張 琪，高 潮,梁煥如，侯 鵬

(齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院,黑龍江 齊齊哈爾 161006)

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一種檢測水合肼熒光探針的合成與應(yīng)用

張 琪，高 潮,梁煥如，侯 鵬*

(齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院,黑龍江 齊齊哈爾 161006)

基于香豆素類染料,設(shè)計合成了一種具有較高選擇性和靈敏度,可在生理條件(pH 7.4)下檢測水合肼的熒光探針,同時利用核磁共振和高分辨質(zhì)譜對探針的分子結(jié)構(gòu)進行了表征?；谒想逻M攻探針分子結(jié)構(gòu)中的4-丁酸酯,生成酚氧負離子,同時發(fā)生分子內(nèi)環(huán)化反應(yīng)后生成具有強烈熒光的亞胺香豆素,實現(xiàn)了探針分子對水合肼的檢測。光譜學(xué)研究表明,當(dāng)向探針溶液加入水合肼(0～100 μmol/L)后,探針溶液在綠色光譜區(qū)域(502 nm)呈現(xiàn)一個顯著的熒光增強響應(yīng)(增強至55倍)。并且,探針可以檢測相對較低濃度的水合肼,檢出限為1.7×10-7mol/L。此外,相對于其他陰離子和親核試劑,探針對水合肼的識別顯示出較高的選擇性和靈敏度。探針成功實現(xiàn)了細胞內(nèi)水合肼的熒光成像,證明其在細胞成像中具有潛在的應(yīng)用能力。

熒光成像；合成；香豆素；熒光探針；水合肼

肼(NH2NH2)是無色易燃液體,具有較強的毒性且不穩(wěn)定。臨床研究表明,暴露的肼會對人類的肝臟、腎臟和中樞神經(jīng)系統(tǒng)造成嚴重損傷[1]。為此,美國環(huán)境保護局(EPA)已將肼歸類為可能的人類致癌物,其暴露的閾限值為10 ppb[2]。肼作為一種重要的精細化工原料,被廣泛用于化學(xué)、制藥、農(nóng)業(yè)和航空航天工業(yè)等領(lǐng)域。據(jù)報道,一些固氮菌能夠產(chǎn)生作為副產(chǎn)物的肼[3]。因此,開發(fā)用于快速、簡單、靈敏和選擇性檢測肼的方法在環(huán)境和生物科學(xué)中非常重要。目前,檢測肼的分析方法有分光光度法、色譜法和電化學(xué)方法等[4-6]。然而,這些方法需繁瑣的樣品和試劑制備過程,或需復(fù)雜儀器,因此不適于現(xiàn)場分析。相對于其它方法,熒光分析法操作簡便、靈敏度高,適用于細胞內(nèi)檢測,已成為目前研究生物體內(nèi)水合肼的理想方法[7-8]。

目前,關(guān)于水合肼探針的報道主要基于以下幾種反應(yīng)機理：水合肼將乙酰丙酸基團脫保護,水合肼對丙二腈基團的取代反應(yīng),水合肼將鄰苯二甲酰亞胺脫保護以及水合肼將4-位的丁酰酯脫保護等。這些反應(yīng)機理大大促進了肼的熒光探針的開發(fā)[9-15]。其中,水合肼將4-位的丁酰酯脫保護,由于合成簡便而被廣泛采用。但是,基于該機理的絕大多數(shù)探針需使用高含量的有機溶劑,有的甚至超過90%,這極大地限制了其在實際檢測中的靈敏度和選擇性,并且不適于細胞內(nèi)成像。因此,開發(fā)具有高靈敏度、高選擇性以及能用于細胞成像的水合肼探針具有重要意義。

香豆素類染料又名1,2-苯并吡喃酮,是一類具有芳香氣味的熒光染料。由于香豆素類熒光染料分子具有高度的剛性和優(yōu)良的光物理化學(xué)性能(較大的Stokes位移、較高的熒光量子產(chǎn)率以及發(fā)射光譜位移藍綠色區(qū)域),被廣泛應(yīng)用于非線性光學(xué)材料、增白劑和熒光分析領(lǐng)域[16]。本文合成了以香豆素染料為信號表達基團,4-丁酰酯部分作為潛在反應(yīng)位點的選擇性水合肼熒光探針,并將其用于細胞內(nèi)水合肼的熒光成像檢測。在緩沖溶液中,由于探針分子1結(jié)構(gòu)的自由度較大,能量會通過非輻射方式消耗,因此探針分子1幾乎不產(chǎn)生熒光。當(dāng)加入水合肼后,水合肼進攻探針分子中的4-丁酰酯,生成酚氧負離子,同時發(fā)生分子內(nèi)環(huán)化反應(yīng),生成具有強烈綠色熒光的亞胺香豆素2(圖1)。本文利用水合肼和探針1反應(yīng)前后熒光強度的變化,建立了一種熒光增強識別水合肼的分析方法。

