林開秀，阮艷秋

(1．四川省自貢市中醫(yī)醫(yī)院檢驗(yàn)科，四川 自貢 643010;2．四川省自貢市第一人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，四川 自貢 643000)

陰道分泌物念珠菌感染三種檢測(cè)方法比較分析

林開秀1，阮艷秋2

(1．四川省自貢市中醫(yī)醫(yī)院檢驗(yàn)科，四川 自貢 643010;2．四川省自貢市第一人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，四川 自貢 643000)

目的 探討三種檢測(cè)方法對(duì)陰道分泌物真菌檢測(cè)結(jié)果的差異。方法收集鏡檢陰道分泌物真菌陽(yáng)性和陰性標(biāo)本各200例，用PCR技術(shù)鑒定其念珠菌類型，再隨機(jī)選擇熒光PCR核酸檢測(cè)結(jié)果陽(yáng)性標(biāo)本30例進(jìn)行真菌微生物培養(yǎng)，驗(yàn)證分型結(jié)果的正確率。結(jié)果常規(guī)鏡檢陽(yáng)性200例，熒光PCR核酸檢測(cè)鑒定陽(yáng)性189例，其中白色念珠菌157例(78.5%)，光滑假絲酵母菌24例(12%)，熱帶假絲酵母菌6例(3%)，白念合并光滑酵母菌2例(1%)，其他真菌11例(5.5%)。常規(guī)鏡檢陰性200例，熒光PCR核酸檢測(cè)鑒定陽(yáng)性58例，其中白色念珠菌50例，光滑假絲酵母菌6例，熱帶假絲酵母菌2例;隨機(jī)選擇熒光PCR核酸檢測(cè)結(jié)果陽(yáng)性標(biāo)本30例真菌培養(yǎng)結(jié)果吻合率97%。結(jié)論門診常規(guī)檢驗(yàn)中，真菌涂片鏡檢應(yīng)為首選。對(duì)于門診鏡檢陰性而又有臨床癥狀的患者，建議進(jìn)行分子生物學(xué)基因鑒定。鏡檢和分子生物學(xué)方法可以相互補(bǔ)充，但應(yīng)以分子生物學(xué)方法為標(biāo)準(zhǔn)。

陰道分泌物;真菌性陰道炎;熒光PCR核酸檢測(cè);白色念珠菌;光滑念珠菌;熱帶念珠菌

陰道炎是婦科病的常見病之一，可由念珠菌、陰道細(xì)菌、陰道滴蟲等不同原因引起，其中根據(jù)Ries和Rajalakshmi報(bào)道，由念珠菌引起的陰道炎占陰道炎總數(shù)的20%～45%，細(xì)菌引起的陰道炎占陰道炎總數(shù)的30%～50%，陰道滴蟲感染占10%～30%，混合感染占 15% ～20%［1，2］。據(jù) Nwokolo 報(bào)道，估計(jì)有75%的女性一生中至少經(jīng)歷過(guò)一次念珠菌性陰道炎發(fā)作［3］。隨著廣譜抗生素的使用，以及免疫功能低下患者的增加，女性患念珠菌性陰道炎的患病率也在增加［4，5］。目前，陰道分泌物真菌檢查主要通過(guò)用生理鹽水拭子取陰道分泌物涂片鏡檢而得。但有時(shí)患者臨床癥狀與鏡檢結(jié)果不符，有可能誤導(dǎo)臨床醫(yī)生作出準(zhǔn)確判斷。而陰道分泌物真菌培養(yǎng)鑒定結(jié)果至少5～7天才能出具完整的培養(yǎng)報(bào)告，對(duì)于臨床門診患者治療的及時(shí)性大打折扣，因此，亟需將分子擴(kuò)增技術(shù)應(yīng)用于檢測(cè)和鑒定真菌性陰道炎。熒光聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)核酸擴(kuò)增技術(shù)作為一項(xiàng)先進(jìn)的分子生物學(xué)檢測(cè)方法，已廣泛應(yīng)用于微生物的快速準(zhǔn)確檢驗(yàn)中［6］。為此，我們收集400份門診常規(guī)鏡檢陰道分泌物進(jìn)行熒光PCR核酸檢測(cè)基因分型和CHROMAgar念珠菌顯色培養(yǎng)基培養(yǎng)分型，并將三者的結(jié)果進(jìn)行比較分析，了解真菌性陰道炎感染常見的真菌類型，并探討念珠菌性陰道炎快速鑒定的分型的實(shí)驗(yàn)方法。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象選擇2015～2016年在自貢市中醫(yī)醫(yī)院就診陰道炎患者的陰道分泌物，常規(guī)鏡檢真菌陽(yáng)性(找到典型芽孢和假菌絲者，或白細(xì)胞較多可疑者)標(biāo)本200例，同時(shí)選擇鏡檢霉菌陰性(白細(xì)胞較多，細(xì)菌陰性)的標(biāo)本200例。陰道分泌物樣本由本院婦產(chǎn)科醫(yī)生采集，常規(guī)消毒患者外陰部后暴露宮頸，用無(wú)菌棉拭子插入宮頸內(nèi)1～2 cm處旋轉(zhuǎn)2～3周，停留片刻后取出含柱狀上皮細(xì)胞的標(biāo)本，放入含2 ml生理鹽水的采樣管后密封，立即送檢。

