二磷和5 g過(guò)硫酸鉀，混勻并充分?jǐn)嚢? min。在80 ℃條件下水浴并持續(xù)攪拌3 h。反應(yīng)結(jié)束后，加200 mL水進(jìn)行稀釋，抽濾，置于60 ℃下干燥得到預(yù)氧化石墨粉。

取1 g預(yù)氧化后的產(chǎn)物，在0 ℃冰水浴條件下，加入50 mL濃硫酸中充分?jǐn)嚢柚辆鶆?。然后? ℃冰水浴條件下，邊攪拌邊緩慢加入1.2 g硝酸鉀和6 g高錳酸鉀，混勻后在35 ℃下持續(xù)攪拌2 h。再將混合物緩慢加入92 mL冰水中，邊加邊攪拌，于0 ℃冰水浴15 min。在35 ℃下恒溫水浴攪拌2 h后，再將混合物加入裝有280 mL水的大燒杯中冷卻，之后，緩慢向溶液中加入30%的過(guò)氧化氫并不斷攪拌至溶液變成亮黃色，靜置，除去上層清液。用200 mL 10%的HCl洗滌3～4次，再用水離心洗滌3～4次后，在60 ℃條件下烘干得GO。

1.3 生物傳感器的制備

按照文獻(xiàn)對(duì)玻碳電極(GCE)進(jìn)行預(yù)處理[14]，將預(yù)處理過(guò)的GCE置于事先超聲分散好的1 mg/mL的GO溶液中，在-1.5～0.6 V電位區(qū)間以50 mV/s 循環(huán)掃描10圈，得到石墨烯修飾電極(GCE/rGO)。再將GCE/rGO置于含0.75 mmol/L Ni(NO3)2和0.25 mmol/L CuSO4的0.05 mol/L的NaNO3溶液中，以100 mV/s掃速于-1.2～1.2 V范圍內(nèi)循環(huán)掃描10圈在GCE/rGO上固定銅、鎳的氧化物薄膜。之后將電極置于0.1 mol/L 的NaOH 溶液中，在-0.2～0.8 V 范圍內(nèi)以320 mV/s 的掃速掃描至穩(wěn)定，重復(fù)上述過(guò)程1次后，用水漂洗制得石墨烯/氫氧化銅-氫氧化鎳復(fù)合納米材料修飾電極(GCE/rGO/Cu(OH)2-Ni(OH)2)[15]。將制備好的GCE/rGO/Cu(OH)2-Ni(OH)2電極置于含0.2 mmol/L天青Ⅰ和5 g/L HRP的pH 7.0的PBS溶液中，于-1.0～1.8 V電位范圍內(nèi)以100 mV/s循環(huán)伏安掃描3圈，再在-0.6～0.5 V 之間以50 mV/s循環(huán)掃描15圈[16]，得到GCE/rGO/Cu(OH)2-Ni(OH)2/HRP-PA修飾電極。

1.4 電化學(xué)檢測(cè)方法

電化學(xué)測(cè)試采用三電極體系：工作電極為玻碳電極(Φ=3 mm)或修飾電極，對(duì)電極為鉑電極，參比電極為Ag/AgCl(飽和KCl)電極。在含0.1 mol/L KCl的5 mmol/L K3[Fe(CN)6]/K4[Fe(CN)6](1∶1，體積比)的PBS溶液中進(jìn)行交流阻抗掃描，對(duì)電極的修飾過(guò)程進(jìn)行監(jiān)控和表征；在優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件下，于BHP和CHP的PBS緩沖溶液(0.2 mol/L，pH 7.0)中，進(jìn)行循環(huán)伏安和計(jì)時(shí)電流測(cè)試，分別記錄傳感器對(duì)BHP和CHP的電流響應(yīng)。

圖1 GCE/rGO(A)、GCE/rGO/Cu(OH)2-Ni(OH)2(B)的SEM圖以及GCE/rGO/Cu(OH)2-Ni(OH)2的能譜圖(C)Fig.1 SEM images of GCE/rGO(A) and GCE/rGO/Cu (OH)2-Ni(OH)2(B)，and EDS spectrum of GCE/rGO/Cu(OH)2-Ni(OH)2(C)

