田少君 夏克東 劉斯博 李林芽

(河南工業(yè)大學(xué)糧油食品學(xué)院，鄭州 450001)

不同干燥方法對(duì)星油藤分離蛋白結(jié)構(gòu)和功能性質(zhì)的影響

田少君 夏克東 劉斯博 李林芽

(河南工業(yè)大學(xué)糧油食品學(xué)院，鄭州 450001)

通過噴霧干燥和真空冷凍干燥的方法得到星油藤分離蛋白。對(duì)它們的結(jié)構(gòu)和功能性質(zhì)進(jìn)行分析比較，結(jié)果表明，2種干燥方法對(duì)蛋白分子量分布沒有影響，但二級(jí)結(jié)構(gòu)、表面疏水性、二硫鍵含量均有改變。與原蛋白相比噴霧干燥蛋白β-轉(zhuǎn)角含量增大30.0%，無序結(jié)構(gòu)基本消失；二硫鍵含量從6.79 μmol/g增加到12.18 μmol/g。真空冷凍干燥蛋白變性程度小，溶解性質(zhì)和起泡能力也好于噴霧干燥的樣品。

噴霧干燥 真空冷凍干燥 疏水性 SDS-PAGE

星油藤又稱為南美油藤、印加果、印奇果，大戟科，木質(zhì)藤本作物，是一種新型特種油料作物，星油藤果油不飽和脂肪酸含量很高，是一種營養(yǎng)保健型食用油[1-2]。星油藤榨油后的餅中蛋白含量很高，但是目前國內(nèi)外對(duì)星油藤蛋白的研究還較少，了解的不深入，導(dǎo)致無法對(duì)其進(jìn)行有效的利用，造成了星油藤蛋白資源的浪費(fèi)。

蛋白質(zhì)功能性質(zhì)對(duì)其在食品行業(yè)的應(yīng)用有著重要的影響，然而蛋白的結(jié)構(gòu)又決定著功能性質(zhì)。蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能特性之間的關(guān)系主要體現(xiàn)在其亞基組成、親/疏水性、分子積聚狀態(tài)、亞基締合/解離形式、熱變性和熱聚集、功能基團(tuán)修飾或分解、蛋白質(zhì)/多糖相互作用、蛋白質(zhì)/脂肪相互作用等方面。溶解性、起泡性與食品蛋白分子質(zhì)量分布、亞基大小/組成、二硫鍵多寡、親水/疏水性有密切聯(lián)系[3-5]。本試驗(yàn)主要采用了傅里葉紅外光譜法、SDS-PAGE、分光光度法、ANS熒光探針等方法測(cè)定分析2種干燥方法對(duì)星油藤蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的影響并淺析結(jié)構(gòu)與功能性質(zhì)的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

星油藤餅：印奇生物資源開發(fā)有限公司；凝膠制備試劑盒：武漢博士德生物工程有限公司；ANS(色譜純)：Sigma-Aldrich 公司；低分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白(分裝進(jìn)口)：上海紀(jì)寧實(shí)業(yè)有限公司；DTNB(分析純)：洛陽試劑廠。

LGJ-10C 真空冷凍干燥機(jī)：北京四環(huán)科學(xué)儀器廠有限公司；小型臺(tái)式噴霧干燥機(jī)：瑞士Buchi實(shí)驗(yàn)儀器公司；計(jì)算機(jī)三恒電泳儀DYY-6D：北京六一儀器廠；Biorad GelDoc XR伯樂凝膠成像系統(tǒng)：伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品(上海)有限公司；傅里葉紅外(FT-IR)光譜儀：日本島津公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 原料預(yù)處理

將星油藤餅粉碎，過100目篩，45 ℃下用石油醚脫脂5 h以上，置通風(fēng)櫥中12 h進(jìn)行溶劑揮發(fā)，得星油藤脫脂粉，冰箱4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 星油藤分離蛋白的制備[5]

