劉奇章， 龔興國

(浙江大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 生物化學(xué)研究所， 浙江 杭州 310058)

穿心蓮內(nèi)酯誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞周期抑制和內(nèi)源性凋亡

劉奇章， 龔興國*

(浙江大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 生物化學(xué)研究所， 浙江 杭州 310058)

研究了穿心蓮內(nèi)酯誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞SGC-7901生長抑制、周期阻滯與細(xì)胞凋亡的作用機制.用梯度濃度的穿心蓮內(nèi)酯作用于SGC-7901細(xì)胞，以MTT法檢測藥物對細(xì)胞的生長抑制情況；以流式細(xì)胞技術(shù)檢測SGC-7901的周期分布狀況、胞內(nèi)的ROS水平以及線粒體膜電位的變化；以Annexin V-FITC/PI雙染法檢測細(xì)胞凋亡的水平；以Western blot檢測不同加藥濃度處理后的細(xì)胞內(nèi)相關(guān)蛋白水平的變化.可知穿心蓮內(nèi)酯對SGC-7901細(xì)胞具有時間依賴和濃度依賴的抑制效果，48 h的IC50約為24 μg· mL-1；并且能夠有效抑制G2/M期的周期進(jìn)展，隨后誘發(fā)內(nèi)源性凋亡途徑；與此同時，細(xì)胞內(nèi)的ROS水平上升，線粒體膜電位下降；再加入NADPH之后，細(xì)胞內(nèi)的GSH水平有所回升，周期阻滯得到緩解.細(xì)胞內(nèi)的p53、p-CDC2、cleaved caspase-3/9、Bax等上調(diào)；bcl-2等水平下調(diào).穿心蓮內(nèi)酯是通過上調(diào)胞內(nèi)ROS水平并使線粒體膜電位崩潰而誘發(fā)G2/M期的周期阻滯與內(nèi)源性凋亡，最終抑制SGC-7901細(xì)胞的生長.

穿心蓮內(nèi)酯；胃癌；凋亡誘導(dǎo)；周期阻滯

穿心蓮內(nèi)酯是從天然植物穿心蓮中萃取的二萜類內(nèi)酯活性化合物，分子量為350 D，已有研究表明穿心蓮內(nèi)酯具有抗菌消炎、抗病毒、抗腫瘤、調(diào)節(jié)免疫、治療心血管疾病[1]等功能，而穿心蓮內(nèi)酯的抗腫瘤功能更是近年來的研究熱點.據(jù)文獻(xiàn)[2]報道，穿心蓮內(nèi)酯具有抑制多種腫瘤細(xì)胞生長的作用，其機制包括凋亡誘導(dǎo)、周期阻滯、抑制Na+-K+-ATPase & PKC等活性以及激活泛素蛋白酶體介導(dǎo)的蛋白降解途徑等.

線粒體膜電位ΔΨm(MMP)是維持線粒體結(jié)構(gòu)與功能穩(wěn)定的根本，線粒體在氧化呼吸過程中，將產(chǎn)生的能量以電化學(xué)勢能儲存在線粒體內(nèi)膜，內(nèi)膜兩側(cè)質(zhì)子及其他離子濃度的不對稱分布而形成的線粒體膜電勢差就是線粒體膜電位；因此，膜電位的穩(wěn)定直接關(guān)系到ATP的合成.此外，線粒體中ROS水平的上升會導(dǎo)致線粒體膜電位的下降.

已有研究表明，穿心蓮內(nèi)酯可以上調(diào)多種細(xì)胞內(nèi)ROS水平，而ROS水平的上升會導(dǎo)致細(xì)胞凋亡和周期阻滯[6].因此，穿心蓮內(nèi)酯可以作為一種腫瘤細(xì)胞殺傷藥物，通過上調(diào)細(xì)胞內(nèi)的ROS水平抑制腫瘤生長.