2 結(jié)果與討論

2.1 GCE/rGO及GCE/rGO/Cu(OH)2-Ni(OH)2的SEM與能譜表征

采用SEM對(duì)GCE/rGO(圖1A)和GCE/rGO/Cu(OH)2-Ni(OH)2(圖1B)進(jìn)行表征。從圖1A可以看出，通過(guò)電化學(xué)還原GO可將石墨烯固定在電極表面，石墨烯以褶皺狀的形態(tài)分布在GCE表面。而在GCE/rGO上電沉積氫氧化銅-氫氧化鎳復(fù)合納米材料后得到GCE/rGO/Cu(OH)2-Ni(OH)2的SEM圖(圖1B)中，可觀察到氫氧化銅、氫氧化鎳顆粒均勻地分布在石墨烯表面，并在電極表面形成多孔隙結(jié)構(gòu)。為了進(jìn)一步確認(rèn)銅、鎳復(fù)合納米材料在電極表面的固定情況，對(duì)GCE/rGO/Cu(OH)2-Ni(OH)2的能譜進(jìn)行了分析(圖1C)，從圖中可以看到，能譜中有碳、氧、鎳、銅元素的峰，說(shuō)明石墨烯/氫氧化銅-氫氧化鎳復(fù)合物已成功地修飾在電極表面上。

2.2 GCE/rGO/Cu(OH)2-Ni(OH)2/HRP-PA的電化學(xué)阻抗表征

在含0.1 mol/L KCl的5 mmol/L K3[Fe(CN)6]/K4[Fe(CN)6]的PBS溶液中，不同修飾電極的電化學(xué)阻抗圖譜見(jiàn)圖2。從圖2可以看出，GCE/rGO(曲線b)的阻抗明顯小于GCE(曲線a)，主要是由于石墨烯固定在電極表面后促進(jìn)了溶液中[Fe(CN)6]3-/[Fe(CN)6]4-與電極表面的電子傳遞。在GCE/rGO表面沉積氫氧化物復(fù)合納米材料后(曲線c)，電子傳遞阻抗(Rct)增大，主要是由于金屬氫氧化物的導(dǎo)電性比石墨烯差，使其阻抗略有增大。將GCE/rGO/Cu(OH)2-Ni(OH)2在含HRP的天青Ⅰ溶液中電聚合得到GCE/rGO/Cu(OH)2-Ni(OH)2/HRP-PA(曲線d)，該電極的阻抗明顯增大，說(shuō)明在聚合過(guò)程中有大分子HRP固定在電極表面。

2.3 GCE/rGO/Cu(OH)2-Ni(OH)2/HRP-PA的催化性能

修飾電極GCE/rGO/Cu(OH)2-Ni(OH)2/HRP-PA對(duì)過(guò)氧化氫叔丁基催化性能的循環(huán)伏安曲線如圖3所示。在pH 7.0 PBS中加入400 μmol/L的CHP后，氧化峰電流減小，還原峰電流增加，說(shuō)明該修飾電極對(duì)CHP有良好的催化還原作用，可用于過(guò)氧化物的檢測(cè)。

圖2 不同修飾電極在5 mmol/L K3[Fe(CN)6]/K4[Fe(CN)6](含0.1 mol/L KCl)PBS溶液中的交流阻抗圖譜Fig.2 EIS responses of different modified electrodes in 5 mmol/L K3[Fe(CN)6]/K4[Fe(CN)6](containing 0.1 mol/L KCl) PBS solution a：GCE;b：GCE/rGO;c：GCE/rGO/Cu(OH)2-Ni(OH)2;d：GCE/rGO/Cu(OH)2-Ni(OH)2/HRP-PA

圖3 GCE/rGO/Cu(OH)2-Ni(OH)2/HRP-PA在PBS溶液中的CV圖Fig.3 Cyclic voltammograms of GCE/rGO/Cu(OH)2-Ni(OH)2/HRP-PA a:pH 7.0 PBS，b：PBS+400 μmol/L BHP;scan rate:100 mV/s

圖4 不同pH值的PBS溶液對(duì)修飾電極檢測(cè)效果的影響Fig.4 Effects of different pH values of PBS solution on detection of modified electrode

