楊 軍,孫小杰,胡文彥,王玉梅

(南京市食品藥品監(jiān)督檢驗院,江蘇 南京 210038)

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基于QuEChERS提取的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定小麥粉中5種鐮刀菌毒素

楊 軍,孫小杰*,胡文彥,王玉梅

(南京市食品藥品監(jiān)督檢驗院,江蘇 南京 210038)

建立了小麥粉中恩鐮孢菌素A、恩鐮孢菌素A1、恩鐮孢菌素B、恩鐮孢菌素B1、白僵菌毒素5種鐮刀菌毒素的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(HPLC-MS/MS)分析方法。小麥粉樣品采用改良的QuEChERS方法進行提取，無需進一步凈化，以甲醇-2 mmol/L乙酸銨為流動相梯度洗脫，經(jīng)Agilent Eclipse Plus C18色譜柱(2.1 mm×50 mm，1.8 μm)分離，在電噴霧電離(ESI)正離子模式下采用多反應監(jiān)測(MRM)進行測定，基質(zhì)外標法定量。在較寬的線性范圍內(nèi)，5種鐮刀菌毒素的相關(guān)系數(shù)(r2)均不小于0.993，方法檢出限為0.3～0.8 μg/kg，定量下限為0.8～2.4 μg/kg。樣品在1倍、2倍、10倍定量下限3個加標濃度下的平均回收率為74.0%～85.4%，相對標準偏差(RSDs)為5.6%～13.1%。采用建立的方法對市售的30批次小麥粉中5種鐮刀菌毒素進行篩查，數(shù)批產(chǎn)品檢出不同含量的鐮刀菌毒素。該方法簡單快速、準確、靈敏，可用于小麥粉中多種鐮刀菌毒素的同時分析。

超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC-MS/MS)；鐮刀菌毒素；QuEChERS；小麥粉

真菌毒素是一類由絲狀真菌的次生代謝產(chǎn)物構(gòu)成的毒性物質(zhì)，由于其對人體的毒害性且近年來在食品和植物種子中頻繁檢出而引起了世界的廣泛關(guān)注。在農(nóng)作物生長過程及后續(xù)儲藏運輸過程中，鐮刀菌、麥角菌、曲霉菌、青霉菌及鏈格孢菌均可能產(chǎn)生霉菌毒素，而其中鐮刀菌產(chǎn)生的毒素最為流行，在美洲、歐洲及亞洲農(nóng)產(chǎn)品中均普遍存在[1-4]。

鐮刀菌類至少包含100 種以上的植物病菌，所產(chǎn)生的毒素多數(shù)化學性質(zhì)穩(wěn)定，易殘留于最終加工食品中，如脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(Deoxynivalenol)、玉米赤霉烯酮(Zearalenone)及伏馬毒素(Fumonisins)。國家標準《食品安全國家標準食品中真菌毒素限量》(GB2761-2011) 雖對部分已知毒素的限量做了規(guī)定，但遠不能滿足當前食品安全監(jiān)管的需求[5-7]。近年來，隨著研究的不斷深入，新興的鐮刀菌毒素(Fusarium mycotoxins)不斷被發(fā)現(xiàn)，其中4種恩鐮孢菌素(Enniatin)A、A1、B、B1，以及白僵菌毒素(Beauvericin)最引人關(guān)注。文獻表明這些毒素均有不同的毒性，有些毒性甚至超過先前發(fā)現(xiàn)的其他毒素，且可能與其他毒素產(chǎn)生協(xié)同毒害作用。國外學者曾對全球多個國家和地區(qū)的糧食進行該類毒素的篩查，發(fā)現(xiàn)潮濕氣候的地區(qū)糧食中新興鐮刀菌毒素的檢出率非常高[8-10]。我國南方地區(qū)溫暖潮濕，糧谷儲存不當極易引起霉菌滋生，產(chǎn)生毒素。迄今為止，國內(nèi)并無該類毒素公開的檢測方法，這給食品安全監(jiān)管工作帶來了很大的風險。

本文采用基于QuEChERS原理的快速提取方法，結(jié)合超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)建立了小麥粉中5種鐮刀菌毒素(恩鐮孢菌素A、恩鐮孢菌素A1、恩鐮孢菌素B、恩鐮孢菌素B1、白僵菌毒素)的快速測定方法。該方法具有簡便快速、可操作性強等優(yōu)點，可為企業(yè)控制產(chǎn)品質(zhì)量及食品安全監(jiān)管部門有效監(jiān)管提供技術(shù)支撐。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Agilent 1290 HPLC-6495 QQQ型超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀，配有電噴霧離子源(Agilent公司)，XS205型電子天平(Metter-Toledo公司)，氮吹儀(Organomation公司)，離心機(Hettich公司)，具塞塑料離心管(50 mL,上海安譜實驗科技股份有限公司)，有機相微孔濾膜(0.22 μm，上海安譜實驗科技股份有限公司)，渦旋混合器(Labnet公司)。