本文通過MTT實驗檢測穿心蓮內(nèi)酯對SGC-7901細(xì)胞的處理,初步了解穿心蓮內(nèi)酯對胃癌細(xì)胞的生長抑制作用；借助流式細(xì)胞技術(shù)檢測穿心蓮內(nèi)酯對SGC-7901細(xì)胞周期分布、細(xì)胞凋亡的影響，同時檢測細(xì)胞內(nèi)ROS水平與膜電位的變化，并利用Western blot分析穿心蓮內(nèi)酯對細(xì)胞凋亡及周期相關(guān)蛋白表達(dá)水平的影響,以闡述穿心蓮內(nèi)酯殺死胃癌細(xì)胞的機制.

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

SGC-7901為本實驗室保存；穿心蓮內(nèi)酯(購于上海晶純生化科技股份有限公司(阿拉丁))溶于DMSO(sigma),溴化噻唑藍(lán)四氮唑(MTT)；新生牛血清與RPMI1640培養(yǎng)基(含雙抗，Gibico原裝干粉配制，0.1 μm無菌濾膜過濾，無支原體) 購于杭州四季青生物工程公司；胰蛋白酶(含0.5 mM EDTA，Gibico原裝干粉配制)和PBS(Gibico原裝干粉配制)均購于杭州吉諾生物技術(shù)公司；Annexin V-FITC&PI凋亡檢測試劑盒購于南京凱基生物科技有限公司；P53、cdc2、Caspase3/9抗體購于碧云天生物技術(shù)公司；BAX、Bcl抗體、N-乙酰半胱氨酸(NAC)、NADPH購于上海生工生物技術(shù)有限公司；

Multiskan MK3酶標(biāo)儀購于賽默飛世爾(上海)儀器有限公司；低速離心機購于安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司，流式細(xì)胞儀購于Beckman Coulter公司.

1.2 方 法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

細(xì)胞培養(yǎng)使用含10%胎牛血清、100 U· mL-1青霉素與100 U· mL-1鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)液.將培養(yǎng)液置于飽和濕度下含5%二氧化碳的細(xì)胞培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng).每日更換新鮮培養(yǎng)基，當(dāng)細(xì)胞長滿到80%左右，傳代.

1.2.2 細(xì)胞活力檢測

采用MTT檢測穿心蓮內(nèi)酯對腫瘤細(xì)胞SGC-7901生長抑制的效果；按照2.5×105cells·mL-1的濃度接種到96孔板中，培養(yǎng)12 h.每孔中分別加入不同濃度的穿心蓮內(nèi)酯(0，8，16，32，64 μg· mL-1)，每個藥物濃度設(shè)置5個重復(fù)，培養(yǎng)24，48，72 h，棄去培養(yǎng)基，加入120 μL MTT溶液(5 mg· mL-1)，37 ℃避光孵充4 h，吸去溶液，每孔加入150 μL DMSO以溶解甲臜.震蕩2 min，490 nm檢測吸光度值，并根據(jù)吸光度值計算腫瘤細(xì)胞的存活率(細(xì)胞存活率=實驗吸光度值/對照吸光度值×100%).

所有實驗數(shù)據(jù)都是在重復(fù)3次以上之后得到的結(jié)果.

1.2.3 細(xì)胞凋亡與周期檢測

Annexin V-FITC&PI細(xì)胞凋亡檢測：Annexin V是一種Ca2+依賴性磷脂結(jié)合蛋白，不能透過細(xì)胞膜，與磷酯酰絲氨酸(PS)有很高的親和性，凋亡早期PS外翻，因此用熒光素FITC標(biāo)記Annexin V后，可以用來檢測早凋；碘化丙啶(propidium iodide, PI)是一種核酸染料，正常細(xì)胞的細(xì)胞膜完整，具有選擇通過性，染料無法穿透細(xì)胞膜從而無法染色.但是，由于壞死細(xì)胞或晚期凋亡細(xì)胞核膜的不完整性， PI可以與核酸結(jié)合呈現(xiàn)紅光，同時Annexin V也會進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)與PS結(jié)合呈現(xiàn)綠色，以此作為一種壞死細(xì)胞或晚期凋亡的檢測手段.AV&PI雙染區(qū)別細(xì)胞的依據(jù)是：正常細(xì)胞沒有熒光；早凋細(xì)胞呈綠色熒光，晚期凋亡細(xì)胞呈綠色和紅色.人胃癌細(xì)胞SGC-7901種植于6孔板中37 ℃ 5%CO2孵育至80%，加入含有不同濃度藥物(0，16，24，32 μg· mL-1)的培養(yǎng)基，培養(yǎng)48 h.離心(1 200 r·min-1，5 min)，采用不含EDTA的胰酶消化，再離心收集細(xì)胞，PBS洗滌2次，根據(jù)凱基Annexin V-FITC&PI細(xì)胞凋亡檢測盒說明書加入結(jié)合緩沖液，Annexin V-FITC和PI染液，混勻，室溫避光反應(yīng)10 min，過200目篩，流式細(xì)胞儀下檢測.