2.4 pH值對(duì)GCE/rGO/Cu(OH)2-Ni(OH)2/HRP-PA檢測(cè)效果的影響

考察了GCE/rGO/Cu(OH)2-Ni(OH)2/HRP-PA在不同pH值的PBS溶液中對(duì)BHP的檢測(cè)效果。將修飾電極置于pH 6.0～8.0的PBS溶液中，檢測(cè)其對(duì)60 μmol/L BHP的電流響應(yīng)。如圖4所示，響應(yīng)電流隨著pH值的增大先增大后減小，當(dāng)pH值為7.0時(shí)，修飾電極對(duì)BHP的電流響應(yīng)最大，說(shuō)明此時(shí)HRP的活性最大，檢測(cè)效果最好，因此實(shí)驗(yàn)選擇pH 7.0的PBS溶液作為檢測(cè)底液。

2.5 電位對(duì)GCE/rGO/Cu(OH)2-Ni(OH)2/HRP-PA檢測(cè)效果的影響

在不同工作電位下，采用計(jì)時(shí)電流法考察了傳感器在pH 7.0的PBS溶液中對(duì)60 μmol/L BHP的電流響應(yīng)。結(jié)果顯示，在-0.05～-0.3 V電位范圍內(nèi)，響應(yīng)電流值隨著工作電位的增大而不斷增大，這是因?yàn)楣ぷ麟娢辉截?fù)，過(guò)氧化氫越易被還原，加快了電子在電極表面與固定在PA電子介體薄層中的HRP活性中心之間的傳遞。但隨著電位負(fù)移達(dá)到一定程度，響應(yīng)電流開(kāi)始變化緩慢，且電極也不穩(wěn)定。在-0.25 V工作電位下修飾電極對(duì)BHP有較好的檢測(cè)效果，且電極比較穩(wěn)定。綜合考慮，選擇-0.25 V作為最佳工作電位。

2.6 不同修飾電極對(duì)有機(jī)過(guò)氧化物的檢測(cè)效果

采用計(jì)時(shí)電流法研究了不同修飾電極在pH 7.0的PBS中對(duì)60 μmol/L BHP的電流響應(yīng)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在-0.25 V電位條件下，不同修飾電極的電流響應(yīng)大小順序?yàn)椋篏CE

2.7 GCE/rGO/Cu(OH)2-Ni(OH)2/HRP-PA對(duì)過(guò)氧化物的檢測(cè)分析

在優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件下，利用GCE/rGO/Cu(OH)2-Ni(OH)2/HRP-PA分別對(duì)BHP及CHP進(jìn)行測(cè)定。在-0.25 V電位下，于pH 7.0 PBS溶液中分別連續(xù)滴加一定濃度的BHP及CHP。I～t曲線結(jié)果表明，響應(yīng)電流值與BHP濃度在2.0×10-5～9.2×10-4mol/L范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，線性方程為I(A)=1.04×10-6+ 0.000 48c(mol/L)(r=0.999)；靈敏度為0.000 48 A·mol/L，檢出限(S/N=3)為9.9×10-6mol/L。響應(yīng)電流值與CHP濃度在3.0×10-6～1.0×10-4mol/L范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，線性方程為I(A)= 1.11×10-6+0.009 1c(mol/L)(r=0.999)；靈敏度為0.009 1 A·mol/L，檢出限為6.9×10-7mol/L。

2.8 GCE/rGO/Cu(OH)2-Ni(OH)2/HRP-PA修飾電極的重現(xiàn)性與穩(wěn)定性

在相同實(shí)驗(yàn)條件下，采用同一支玻碳電極5次制備GCE/rGO/Cu(OH)2-Ni(OH)2/HRP-PA修飾電極，測(cè)得其對(duì)60 μmol/L BHP的響應(yīng)電流的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為6.5%。采用同一支修飾電極5次測(cè)量同一濃度的BHP，響應(yīng)電流的RSD為4.2%。表明該修飾電極具有較好的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性。