圖1 探針1的合成及水合肼可能的識別機理Fig.1 Synthesis of probe 1 for hydrazine and possible hydrazine-selective signaling mechanism

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

4-溴丁酸(TCI化學(xué)試劑有限公司),7-二烷基水楊醛(安耐吉化學(xué)試劑有限公司),丙二腈(瑪雅化學(xué)試劑),石油醚、乙酸乙酯(天津市東麗區(qū)天大化學(xué)試劑廠),二氯甲烷(天津市凱通化學(xué)試劑有限公司),測試所用離子均購于上海國藥試劑有限公司。

Bruker ultraflexⅡ基質(zhì)輔助時間飛行質(zhì)譜、Bruker AV400 光譜儀(美國Bruker公司),F4600-熒光分光光度計(日本日立公司),熒光倒置顯微鏡(日本Nikon Eclipse TE300)。

1.2 探針1的合成與表征

氬氣保護下,將7-二乙胺基水楊醛(97 mg,0.5 mmol)、4-溴丁酸(125 mg,0.75 mmol)、DMAP(4-二甲氨基吡啶，37 mg,0.3 mmol)和 DCC(二環(huán)己基碳二亞胺，155 mg,0.75 mmol)溶于30 mL無水二氯甲烷中,將反應(yīng)液加熱至回流,反應(yīng)4 h。反應(yīng)完成后,旋去溶劑直接用于下一步反應(yīng)。將上一步所得化合物溶于8 mL二氯甲烷中,加入丙二腈28.3 mg和三乙胺15 mg,室溫攪拌5 h。反應(yīng)結(jié)束后,將反應(yīng)液倒入水中,二氯甲烷萃取,無水硫酸鈉干燥,柱層析分離(石油醚-二氯甲烷=3∶1)得到產(chǎn)品(收率 56%),即為探針分子1。1H NMR(400 MHz，DMSO)δ8.17(d，J=9.3 Hz，1H)，7.98(s，1H)，6.85(d，J=9.3 Hz，1H)，6.62(d，J=1.7 Hz，1H)，3.65(t，J=6.5 Hz，2H)，3.48 (q，J=6.8 Hz，4H)，2.88(t，J=7.3 Hz，2H)，2.27-2.04(m，2H)，1.13(t，J=6.9 Hz，6H)；HRMS(EI)m/zcalcd for[C18H20BrN3O2+H]+：390.080 9，F(xiàn)ound:390.081 6。

1.3 光譜測試

稱取適量的探針分子1經(jīng)無水乙腈溶解,于容量瓶定容,配成1.0×10-3mol/L 的探針母液,低溫保存?zhèn)溆?。稱取適量待測離子鹽和中性小分子(NaCl，KCl，CaCl2，MgCl2，ZnCl2，AlCl3，NaF，NaI，NaBr，NaAcO，Cys，GSH,尿素，苯胺，羥胺,乙二胺和乙酰肼)溶于蒸餾水中,配成1.0×10-3mol/L的溶液,低溫保存?zhèn)溆?。測試體系的配制：用移液槍量取0.003 mL 上述探針的母液、1.8 mL PBS緩沖液(20.0 mmol/L，pH 7.4)、0.897 mL無水乙腈和 0.3 mL 各檢測物質(zhì)于比色皿中,充分混合均勻后,在室溫下測試。

1.4 細胞培養(yǎng)與成像

將人乳腺癌231細胞接種于十二孔板中,加入含10% 胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中,置于培養(yǎng)箱中在37 ℃,5% CO2的條件下培養(yǎng)24 h。待細胞貼壁后,換液,用PBS緩沖液洗滌3次,然后加入探針溶液(5 μmol/L)繼續(xù)培養(yǎng) 30 min。成像前再用PBS緩沖液洗滌3次,用熒光倒置顯微鏡成像。