PI周期檢測：細(xì)胞周期分為G0/G1，S，G2，M；G0/G1的DNA為二倍體，G2為四倍體，因此當(dāng)外界因素使得細(xì)胞處于其中某個階段時，可以通過檢測DNA的分布狀態(tài)確定細(xì)胞的周期捕獲(cycle arrest)；PI能選擇性地嵌入核酸DNA和RNA雙鏈螺旋的堿基之間與之結(jié)合，其結(jié)合的量與DNA含量成正比例，可以借助流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析.SGC-7901細(xì)胞種植于6孔板孵育培養(yǎng)至80%，加入無血清培養(yǎng)基同步24 h以上，加入含不同濃度藥物的培養(yǎng)基，培養(yǎng)48 h.胰酶消化收集細(xì)胞，離心，PBS清洗2次，70%酒精重懸固定12 h以上；離心，周期檢測試劑緩沖液重懸，加入適量PI染液，混勻，流式細(xì)胞儀檢測熒光強度.

1.2.4 Hoechst 33258染色

非嵌入型熒光染料Hoechst 33258是一種可穿透細(xì)胞膜的藍(lán)色熒光染料，可以在活細(xì)胞的DNA的AT富集區(qū)域與雙鏈DNA結(jié)合，從而使核著色，而且這類染料可以與活細(xì)胞或者固定的細(xì)胞結(jié)合.

取適量對數(shù)生長期的SGC-7901細(xì)胞鋪入有爬片的24孔板培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞長至約80%時，加入含有不同濃度藥物的1640培養(yǎng)基，37 ℃培育48 h；棄去上清，PBS清洗1遍，加入預(yù)先融化的Hoechst 33258染液，每孔加入500 μL染液，37 ℃孵育30 min，棄上清，PBS清洗2～3遍，挑出爬片倒扣在載玻片上，周圍滴入50%甘油，以防止水分揮發(fā)變干.拿至熒光倒置顯微鏡處觀察拍照，正常細(xì)胞的細(xì)胞核會出現(xiàn)淡染的現(xiàn)象，細(xì)胞發(fā)生凋亡時，會看到凋亡細(xì)胞的細(xì)胞核呈深染，或呈碎塊狀致密濃染.

1.2.5 ROS檢測

DCFH-DA正常情況下是不發(fā)光的，但是可以自由穿過細(xì)胞膜，進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)后可被細(xì)胞內(nèi)的酯酶分解成DCFH,后者不能透過細(xì)胞膜，從而使探針很容易固定在細(xì)胞內(nèi)，當(dāng)胞內(nèi)的活性氧上升時，DCFH與ROS反應(yīng)生成具有熒光的DCF,借助流式細(xì)胞技術(shù)檢測DCF熒光的強度，從而檢測ROS在細(xì)胞內(nèi)的水平.

取對數(shù)生長期的細(xì)胞，適量鋪入6孔板培養(yǎng)皿內(nèi)，37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)至80%左右，加入含有不同濃度藥物的培養(yǎng)基，48 h后，棄上清，胰酶消化1 200 r·min-1離心10 min收集細(xì)胞，PBS清洗1遍，37 ℃避光條件下，將細(xì)胞與1 mL含有10 μM DCFH-DA的無血清培養(yǎng)基孵育30 min，PBS清洗2遍，流式細(xì)胞儀下檢測熒光強度.