甲醇、乙腈(HPLC級，ROE公司)；無水硫酸鎂(使用前在450 ℃烘烤2 h，冷卻后備用)、氯化鈉、乙酸銨(分析純，國藥集團化學試劑有限公司)；甲酸(純度≥98.0%，上海安譜實驗科技股份有限公司)；恩鐮孢菌素A(ENA)、恩鐮孢菌素A1(ENA1)、恩鐮孢菌素B(ENB)、恩鐮孢菌素B1(ENB1)、白僵菌毒素(BEA)均購于美國Enzo Biochem公司；實驗室用水為經(jīng)Milli-Q凈化系統(tǒng)(0.22 μm過濾膜)過濾的超純水。

實驗樣品：購自南京本地超市和小型糧油店，共30個批次。

1.2 色譜-質(zhì)譜條件

液相色譜柱為Agilent Eclipse Plus C18柱(2.1 mm×50 mm,1.8 μm)，柱溫35 ℃，進樣量1 μL，流動相:A為2 mmol/L乙酸銨，B為甲醇，流速0.3 mL/min，梯度洗脫程序為：0～2 min，10% B；2～7 min，10%～90% B；7～10 min，90% B。每次進樣前用10% 流動相B平衡色譜柱3 min。

離子源：電噴霧離子源；掃描方式：正離子掃描；檢測方式：多反應監(jiān)測；毛細管電壓:3 500 V；干燥氣溫度：130 ℃；干燥氣流速：11 L/min；霧化氣壓力：172.4 kPa(25 psi)；鞘氣溫度：350 ℃；鞘氣流速：12 L/min；碎裂電壓：380 V；高壓離子漏斗電壓：200 V；低壓離子漏斗電壓：100 V，其它優(yōu)化的質(zhì)譜條件見表1。

1.3 標準溶液的配制

準確稱取標準品適量，置于100 mL 棕色容量瓶中，用乙腈分別溶解并定容至刻度，配制成100 mg/L的標準儲備溶液，-18 ℃下避光保存?zhèn)溆?。用空白樣品提取液將標準儲備溶液配制成適當濃度的基質(zhì)混合標準工作溶液，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.4 樣品前處理

準確稱取2 g樣品于50 mL離心管中，加入20 mL含1%甲酸的乙腈-水(50∶50，體積比),再加入1 g氯化鈉和4 g無水硫酸鎂，渦旋提取2 min，取出，以5 000 r/min離心2 min，取上清液50 ℃下氮吹至近干，用甲醇-2 mmol/L乙酸銨(80∶20，體積比)復溶并定容至1 mL，過0.22 μm濾膜，濾液待上機測試。

表1 5種鐮刀菌毒素的優(yōu)化質(zhì)譜參數(shù)Table 1 Optimized parameters of MS/MS for 5 fusarium mycotoxins

*quantitative ion

2 結(jié)果與討論

2.1 分析條件的優(yōu)化

2.1.1 色譜條件的優(yōu)化 考察了甲醇-水、乙腈-水兩種常見流動相體系對目標化合物的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，所有目標化合物在甲醇-水體系中的響應均較高。文獻表明，待測化合物的化學結(jié)構(gòu)屬于離子載體型時，流動相中提供的鈉離子和氫離子易與目標物結(jié)合形成[M+Na]+和[M+H]+，而在流動相中加入銨鹽，可以抑制[M+Na]+的形成，提高離子化效率[11-13]。因此，在水相中分別添加不同濃度的乙酸銨(1，2，5 mmol/L)，結(jié)果表明乙酸銨濃度為1 mmol/L和2 mmol/L時，目標化合物能得到較好的峰形，且質(zhì)譜響應較強，本文選用甲醇-2 mmol/L乙酸銨溶液作為流動相。

5種鐮刀菌毒素的極性較弱，在反相色譜柱上的保留較強，且本實驗前處理過程較為簡單，可能帶來較大的基質(zhì)干擾，需要較好的色譜分離條件作為補充，因此流動相選用梯度洗脫程序。通過優(yōu)化梯度條件(參見“1.2”)，能使目標物與干擾組分完全分離，降低了基質(zhì)影響。