圖2 探針1與不同濃度N2H4反應(yīng)的熒光響應(yīng)及探針1和N2H4反應(yīng)的熒光強度與濃度的線性關(guān)系Fig.2 Fluorescence spectra of probe 1(10 μmol/L) reacted with different concentrations of N2H4concentration of N2H4 (from bottom to top)：0-100 μmol/L；inset：linear relationship of fluorescence intensity of probe 1 with gradual addition of N2H4

2 結(jié)果與討論

2.1 熒光光譜研究

在含有30%乙腈探針1的PBS緩沖溶液(pH 7.4)中加入水合肼,水合肼可以誘導(dǎo)丁酰酯基脫去保護,同時發(fā)生環(huán)化反應(yīng),從而釋放出染料2使其熒光增強。如圖2所示,隨著加入水合肼濃度的增大,探針在502 nm處的熒光發(fā)射峰不斷增強,最高可增強為探針本底熒光的55倍。同時,在紫外燈的照射下,加入100 μmol/L水合肼的探針溶液會呈現(xiàn)出強烈的綠色熒光。值得注意的是,探針1對水合肼的響應(yīng)非常靈敏,即使向探針1溶液中加入1 μmol/L水合肼溶液也會引起探針溶液超過2倍的熒光增強。此外,當(dāng)加入水合肼的濃度為1,2,3,4,5,6,7 μmol/L時,水合肼的濃度x和探針1在502 nm處的熒光強度y之間存在著很好的線性關(guān)系(y=16.316+10.347x),相關(guān)系數(shù)為0.995 2(圖2插圖),檢出限(S/N=3)為1.7×10-7mol/L。美國環(huán)境保護局(EPA)將肼的暴露閾限值設(shè)定為10 ppb,因此,探針1的靈敏度符合實際應(yīng)用中水合肼檢測的定量要求。

圖3 探針1(▲)及探針1與N2H4(▼)反應(yīng)的熒光強度隨時間變化情況Fig.3 Time-depent fluorescence intensity of probe 1(▲) and probe 1 with N2H4(▼)

2.2 選擇性與干擾實驗

性能優(yōu)良的熒光探針應(yīng)具有良好的選擇性和抗干擾能力。為了評價探針1的選擇性能,本文測試了探針1對常見陰、陽離子和生物小分子的熒光響應(yīng)情況。結(jié)果顯示,在探針溶液中加入常見的陰、陽離子和生物小分子(如Na+，K+，Ca2+，Mg2+，Zn2+，Al3+，F(xiàn)-，Cl-，I-，Br-，AcO-，Cys，GSH)后,熒光光譜未呈現(xiàn)明顯的熒光響應(yīng)信號(F/F0=0.96～1.08)。同時,向探針分子1的溶液中加入高濃度的親核試劑(尿素，苯胺，羥胺,乙二胺和乙酰肼(100.0 μmol/L),光譜數(shù)據(jù)顯示,加入的親核試劑未引起探針溶液的熒光發(fā)生顯著增強(F/F0=0.97～1.04)。由此證明,探針1對水合肼具有很好的選擇性。為進一步評估探針1對水合肼的高度選擇性,在Na+，K+，Ca2+，Mg2+，Zn2+，Al3+，F(xiàn)-，Cl-，I-，Br-，AcO-，Cys，GSH存在的條件下進行干擾性試驗。結(jié)果表明,其他測試物均不影響探針1對水合肼的檢測(F1+N2H4+other analyte/F1+N2H4=0.94～1.07)。以上研究表明,探針1在生理pH值下對水合肼顯示了極高的選擇性,并能夠有效抵抗其他陰離子和親核試劑的干擾。

2.3 反應(yīng)時間

本文對探針1與水合肼的反應(yīng)動力學(xué)進行了研究。如圖3所示,在整個測試時間內(nèi),單獨的探針1溶液在502 nm處的熒光強度無明顯變化(F=13.62～14.83),說明探針1在測試體系中具有很好的穩(wěn)定性。然而,加入100 μmol/L水合肼之后，探針1溶液在502 nm處的熒光強度發(fā)生顯著變化,隨著反應(yīng)時間的延長,熒光強度不斷增大,反應(yīng)進行到20 min時,熒光強度基本恒定。以上研究表明,探針1具有較好的穩(wěn)定性并且可以快速識別測試體系中的水合肼。