1.2.6 線粒體膜電位檢測

細(xì)胞在凋亡過程中通常會伴隨線粒體膜電位的崩潰，這一事件的發(fā)生已經(jīng)被廣泛認(rèn)為是凋亡早期發(fā)生的標(biāo)志.檢測線粒體膜電位的方法有很多種，JC-1是其中一種；JC-1在低濃度時以單體形式存在，濃度過高時則以二聚體的形式存在，前者發(fā)綠色熒光，后者則發(fā)出紅色熒光；并且JC-1進(jìn)入正常細(xì)胞的線粒體后由于濃度升高，會發(fā)出紅色熒光，細(xì)胞受到外界的不良因素刺激或者人為干擾，導(dǎo)致線粒體的膜電位崩塌，進(jìn)而JC-1外泄，因此濃度降低，分成單體發(fā)出綠光，可以此為檢測線粒體膜電位的依據(jù).

取對數(shù)期SGC-7901細(xì)胞，種植于6孔板中，待細(xì)胞長至80%左右，加入含有不同濃度的藥物與陽性的1640培養(yǎng)基，培養(yǎng)48 h，保留培養(yǎng)基，胰酶消化1 min，終止，收集細(xì)胞，1 200 r·min-1離心10 min，棄上清，2 mL PBS重懸清洗1遍，1 200 r·min-1離心7 min，棄上清；預(yù)先配制好JC-1工作液，取適量JC-1(200X)，按照每50 μL JC-1(200X)加入8 mL超純水的比例稀釋JC-1.充分溶解并混勻，然后再加入2 mL JC-1染色緩沖液(5X)，混勻后即為JC-1染色工作液.每孔加入1 mL工作液，混勻，37 ℃孵育20 min；孵育結(jié)束后，1 200 r·min-1離心7 min去上清液，PBS清洗1～2遍，再用適量JC-1染色緩沖液(1X)重懸后，即可進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測.

1.2.7 Z-VAD-FMK,3-MA和 NADPH補償實驗

Z-VAD-FMK是凋亡相關(guān)蛋白酶caspase特異性抑制劑，而3-MA是自噬抑制劑,用含血清培養(yǎng)基預(yù)處理待加藥細(xì)胞1 h，作用濃度分別為20 μmol·L-1和5 mmol·L-1.藥物處理，然后檢測細(xì)胞活力.

NAC是一種ROS消除劑，而NADPH是細(xì)胞內(nèi)的還原當(dāng)量，與細(xì)胞內(nèi)的物質(zhì)代謝和ROS的清除有著直接的關(guān)系.分別使用濃度為10 μmol·L-1的NAC與20 μmol·L-1的NADPH預(yù)處理細(xì)胞，藥物處理過后進(jìn)行MTT實驗和流式細(xì)胞檢測.

2 結(jié) 果

2.1 穿心蓮內(nèi)酯(AD)對胃癌細(xì)胞SGC-7901的生長抑制作用

MTT實驗得出AD處理細(xì)胞24，48和72 h后細(xì)胞50%生長抑制濃度(IC50)分別為96.1, 24.3 和20.7 μg· mL-1，可見AD對SGC-7901細(xì)胞的生長抑制作用具有時間依賴性，48 h之后作用效果加強(見圖1(a)和(b)).(*p<0.05,**p<0.01, ***p<0.0001,n=5,Tukey檢驗)

為了觀察穿心蓮內(nèi)酯對正常胃細(xì)胞是否具有生長抑制作用，做了2個胃上皮細(xì)胞的MTT實驗，結(jié)果表明：穿心蓮內(nèi)酯對正常胃上皮細(xì)胞的生長沒有影響(見圖1(c)和(d)).

隨后，采用了2種抑制劑(Z-VAD-FMK是凋亡相關(guān)蛋白酶caspase的特異性抑制劑,而3-MA是自噬抑制劑,用含血清培養(yǎng)基預(yù)處理待加藥細(xì)胞1 h)來初步判定穿心蓮內(nèi)酯對SGC-7901細(xì)胞生長抑制的作用機制.實驗結(jié)果如圖1(e)和(f)所示:凋亡抑制劑的預(yù)處理能夠有效恢復(fù)穿心蓮內(nèi)酯造成的細(xì)胞生長抑制作用,但是自噬抑制劑卻沒有這一作用.