圖1 優(yōu)化條件下5種鐮刀菌毒素的HPLC-MS/MS MRM色譜圖Fig.1 HPLC-MS/MS MRM chromatogram of 5 fusarium mycotoxins under the optimized condition

2.1.2 質(zhì)譜條件的優(yōu)化 在一級質(zhì)譜全掃描模式下，同時采集正負離子信號，由于目標物的分子量在600～800之間，因此選擇掃描范圍m/z100～1 000，結(jié)果發(fā)現(xiàn)目標物在正離子模式下的響應值較好，特征母離子均為[M+H]+。利用離子源和離子漏斗優(yōu)化軟件(Source and iFunnel Optimizer)優(yōu)化高壓離子漏斗電壓、低壓離子漏斗電壓、干燥氣溫度和流速、鞘氣溫度和流速。然后在子離子掃描模式下，選擇離子響應最高的子離子作為定量離子，響應次高的子離子作為定性離子，最后在多反應監(jiān)測(MRM)模式下，對目標物的碰撞能量進行優(yōu)化。5種目標物的優(yōu)化質(zhì)譜參數(shù)見表1。優(yōu)化條件下，5種鐮刀菌毒素的MRM色譜圖如圖1所示。

2.2 樣品前處理條件的優(yōu)化

真菌毒素常用的提取溶劑主要有甲醇、乙腈、乙腈-水、酸化甲醇、酸化乙腈[14-15]。文獻表明，小麥粉中的淀粉和蛋白等組分在提取過程中極易發(fā)生交聯(lián)而影響毒素的提取效果，因此提取過程中需加水以提高提取效率[16-17]。本文比較了乙腈-水(50∶50，體積比，下同)、1%甲酸的乙腈-水(50∶50)、1%甲酸的甲醇-水(50∶50) 3種提取溶劑對目標物萃取率的影響。結(jié)果表明，采用1%甲酸的甲醇-水(50∶50)、乙腈-水(50∶50)提取時，回收率為50%～79%；而采用1%甲酸的乙腈-水(50∶50)提取時的回收率最高，回收率為70%～84%。因此，本文選擇1%甲酸的乙腈-水(50∶50)為最佳提取溶劑。

QuEChERS方法中鹽析劑對實驗結(jié)果也有重要影響，鹽析劑可以促使有機相與水相的分層，多數(shù)研究人員采用4 g無水硫酸鎂和1 g氯化鈉的混合鹽獲得了理想的分層效果[18-19]。因此比較了添加鹽析劑(4 g無水硫酸鎂、1 g氯化鈉)和不添加鹽析劑對提取效率的影響。實驗結(jié)果表明，添加鹽析劑能有效促進提取液分層，使鐮刀菌毒素的回收率提高8%～32%。

進一步比較了渦旋提取時間(1，2，5，10 min)對提取效率的影響，結(jié)果顯示，渦旋2 min后回收率趨于平穩(wěn)，因此選擇渦旋提取時間為2 min。不同的復溶溶劑對回收率的影響也很大，本文所研究的5種毒素極性較小，需要高比例的有機相才能完全溶解，但直接采用乙腈或甲醇溶解后，上機測試會出現(xiàn)較大的溶劑效應，而采用初始流動相甲醇-2 mmol/L乙酸銨(10∶90)復溶不能完全溶解殘留物，回收率較低。通過比較不同比例的甲醇-乙酸銨溶液，最終選擇甲醇-2 mmol/L乙酸銨水溶液(80∶20)作為復溶溶劑，此時溶劑效應最小，溶解性好。

2.3 基質(zhì)效應、線性關(guān)系與定量下限

本文采用基質(zhì)標準溶液曲線的斜率和溶劑標準溶液曲線的斜率之比(K)來評價基質(zhì)效應，當K大于1時為基質(zhì)增強效應，K小于1時為基質(zhì)減弱效應，當K等于1時無基質(zhì)效應。5種鐮刀菌毒素的基質(zhì)效應見表2。由表可知，小麥粉基質(zhì)對5種鐮刀菌毒素均具有基質(zhì)減弱效應，因此需采用基質(zhì)標準溶液對目標物進行定量分析。將5種鐮刀菌毒素標準儲備液分別用空白樣品提取液配制成不同濃度系列的基質(zhì)標準工作溶液，并按優(yōu)化條件進行測定，以濃度(x,μg/L)為橫坐標，對應目標物的峰面積(y)為縱坐標，繪制標準曲線。結(jié)果表明，5種鐮刀菌毒素的響應值與其濃度在一定范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)均不小于0.993(見表2)。以3倍信噪比(S/N=3)計算方法的檢出限(LOD)，S/N=10計算方法的定量下限(LOQ)，具體結(jié)果見表2。結(jié)果表明，5種鐮刀菌毒素的LOD為0.3～0.8 μg/kg，LOQ為0.8～2.4 μg/kg，方法具有較高的靈敏度。