每次取50.0 g脫脂粉與雙蒸水按料液比1∶20混合，1 mol/L NaOH調(diào)pH至11.0，45 ℃磁力攪拌浸提30 min，然后在4 ℃下4 000 r/min離心20 min。沉淀物再重復(fù)提取2次，合并3次上清液，用1 mol/L HCl調(diào)pH至等電點(diǎn)沉淀蛋白質(zhì)，靜置沉淀后，雙蒸水洗滌沉淀3次，1 mol/L NaOH回調(diào)pH至7.0，攪拌使其復(fù)溶后干燥。噴霧干燥：進(jìn)風(fēng)溫度170 ℃，出風(fēng)溫度55～75 ℃，進(jìn)樣濃度20%～22%。真空冷凍干燥：溫度-52 ℃，真空度 0.1 MPa，時(shí)間36 h。

1.2.3 傅里葉紅外光譜分析

采用傅里葉紅外光譜儀在20 ℃下掃描，測(cè)定波段為4 000～400 cm-1，掃描次數(shù)為32次。選取紅外光譜的酰胺Ⅰ帶分析經(jīng)過不同干燥方式處理后的星油藤蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)組成；用Peak Fit v4.12軟件分析，先對(duì)紅外光譜的酰胺Ⅰ帶進(jìn)行去卷積處理，再進(jìn)行二階導(dǎo)數(shù)擬合。酰胺Ⅰ帶各峰位的指認(rèn)依據(jù)：β-折疊結(jié)構(gòu)，1 637、1 615、1 695 cm-1；β-折疊或β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)，1 684 cm-1；β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)，1 670 cm-1；α-螺旋結(jié)構(gòu)，1 640 cm-1；無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)，1 649 cm-1[6]。

1.2.4 表面疏水性的測(cè)定

參照文獻(xiàn)[7]的方法并改進(jìn)：配制0.1 mol/L的磷酸鹽緩沖液(pH 7.0)溶解蛋白樣品；室溫下磁力攪拌2 h，低溫離心15 min(10 000 r/min)，Lowry法測(cè)定上清液中蛋白含量。用磷酸鹽緩沖液稀釋上述溶液至蛋白濃度在0.5～0.005 mg/mL范圍內(nèi)，加20 μLANS(8 mmol/L)到4 mL蛋白溶液中，暗處反應(yīng)15 min，測(cè)熒光強(qiáng)度(激發(fā)波長(zhǎng)365 nm，發(fā)射波長(zhǎng)484 nm，狹縫5 nm)。以蛋白濃度為橫坐標(biāo)，熒光強(qiáng)度為縱坐標(biāo)所得線性回歸方程的斜率即為表面疏水性。

1.2.5 二硫鍵、巰基含量測(cè)定

參照文獻(xiàn)[8]的方法配制緩沖液：A：Tris-Gly(pH 8.0)；B：Tris-Gly-Urea溶液；C：DTNB(4 mg/mL)，各取20 mL 的A、B緩沖液分別溶解0.1 g的蛋白粉；振蕩離心取上清液0.25、0.5、0.75、1.0、1.25、1.5 mL；分別加0.1 mL C振蕩30 min，稀釋至3 mL于412 nm下測(cè)吸光度值。

巰基含量/μmol/g=73.53×A412×D/C

游離巰基含量=B溶液測(cè)的巰基含量-A溶液測(cè)的巰基含量

二硫鍵含量/μmol/g=A溶液測(cè)的巰基含量/2

式中：73.53為摩爾消光系數(shù)；A412為除去試劑空白后樣品的吸光光度值；D為稀釋倍數(shù)；C為蛋白含量。

1.2.6 SDS-PAGE

樣品預(yù)處理：提取星油藤分離蛋白(在0.05 mol/L pH 7.0的磷酸鈉鹽緩沖環(huán)境下用0.01 mol /L 的硫酸銨提取36 h)，經(jīng)透析得到蛋白質(zhì)提取液[3-4]，4 ℃存放備用，電泳上樣之前，蛋白質(zhì)樣品以6 500 r/min高速離心15 min，取上清液加樣。