圖1 細(xì)胞活力實驗Fig.1 MTT assays(a)圖中24和48 h、24和72 h的細(xì)胞活力對比具有顯著差異性，可以看出藥物作用48 h后具有明顯的生長抑制效果;(b)圖是(a)圖同一實驗數(shù)據(jù)的折線圖：可見在處理48和72 h 2個時間梯度中，藥物濃度大于16 μg· mL-1之后的作用效果不具有顯著性差異，所以實驗開始時選取3個時間梯度(24,48,72 h), 最終選擇48 h作為后續(xù)實驗的處理時間，在確定48 h的IC50后，將后續(xù)實驗濃度調(diào)整為0，16，24，32 μg· mL-1;(c)、(d)圖是藥物對正常胃上皮細(xì)胞的2個MTT實驗，目的在于驗證藥物對正常細(xì)胞沒有生長抑制作用；正常細(xì)胞在各個藥物濃度下都沒有表現(xiàn)出生長抑制的效果；圖中開始鋪板時的正常細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞數(shù)目相同，最終腫瘤細(xì)胞在0 μg· mL-1的吸光度比正常細(xì)胞高的原因可能是腫瘤細(xì)胞的分裂生長速度要比正常細(xì)胞快；(e)和(f)圖分別是凋亡抑制實驗和自噬抑制實驗的MTT結(jié)果，其中凋亡抑制劑Z-VAD-FMK的濃度為10 μmol·L-1，自噬抑制劑3-MA濃度為50 μmol·L-1.

2.2 穿心蓮內(nèi)酯作用下SGC-7901細(xì)胞的ROS水平

隨著藥物濃度的增加，SGC-7901細(xì)胞內(nèi)的ROS水平逐漸升高；并且在用NAC與NADPH預(yù)處理的實驗組中ROS水平明顯降低(見圖2(a)和(b)).

圖2 細(xì)胞內(nèi)活性氧、三磷酸腺苷和谷胱甘肽的濃度檢測Fig.2 Level detection of ROS, ATP and GSH(a)和(b)圖分別是藥物處理后細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS)水平的變化，陽性對照組是200 μmol·L-1 H2O2 處理的SGC7901細(xì)胞，其中NAC與NADPH的濃度分別為10 μmol·L-1與20 μmol·L-1；(c)和(d)圖為不同藥物濃度處理后細(xì)胞內(nèi)ATP水平的變化，以及用NAC和NDAPH預(yù)處理后在IC50藥物濃度下細(xì)胞內(nèi)ATP水平的補償實驗；(e)圖是IC50藥物濃度處理后細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽的水平變化和補償實驗；(f)圖為NADPH對細(xì)胞活力陰性對照實驗和在IC50藥物濃度下NADPH的補償實驗.

2.3 穿心蓮內(nèi)酯導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)ATP和GSH水平降低

穿心蓮內(nèi)酯影響線粒體膜電位，而線粒體膜電位對氧化呼吸鏈的正常運行至關(guān)重要.線粒體中進(jìn)行氧化呼吸，產(chǎn)生能量貨幣ATP，膜電位的變化必然影響ATP的產(chǎn)生.同樣，本實驗也檢測到穿心蓮內(nèi)酯處理SGC-7901后的細(xì)胞內(nèi)ATP和GSH含量的降低，并且可以被NAC和NADPH的預(yù)處理恢復(fù)(見圖2(d)和(e)).

2.4 穿心蓮內(nèi)酯對線粒體膜電位的影響

線粒體膜電位(mitochondrial membrane potential，MMP)崩潰是細(xì)胞早凋的標(biāo)志之一.流式細(xì)胞儀檢測發(fā)現(xiàn)，不同濃度穿心蓮內(nèi)酯(0,16，24，32 μg· mL-1)處理后的線粒體膜電位變化隨加藥濃度的增加而更明顯(見圖3(a)).

2.5 穿心蓮內(nèi)酯對G2/M期的周期阻滯與線粒體凋亡途徑的誘導(dǎo)

隨著穿心蓮內(nèi)酯濃度(0，16，24，32 μg· mL-1)的升高，SGC-7901細(xì)胞在G2/M期的周期阻滯(見圖3(c))逐漸增強：(7.4±0.87)%，(14.3±1.37)%，(29.7±1.6)%，(40.1±3.35)%.