表2 5種鐮刀菌毒素的線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)、斜率比、基質(zhì)效應、檢出限和定量下限Table 2 Linear ranges,regression equations,correlation coefficients(r2),slopes of matrix/solvent(K), matrix effects,LODs and LOQs of 5 fusarium mycotoxins

2.4 準確度與精密度

向空白小麥粉樣品中添加5種鐮刀菌毒素的1倍、2倍、10倍定量下限3個濃度水平的混合標準溶液，進行準確度和精密度實驗，每個濃度樣品平行測定6次，測定結(jié)果見表3。由表3可見，5種鐮刀菌毒素在3個加標水平下的平均回收率為74.0%～85.4%，相對標準偏差(RSD)為5.6%～13.1%，表明方法具有較好的準確度與精密度。

表3 5種鐮刀菌毒素的加標回收率與相對標準偏差(n=6)Table 3 Recoveries and RSDs of 5 fusarium mycotoxins(n=6)

圖2 陽性樣品經(jīng)HPLC-MS/MS分析的MRM色譜圖Fig.2 HPLC-MS/MS MRM chromatogram of a positive sample

2.5 實際樣品的檢測

采用建立的方法對市場上30批小麥粉中的5種鐮刀菌毒素進行測定，結(jié)果有25批樣品檢出ENB，含量為2.4～54.1 μg/kg，20批樣品檢出ENB1，含量為2.0～7.1 μg/kg，4批樣品檢出BEA，含量為5.1～6.2 μg/kg。圖2為某陽性小麥粉樣品的色譜圖。

3 結(jié) 論

本文基于QuEChERS原理的前處理技術(shù)，結(jié)合超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜建立了快速測定小麥粉中5種鐮刀菌毒素殘留的方法。在前處理條件考察過程中，優(yōu)化了提取溶劑、鹽析劑、渦旋提取時間等關(guān)鍵因素。通過優(yōu)化色譜及質(zhì)譜參數(shù)，得到了最佳的儀器檢測條件。本方法簡便快捷，靈敏度高，可以滿足對小麥粉中鐮刀菌毒素殘留的檢測要求，并為企業(yè)控制產(chǎn)品質(zhì)量及食品安全監(jiān)管部門有效監(jiān)管提供了技術(shù)支撐。

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Determination of 5 Fusarium Mycotoxins in Wheat Flour by QuEChERS Extraction Combined with Ultra Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry

YANG Jun,SUN Xiao-jie*,HU Wen-yan,WANG Yu-mei

(Nanjing Institute for food and Drug Control,Nanjing 210038，China)

An ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometric(UPLC-MS/MS) method was developed for the simultaneous determination of 5 fusarium mycotoxins in wheat flour,including enniatins A,enniatins A1,enniatins B,enniatins B1 and beauvericin.The fusarium mycotoxins were extracted from the samples using a modified QuEChERS-based extraction procedure without any further clean-up step.The separation of the analytes was carried out on an Agilent Eclipse Plus C18column(50 mm×2.1 mm,1.8 μm) using the mobile phases of methanol and 2 mmol/L ammonium acetate by gradient elution．The detection was performed in the electrospray ion(ESI) positive mode and multiple reaction monitoring(MRM) mode.The matrix-matched calibrations were used to quantify the residue concentrations.The proposed method showed good linear relationship with correlation coefficients all above 0.993.The limits of detection(LODs)were in the range of 0.3-0.8 μg/kg,and the limits of quantitation(LOQs) were 0.8-2.4 μg/kg.The blank samples were fortified at three spiked levels(1 times,2 times,10 times of LOQ),and the average recoveries ranged from 74.0% to 85.4% with relative standard deviations(RSDs) of 5.6%-13.1%.The developed method was successfully applied in analysis of fusarium mycotoxins in 30 samples bought from the market.The method was simple,rapid,accurate and sensitive,and was suitable for the simultaneous analysis of multi-fusarium mycotoxins in wheat flour.

ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry(UPLC-MS/MS);fusarium mycotoxins;QuEChERS;wheat flour

2017-02-06；

2017-03-10

南京市科技發(fā)展計劃項目(201505025)

10.3969/j.issn.1004-4957.2017.07.007

O657.63；S852.44

A

1004-4957(2017)07-0882-05

*通訊作者：孫小杰，碩士，高級工程師，研究方向：食品質(zhì)量安全，Tel:025-89636186，E-mail:55223141@qq.com