分離膠濃度12%(m/V)，濃縮膠5%(m/V)；上樣量為15 μL，恒流電泳，濃縮膠電流28 mA，分離膠電流45 mA，溴酚藍(lán)前沿至硅橡膠框底邊1.5 cm關(guān)閉電源。后用考馬斯亮藍(lán)R-250染色120 min，脫色液(甲醇/冰乙酸，體積比為3∶1)脫色至透明[3-4]，脫色后使用凝膠成像系統(tǒng)分析特征條帶。

1.3 功能性質(zhì)

1.3.1 溶解度測(cè)定

配制1% (m/V)蛋白溶液，0.1 mol/L的HCl或0.1 mol/L的NaOH調(diào)節(jié)pH 2、3、4、5、6、7、8、9、10、11，于室溫下攪拌20 min 后以4 000 r/min的速度離心分離30 min，考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定上清液中可溶性蛋白質(zhì)的含量，以上清液中的可溶性蛋白含量占樣品中總蛋白含量的百分比表示蛋白質(zhì)的溶解度。

1.3.2 起泡性及泡沫穩(wěn)定性測(cè)定

配制100 mL一定濃度樣品溶液，攪拌20 min后調(diào)節(jié)pH至7.0，勻漿機(jī)10 000 r/min攪打1 min后，迅速轉(zhuǎn)入250 mL量筒，同時(shí)用少量蒸餾水沖洗勻漿機(jī)內(nèi)壁，測(cè)泡沫體積。

分別測(cè)定t(t=0、15、30、45、60) min后泡沫剩余的體積，剩余泡沫體積越小泡沫穩(wěn)定性越差，t=0時(shí)為發(fā)泡能力。

2 結(jié)果與分析

2.1 傅里葉紅外光譜分析

圖1為星油藤原蛋白、噴霧干燥方法和真空冷凍干燥方法得到的蛋白樣品的傅里葉紅外光譜原始圖。表1可以看出，與原蛋白相比，2種干燥方法對(duì)星油藤分離蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)含量均有影響?？赡芤?yàn)檎婵绽鋬龈稍镌诘蜏貤l件下，水結(jié)冰從溶液中分離，各溶質(zhì)組分都得到了濃縮，體系中的鹽飽和沉淀，溶液 pH改變, 使蛋白質(zhì)分子發(fā)生變性, 某些維持β-折疊或無規(guī)則卷曲的多肽鏈發(fā)生了180度的反轉(zhuǎn), 形成了β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)[9-11]。噴霧干燥增加β-轉(zhuǎn)角含量至48.3%，無序結(jié)構(gòu)幾乎消失，原因可能是噴霧干燥溫度過高導(dǎo)致氫鍵斷裂，折疊結(jié)構(gòu)伸展轉(zhuǎn)變?yōu)棣?轉(zhuǎn)角，蛋白質(zhì)分子的空間構(gòu)象發(fā)生了改變。

圖1 不同干燥方式得到的星油藤蛋白紅外光譜圖

表1 酰胺Ⅰ帶擬合不同干燥方式得到的星油藤蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)組成比例/%

蛋白類型α-螺旋β-折疊β-轉(zhuǎn)角無序結(jié)構(gòu)原蛋白19.848.713.818.7噴霧干燥蛋白11.836.748.31.89冷凍干燥蛋白15.434.937.812.9