采用不同濃度穿心蓮內(nèi)酯(0，16，24，32 μg· mL-1)對SGC-7901處理48 h后，用 Annexin V-FITC & PI雙染試劑處理細(xì)胞，于流式細(xì)胞儀下分選，結(jié)果表明凋亡率隨著藥物濃度的提高而上升(見圖3(b)).

圖3 穿心蓮內(nèi)酯誘導(dǎo)SGC-7901細(xì)胞凋亡和周期抑制的流式圖Fig.3 Apoptosis and cycle arrest of SGC-7901 induced by andrographolide(a)圖為藥物處理過后線粒體膜電位的變化，其中FL2通道為膜電位正常的細(xì)胞，F(xiàn)L1通道為膜電位崩潰的細(xì)胞;(b)為凋亡流式圖，其中B4象限為早凋細(xì)胞，B2象限為晚凋或者壞死的細(xì)胞;(c)為周期阻滯的流式檢測，其中數(shù)字表示G2期細(xì)胞的百分比;(d)為20 μmol·L-1 NADPH預(yù)處理后的周期恢復(fù)流式圖；以上數(shù)字都是平均值±標(biāo)準(zhǔn)方差(mean±SD).

2.6 Hoechst 33258染色

Hoechst 332258是針對細(xì)胞核進(jìn)行染色的染料，從一個側(cè)面可以反映細(xì)胞凋亡的數(shù)量.本實驗在不同濃度的穿心蓮內(nèi)酯(0，16，24，32 μg·mL-1)處理胃癌細(xì)胞SGC7901后，用Hoechst 33258進(jìn)行染色，結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著濃度的升高，深染細(xì)胞增多(見圖4).說明穿心蓮內(nèi)酯誘導(dǎo)了細(xì)胞凋亡，并且隨著藥物濃度的升高，凋亡率上升.

圖4 Hoechst 33258染色Fig.4 Hoechst 33258 staining圖4為形態(tài)學(xué)染色，進(jìn)一步佐證藥物誘導(dǎo)了凋亡的發(fā)生，其中紅色圓圈處的深染為凋亡細(xì)胞，箭頭所指的淡染為正常細(xì)胞；可見隨著濃度的增加，深染的細(xì)胞數(shù)量越來越多，從而也說明凋亡率隨著濃度的增加而增加，與圖3(b)的流式結(jié)果一致.

2.7 NADPH的預(yù)處理對穿心蓮內(nèi)酯的周期阻滯具有補償作用

在流式細(xì)胞儀上檢測到周期捕獲和凋亡現(xiàn)象后，隨后檢測了這2個生理過程中幾個相關(guān)蛋白的水平(見圖5(a)、(b)).XIAP是凋亡抑制蛋白，在凋亡發(fā)生時表達(dá)水平會降低，從而有利于凋亡的發(fā)生；cleaved-Caspase 3/9是活化形態(tài)的半胱氨酸蛋白酶，是凋亡的標(biāo)志蛋白；而Bcl-2和BAX是Bcl家族成員，前者能夠抑制凋亡發(fā)生，后者具有抑制作用.細(xì)胞色素C則是半胱氨酸酶發(fā)生級聯(lián)反應(yīng)的起始因子.p53蛋白是一種抑癌基因，作為轉(zhuǎn)錄因子會轉(zhuǎn)錄激活14-3-3，p21，GADD45 等蛋白的表達(dá)，從而抑制周期蛋白 cdc2 與 CyclinB1 的活性，使之轉(zhuǎn)運出核并抑制二者的結(jié)合，從而抑制 G2/M 期的進(jìn)展.Chk2是一種激酶，可以磷酸化cdc25,導(dǎo)致其失活，而后者可以激活cdc2,促進(jìn)G2/M 期的跨越.然而，在用NADPH預(yù)處理SGC-7901細(xì)胞后，再用藥物處理細(xì)胞，與正常加藥組細(xì)胞相比，其周期阻滯得到恢復(fù)，但并不完全(NADPH對24 μg· mL-1加藥組的周期抑制從31%下降到13%，見圖2(f)和3(d)),同時周期、凋亡相關(guān)蛋白水平都有所恢復(fù)(見圖5(a)和(b)).