2.9 干擾實(shí)驗(yàn)與實(shí)際樣品分析

采用抗壞血酸(AA)、葡萄糖(Glu)、尿素(UA)、甘氨酸(Gly)、L-酪氨酸(L-Try)研究了GCE/rGO/Cu(OH)2-Ni(OH)2/HRP-PA的抗干擾性能。在pH 7.0 的PBS中先加入40 μmol/L 的BHP，再依次加入5倍BHP濃度的葡萄糖、尿素、甘氨酸和L-酪氨酸，觀察該修飾電極對(duì)加入物質(zhì)的電流響應(yīng)。結(jié)果表明，在實(shí)驗(yàn)條件下，Glu，UA，Gly和L-Try對(duì)過(guò)氧化物檢測(cè)的影響可以忽略。另外，BHP和CHP共存時(shí)的相互允許量為：檢測(cè)40 μmol/L BHP時(shí)，CHP的量不超過(guò)0.65 μmol/L；檢測(cè)40 μmol/L CHP時(shí)，BHP的量不超過(guò)33.4 μmol/L。

為了研究該傳感器的實(shí)用性，以孔目湖水為樣品，對(duì)其進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)。經(jīng)該傳感器檢測(cè)，孔目湖水樣中未檢出過(guò)氧化物，3個(gè)加標(biāo)水平(50.0，60.0，90.0 μmol/L)下的回收率分別為100.2%，99.7%和98.7%；RSD(n=3)分別為3.5%，4.3%和1.2%。

3 結(jié) 論

本文利用電化學(xué)還原GO的方法將石墨烯固定在電極表面上，再沉積氫氧化銅和氫氧化鎳復(fù)合物，構(gòu)建石墨烯/金屬氫氧化物復(fù)合納米材料修飾的玻碳電極，通過(guò)電聚合天青Ⅰ將HRP固定在GCE/rGO/Cu(OH)2-Ni(OH)2表面制得GCE/rGO/Cu(OH)2-Ni(OH)2/HRP-PA。通過(guò)電化學(xué)阻抗法和循環(huán)伏安法對(duì)傳感器的制備過(guò)程和電化學(xué)性能進(jìn)行了研究，并采用該傳感器對(duì)過(guò)氧化物的檢測(cè)條件進(jìn)行了優(yōu)化。在優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件下，該傳感器對(duì)BHP和CHP具有良好的檢測(cè)效果，對(duì)BHP和CHP的線性范圍分別為2.0×10-5～9.2×10-4mol/L和3.0×10-6～1.0×10-4mol/L。該傳感器具有良好的穩(wěn)定性和抗干擾性能。

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Study on Determination of Organic Peroxides with HRP Sensor Based on Graphene Nanocomposites and Poly Azure Ⅰ

DING Shao-qing,YANG Shao-ming*,LI Ling-ling,YANG Jie,CAO Qiang,ZHA Wen-ling

(School of Materials Science and Engineering,East China Jiaotong University,Nanchang 330013,China)

In this paper,graphene(rGO) was immobilized on the surface of the electrode by the method of electrochemical reduction of graphene oxide(GO),and then the copper hydroxide-nickel hydroxide nanocomposites were electrodeposited to form graphene/metal hydroxide nanocomposites modified glassy carbon electrode(GCE/rGO/Cu(OH)2-Ni(OH)2).Finally,horseradish peroxidase(HRP) was immobilized onto the surface of the above prepared electrode by electropolymerizing azure I to form the GCE/rGO/Cu(OH)2-Ni(OH)2/HRP-PA(PA:poly azure Ⅰ).The graphene/metal hydroxide nanocomposites were characterized by SEM and EDS.The preparation process and electrochemical performance of the sensor were investigated by electrochemical impedance spectroscopy and cyclic voltammetry.Hydrogen peroxide tert-butyl(BHP) and cumene hydroperoxide(CHP) were determined by the sensor.The linear response of the HRP sensor to BHP was in the concentration range of 2.0×10-5-9.2×10-4mol/L with a detective limit of 9.9×10-6mol/L and that to CHP was in the concentration range of 3.0×10-6-1.0×10-4mol/L with a detective limit of 6.9×10-7mol/L.

graphene;metal hydroxides;azure I;organic peroxide;HRP sensor

2017-01-17；

2017-03-01

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(21465012)；江西省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(20171BAB203017)；江西省教育廳科技項(xiàng)目(GJJ150544)；華東交通大學(xué)校立項(xiàng)目(15LX03)

10.3969/j.issn.1004-4957.2017.07.004

O657.1;O611.62

A

1004-4957(2017)07-0865-05

*通訊作者：楊紹明，博士，教授，研究方向：電分析化學(xué)及生物傳感器，Tel：0791-87046336，E-mail：yangsm79@163.com