2.2 巰基、二硫鍵含量及表面疏水性分析

蛋白質(zhì)是一種良好的天然表面活性劑，蛋白質(zhì)中二硫鍵含量對(duì)結(jié)構(gòu)有著重要的影響；然而蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與其表面活性關(guān)系密切。蛋白質(zhì)二硫鍵及其巰基含量的測(cè)定對(duì)結(jié)構(gòu)與功能性質(zhì)的分析有著重要的意義。表面疏水性對(duì)蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)與其他分子間的相互作用有著很大的影響[10-13]。疏水性是指非極性物質(zhì)與極性環(huán)境(如水溶液)間的排斥力，熱力學(xué)上，代表非極性物質(zhì)溶解在水中所需的能量高低，或者該物質(zhì)在水相中自聚集的趨勢(shì)大小。在水中加入蛋白質(zhì)，單個(gè)蛋白質(zhì)分子表面疏水基團(tuán)周圍的水分子被排斥，這一部分水分子會(huì)進(jìn)行重排，以減少氫鍵的損失[12-14]。

從圖2可以看出，2種干燥方式對(duì)星油藤分離蛋白的游離巰基、二硫鍵含量及表面疏水性均有不同程度的影響。干燥后的樣品與原蛋白相比游離巰基含量有所降低；二硫鍵含量和表面疏水性均有升高；噴霧干燥的產(chǎn)品這種趨勢(shì)更明顯，二硫鍵含量從6.79 μmol/g增至12.18 μmol/g。干燥過程中的冷凍或高溫可能使蛋白去折疊造成分子伸展、氫鍵被破壞、空間構(gòu)象變化，進(jìn)而促進(jìn)巰基和二硫鍵的暴露引起巰基氧化和二硫鍵交換反應(yīng)的發(fā)生[8,10]。同時(shí)緊密的三級(jí)結(jié)構(gòu)的改變使蛋白質(zhì)分子內(nèi)部被隱藏的疏水基團(tuán)更多的暴露出來。噴霧干燥蛋白的表面疏水性大于真空冷凍干燥，是因?yàn)閲婌F干燥的瞬時(shí)高溫，導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性程度大[11-12]，而真空冷凍干燥由于條件溫和對(duì)蛋白結(jié)構(gòu)破壞較小，變性程度較小。

圖2 不同干燥方式得到星油藤蛋白的游離巰基、二硫鍵含量及表面疏水性

2.3 SDS-PAGE分析

Shridhar[4]等通過SDS-PAGE方法得到星油藤種仁蛋白的相對(duì)分子量分布在6～70 ku之間，其中主要集中在20～40 ku間。由圖3可看出干燥方法對(duì)蛋白質(zhì)分子量分布沒有產(chǎn)生影響。通過凝膠成像系統(tǒng)對(duì)圖3的特征條帶進(jìn)行分析得出星油藤分離蛋白6種亞基分離組分的相對(duì)分子質(zhì)量分別是21.18、23.97、35.71、37.89、40.82、75.72 ku；所占比例依次是13.33%、10.46%、24.53%、14.77%、14.22%、22.72%；與Shridhar等[4]的研究結(jié)果基本一致。

注：泳道S-低分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白；泳道A-噴霧干燥制備的星油藤分離蛋白；泳道B-真空冷凍干燥制備的星油藤蛋白；泳道C-原蛋白。圖3 星油藤蛋白的凝膠電泳圖

2.4 功能性質(zhì)

2.4.1 溶解度

蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)-水相互作用間平衡的熱力學(xué)表現(xiàn)形式為蛋白質(zhì)的溶解度，疏水作用和離子相互作用是影響蛋白質(zhì)溶解度的兩個(gè)主要相互作用。溶解度是蛋白質(zhì)最為基本的功能性質(zhì)，它對(duì)蛋白質(zhì)的乳化性、起泡性質(zhì)、吸水性以及膠凝作用等性質(zhì)都有影響。