圖5 凋亡和周期相關(guān)蛋白水平變化以及NADPH的補償效應(yīng)Fig.5 The changes of relevant proteins in apoptosis and G2/M phase and compensation of NADPH(a)(b)分別是凋亡相關(guān)蛋白和周期相關(guān)蛋白水平的變化，其中與凋亡相關(guān)的XIAP水平降低，活化的Caspase3/9水平上升，同時bcl-2下調(diào)，BAX上調(diào)，胞質(zhì)中的細(xì)胞色素C濃度上升；在周期相關(guān)蛋白中p53、Chk2和磷酸化的CDC2水平下調(diào)，CDC25C和Cyclin B1表達(dá)水平下降，這些都進(jìn)一步驗證藥物誘導(dǎo)了內(nèi)源性凋亡和G2/M期阻滯的發(fā)生；(c)(d)分別為20 μmol·L-1 NADPH預(yù)處理后，在IC50藥物濃度下，凋亡和周期相關(guān)蛋白水平的變化，可見相關(guān)蛋白水平得到了恢復(fù).

3 討 論

細(xì)胞周期的阻滯受到多種因素的調(diào)控，其中ROS介導(dǎo)的周期調(diào)控值得深入研究.穿心蓮內(nèi)酯作為一種中藥提取物，具有多種生理功能，流式檢測發(fā)現(xiàn)其提高了SGC-7901細(xì)胞內(nèi)的活性氧水平，引起細(xì)胞膜電位的崩潰從而阻滯細(xì)胞周期.在實驗過程中，通過補償實驗證明穿心蓮內(nèi)酯降低NADPH及GSH的水平，使得細(xì)胞處于高度氧化狀態(tài)，因為有實驗指出NADPH與細(xì)胞內(nèi)ROS水平密切相關(guān)[7]，并且GSSG的還原也需要NADPH的參與；ROS水平的提高激活了ROS介導(dǎo)的信號途徑，最終與細(xì)胞周期相關(guān)的蛋白水平發(fā)生改變.本文并無直接證據(jù)證明穿心蓮內(nèi)酯通過何種途徑促使一連串的細(xì)胞內(nèi)信號的改變，但間接地說明了穿心蓮內(nèi)酯具有此種功能.

另外，很多藥物作用都是濃度依賴和時間依賴的，穿心蓮內(nèi)酯也不例外.做了24，48，72 h時間梯度，最終將實驗時間定在48 h，因此時藥效好而且細(xì)胞死亡率不是太高，對后續(xù)實驗的進(jìn)行較為有利.

周期阻滯是抑制細(xì)胞生長的方式之一，之前已有研究指出穿心蓮內(nèi)酯能夠引起細(xì)胞周期的阻滯,并且主要通過使周期抑制蛋白P27過表達(dá)來實現(xiàn)，不過P27對周期的抑制主要是將周期抑制在G0～G1期[8]，而本研究的結(jié)果是將細(xì)胞周期阻滯在G2/M期，這說明穿心蓮內(nèi)酯對胃癌細(xì)胞SGC-7901的周期阻滯不是通過P27抑制信號通路實現(xiàn)的.實驗中發(fā)現(xiàn)，調(diào)控該節(jié)點(checkpoint)的關(guān)鍵蛋白cdc25c，cdc2和CyclineB1都下調(diào)了,同時p53,Chk2上調(diào)了，表明藥物是通過DNA-PK/p53/cdc2和ATM/ATR/Chk2/cdc25途徑誘導(dǎo)G2/M期的抑制，并最終導(dǎo)致內(nèi)源性細(xì)胞凋亡.實驗僅證明了穿心蓮內(nèi)酯能提高SGC-7901細(xì)胞內(nèi)ROS水平，并未有直接研究剖析高水平的ROS如何影響周期相關(guān)蛋白表達(dá)水平的.不過也有實驗證明細(xì)胞內(nèi)ROS可以直接作用于周期蛋白P21，激活P21的表達(dá)并導(dǎo)致G1期細(xì)胞周期阻滯[9].然后，進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)中的ROS接下來進(jìn)入細(xì)胞核對DNA造成損傷，進(jìn)一步激發(fā)了內(nèi)源途徑凋亡[10]，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡.