圖4 細胞成像實驗Fig.4 Experiment of cell imagingA.bright field image of 231cells pretreated with N2H4，followed by incubation with probe 1(231細胞預(yù)先加入N2H4培養(yǎng)后,再加入探針1培養(yǎng)的明場成像)；B.fluorescence image of 231cells pretreated with N2H4，followed by incubation with probe 1(231細胞預(yù)先加入N2H4培養(yǎng)后,再加入探針1培養(yǎng)的熒光成像)；C.bright field image of 231cells incubated with probe 1(231細胞加入探針1的明場成像)；D.fluorescence image of 231cells incubated with probe 1(31細胞加入探針1的熒光成像)

2.4 熒光成像

肼作為一種神經(jīng)毒素,容易通過皮膚接觸或呼吸吸入,從而損害人體的臟器及中樞神經(jīng)系統(tǒng)。為了實現(xiàn)探針對細胞內(nèi)水合肼的檢測,選取人乳腺癌231細胞進行熒光成像實驗。將細胞預(yù)先加入50 μmol/L 水合肼培養(yǎng)30 min后,再加入5 μmol/L探針1培養(yǎng)30 min,置于熒光倒置顯微鏡下,首先在明場下,照射細胞,細胞形態(tài)良好(圖4A),再調(diào)至熒光場下,此時細胞呈現(xiàn)非常強烈的綠色熒光(圖4B)。將探針1直接加入到載有細胞的培養(yǎng)皿內(nèi)作為對照試驗,培養(yǎng)30 min后,置于明場下,觀察細胞狀態(tài)良好(圖4C),再置于熒光場下成像,觀察到細胞僅呈現(xiàn)出較微弱的綠色熒光(圖4D)。以上實驗證明探針1不僅具有較好的細胞穿透能力,而且能夠?qū)崿F(xiàn)對細胞內(nèi)的水合肼進行熒光成像。

3 結(jié) 論

本文利用4-丁酸酯作為識別基團成功地開發(fā)了一種具有較好光穩(wěn)定性,發(fā)射波長處于綠光區(qū)域的新型水合肼熒光探針。該探針對水合肼的響應(yīng)非常靈敏,其檢出限低至1.7×10-7mol/L,同時具有較高的選擇性,能夠高選擇性地對水合肼進行響應(yīng)而不受陰、陽離子和親核試劑的干擾。此外,該探針還具有很好的細胞穿透能力,能夠?qū)毎麅?nèi)的水合肼進行熒光成像,通過細胞內(nèi)的原位熒光成像,為監(jiān)測環(huán)境及體內(nèi)水合肼的存在和含量提供了便捷的檢測手段。

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Synthesis and Application of a Fluorescent Probe for Hydrazine Determination

ZHANG Qi,GAO Chao,LIANG Huan-ru,HOU Peng*

(College of Pharmacy,Qiqihar Medical University,Qiqihar 161006，China)

A fluorescent probe with high selectivity and sensitivity was synthesized for hydrazine determination in physioligical condition(pH 7.4) based on coumarin dyes.Structure of the probe was characterized by nuclear magnetic resonnce and high resolution mass spectrometry.A strong fluorescence imine coumarin was generated by using hydrazine attacking 4-butyrate to release phenolic oxygen anion and produce molecular inner reaction.With the addition of hydrazine(0-100 μmol/L)，the fluorescence intensity of the probe displayed a remarked enhancement(55 fold) in green spectral region(502 nm).The probe could be used to detect low concentration of hydrazine，with a detection limit of 1.7×10-7mol/L.Compared with the other anions and nuclear reagents，this probe showed higher selectivity and sensitivity to recognize hydrazine.More importantly，the probe was successfully implemented to detect hydrazine in living cells，which proved that the hydrazine fluorescent probe has a potential capability in cell imaging.

fluorescence imaging；synthesis；coumarin；fluorescence probe；hydrazine

2017-02-24；

2017-03-29

黑龍江省大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃項目(201611230068)

10.3969/j.issn.1004-4957.2017.07.019

O657.3；O623.752

A

1004-4957(2017)07-0937-04

*通訊作者：侯 鵬,博士,研究方向：有機小分子熒光探針的光學(xué)性能研究,Tel：0452-2663152,E-mail：houpeng1982@163.com