圖4中2種方法干燥的蛋白質(zhì)在pH 2.0到11.0條件下溶解度隨pH的增大呈現(xiàn)先下降后升高的趨勢(shì)，在等電點(diǎn)pH 4.0時(shí)溶解度最低。因?yàn)樵诘入婞c(diǎn)附近缺乏靜電推斥作用，疏水作用導(dǎo)致蛋白質(zhì)聚集沉淀[8,10]。噴霧干燥的蛋白溶解度低于真空冷凍干燥，也可能是噴霧過程中瞬時(shí)高溫導(dǎo)致二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化進(jìn)而使卷曲的三級(jí)結(jié)構(gòu)展開，隱藏在分子內(nèi)部的疏水基團(tuán)暴露、表面疏水性提高、蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)-溶劑相互作用的平衡向前者移動(dòng)。

圖4 pH對(duì)不同干燥方式得到星油藤分離蛋白溶解度的影響

2.4.2 起泡性和泡沫穩(wěn)定性

起泡性指蛋白質(zhì)攪打生成泡沫的能力，泡沫的穩(wěn)定性是指蛋白質(zhì)處在重力和機(jī)械力下泡沫穩(wěn)定的能力。起泡性在面包、蛋糕等食品加工過程中起重要作用。圖5中顯示相同條件下真空冷凍干燥蛋白的起泡性和泡沫穩(wěn)定性均大于噴霧干燥。主要因?yàn)閲婌F干燥蛋白樣品中折疊結(jié)構(gòu)伸展，蛋白質(zhì)分子柔性降低，分子在界面上快速展開、重排和暴露疏水基團(tuán)的能力受到影響；巰基和二硫鍵交換反應(yīng)發(fā)生了廣泛的聚合作用，所形成的相對(duì)分子質(zhì)量很高的聚合物不能在起泡過程中吸附在氣水界面，氣水界面膜上的蛋白質(zhì)數(shù)量減少，不能夠支持起泡導(dǎo)致泡沫破裂，泡沫穩(wěn)定性下降[3]。二硫鍵含量的增加對(duì)于增強(qiáng)蛋白質(zhì)分子的柔性、提高起泡能力、增強(qiáng)氣泡穩(wěn)定性有一定的負(fù)面影響[15]。真空冷凍干燥樣品蛋白的二硫鍵含量少于噴霧干燥，因此得到的蛋白樣品起泡性和泡沫穩(wěn)定性較好。

圖5 不同干燥樣品泡沫穩(wěn)定性的比較

3 結(jié)論

3.1 干燥方法并沒有改變蛋白質(zhì)的分子質(zhì)量分布；噴霧干燥蛋白β-轉(zhuǎn)角含量比原蛋白高出30%，二硫鍵含量為12.18 μmol/g，大于原蛋白的二硫鍵含量。

3.2 噴霧干燥的樣品變性程度較大；真空冷凍干燥條件溫和、變性程度小，所得樣品表現(xiàn)出的溶解性質(zhì)和泡沫穩(wěn)定性均比噴霧干燥的好。

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Effect of Different Desiccant Methods on the Structure and Functional Properties of Sacha Inchi Proteins

Tian Shaojun Xia Kedong Liu Sibo Li Linya

(College of Food Science and Technology, Henan University of Technology, Zhengzhou 450001)

Sacha Inchi (PlukenetiavolubilisL.) proteins were prepared and dried through vacuum freeze-drying and spray drying, separately. Their structures and functional properties were analyzed and compared. The experimental results showed two methods had no influence on protein molecular weight distribution, but the secondary structure and hydrophobicity as well as disulfide bond content were changed. The content of β-corner wes increased by 30.0% and the disordered structure wes nearly disappeared through spray drying, while the disulfide bond wes increased from 6.79 μmol/g to 12.18 μmol/g compared with original protein. The proteins obtained from vacuum freeze-drying presented less degeneration degree, and better solubility and foaming ability than those via spray drying.

spray drying, vacuum freeze-drying, hydrophobicity, SDS-PAGE.

河南省高?？萍紕?chuàng)新團(tuán)隊(duì)支持計(jì)劃(13IRTSTHN028)

2015-07-03

田少君，女，1964年出生，教授，蛋白質(zhì)科學(xué)與工程

TS 210.1

A

1003-0174(2017)02-0057-05