實驗發(fā)現(xiàn)穿心蓮內(nèi)酯能夠提升胃癌細(xì)胞SGC-7901內(nèi)的ROS水平，并將胃癌細(xì)胞SGC-7901的周期阻滯在G2/M期，另外MTT實驗也說明了穿心蓮內(nèi)酯能抑制胃癌細(xì)胞生長并對胃癌細(xì)胞有一定的殺傷力，這些開創(chuàng)性研究成果為利用穿心蓮內(nèi)酯治療胃癌提供了深厚的理論基礎(chǔ).

4 結(jié) 論

穿心蓮內(nèi)酯能夠抑制胃癌細(xì)胞SGC-7901的生長，其作用機制是將細(xì)胞抑制在G2/M期，并且誘導(dǎo)內(nèi)源性細(xì)胞凋亡，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡.此外在過程中，還檢測到細(xì)胞內(nèi)的線粒體膜電位崩塌，ROS水平上升，ATP和GSH水平下降，這些現(xiàn)象均說明線粒體在穿心蓮內(nèi)酯導(dǎo)致的細(xì)胞周期抑制和程序性死亡中起重要作用.通過NADPH的補償可以彌補部分周期抑制，進(jìn)一步說明藥物誘導(dǎo)的周期抑制與細(xì)胞內(nèi)的ROS水平有關(guān).

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Andrographolide induces cycle arrest at G2/M phase and intrinsic apoptosis in gastric carcinoma cells.

LIU Qizhang, GONG Xingguo

(InstituteofBiochemistry,CollegeoflifeSciences,ZhejiangUniversity,Hangzhou310058,China)

Andrographolide is one of the extractions fromAndrographispaniculata, which is a traditional herb early reported its anti-tumor efficacy, and is proved it’s the active ingredient which could suppress multiple carcinoma. It is proclaimed that many kinds of mechanisms concentrated on autophagy or apoptosis, and correlative signal pathway. To verify whether andrographolide would prevent amplification of gastric cancer cells, and to investigate the mechanism of andrographolide’s effect on cell growth, cycle arrest and induction of apoptosisinvitro, we designed the experiment: SGC7901 was treated with different doses(0, 16, 24 and 32 μg·mL-1) of andrographolide for 24, 48 and 72 h; Cell viability was measured by MTT assays to determine the efficacious time of performance. Then, investigations of cell cycle, ROS level and mitochondria membrane potential were proceeded and detected by flow cytometry. Cell apoptosis was monitored by flow cytometry using Annexin V-FITC/PI staining. Expression level of p53, p-CDC2, bcl-2, Bax were tested by western blot. Finally, we found that andrographolide effectively inhibited SGC-7901 cell growth and the IC50was 24 μg· mL-1in 48 h. Meanwhile, the medicine showed the ability of cell cycle arrest at G2/M phase and apoptosis above 60% when treated with 24 μg· mL-1andrographolide for 48 h. Western blot indicated that cell cycle and apoptosis relevant proteins, such as p53, p-CDC2 and Bax were up-regulated and bcl-2 was down-regulated. In the end, we conclude that andrographolide inhibits SGC-7901 cell proliferation through G2/M phase arrest and inducing intrinsic apoptosis pathway.

andrographolide; gastric carcinoma; induction of apoptosis; cycle arrest

2016-11-10.

劉奇章(1990-)，ORCID: http://orcid.org/0000-0002-4043-1783，男，碩士，主要從事生物化學(xué)與分子生物學(xué)研究，E-mail: 18268139991@163.com.

*通信作者，ORCID: http://orcid.org/0000-0003-1206-5154，E-mail: gongxg@zju.edu.cn.

10.3785/j.issn.1008-9497.2017.04.011

Q 50

A

1008-9497(2017)04-456-08

Journal of Zhejiang University(Science Edition), 2017,44(4):456-463