1.2 儀器與試劑①主要儀器:高速低溫離心機(jī)(貝克曼 Microfuge 22R)，恒溫金屬浴(杭州博日HB-100)，熒光定量PCR儀(ABI 7500序列檢測(cè)分析儀)。②試劑:白色念珠菌、光滑假絲酵母菌、熱帶假絲酵母菌核酸檢測(cè)試劑盒均采用泰普生物科學(xué)(TIB)提供的試劑。CHROMAgar念珠菌顯色培養(yǎng)基購(gòu)置于廣州益滿生物科技公司。

1.3 試驗(yàn)方法①熒光PCR核酸檢測(cè):按照試劑說(shuō)明書要求進(jìn)行陰道分泌物DNA提取，并分別加入5 μl于已配制好的白色念珠菌、光滑假絲酵母菌、熱帶假絲酵母菌核酸檢特異性Taqman探針PCR反應(yīng)液管中，對(duì)分泌物中的DNA片段進(jìn)行檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)時(shí)嚴(yán)格按照SOP文件操作，分析數(shù)據(jù)，得出結(jié)果并上機(jī)。②常規(guī)鏡檢法:按照《全國(guó)臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程(第4版)》的規(guī)范要求，將陰道分泌物涂抹于滴有生理鹽水的載玻片上，置于顯微鏡下進(jìn)行陰道分泌物常規(guī)檢查，滴加5%NaOH兩滴，觀察有無(wú)霉菌孢子和(或)假菌絲，若觀察到為陽(yáng)性結(jié)果。③CHROMAgar念珠菌顯色培養(yǎng)基培養(yǎng)鑒定:取30份熒光PCR核酸檢測(cè)陽(yáng)性的樣本接種于沙保羅培養(yǎng)基培養(yǎng) 24～48小時(shí)后，挑單個(gè)菌落，接種于CHROMAgar念珠菌顯色培養(yǎng)基上35℃培養(yǎng)24～48小時(shí)，根據(jù)顏色變化進(jìn)行結(jié)果判定。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件處理數(shù)據(jù)。計(jì)數(shù)資料比較采用卡方檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 常規(guī)鏡檢與熒光PCR核酸檢測(cè)法檢測(cè)結(jié)果比較有58例鏡檢陰性而熒光PCR核酸檢測(cè)為陽(yáng)性;11例鏡檢陽(yáng)性而熒光PCR核酸檢測(cè)為陰性。兩種方法檢測(cè)結(jié)果比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=181.64，P ＜ 0.05)。見表1。

表1 常規(guī)鏡檢與熒光PCR核酸檢測(cè)法檢測(cè)結(jié)果比較 (n)

2.2 熒光PCR核酸檢測(cè)真菌鑒定結(jié)果在200例常規(guī)鏡檢陽(yáng)性的標(biāo)本中，通過(guò)PCR核酸擴(kuò)增檢測(cè)得到引起真菌性陰道炎的真菌，白色念珠菌157例(78.5%)，光滑假絲酵母菌24例(12%)，熱帶假絲酵母菌6例(3%)，白色念珠菌合并光滑假絲酵母菌2例(1%)，其他真菌11例(5.5%)。常規(guī)鏡檢陰性200例，熒光PCR核酸檢測(cè)鑒定陽(yáng)性共計(jì)58例，其中白色念珠菌50例(86.2%)，光滑假絲酵母菌6例(10.3%)，熱帶假絲酵母菌2例(3.5%);可見真菌性陰道炎主要致病菌為白色念珠菌。

2.3 熒光PCR核酸檢測(cè)與CHROMAgar快速顯色法真菌分型結(jié)果比較30份樣本中，有1份樣本經(jīng)熒光PCR核酸檢測(cè)法測(cè)出為光滑念珠菌感染而CHROMAgar快速顯色法未鑒定出，兩種方法檢驗(yàn)結(jié)果差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，見表2。

表2 熒光PCR和CHROMAgar快速顯色法檢測(cè)結(jié)果比較 (n)

3 討論

目前，臨床上由真菌引起的陰道炎稱為念珠菌性陰道炎或霉菌性陰道炎，是一種困擾女性的常見的婦科疾?。?］。由寄生于腸道的假絲酵母菌(又稱念珠菌)感染所致。據(jù)統(tǒng)計(jì)，念珠菌屬感染已成為引起陰道感染的第二大病因，發(fā)病僅次于細(xì)菌性陰道炎［8］。典型的陰道分泌物呈白色黏稠厚豆渣樣，涂片在顯微鏡下易找到孢子和假菌絲，結(jié)合臨床表現(xiàn)，不難診斷。但有些病例臨床癥狀與鏡檢不符，本研究有58例涂片檢查陰性樣本，在改用熒光PCR核酸檢測(cè)方法后，得到了陽(yáng)性結(jié)果，這說(shuō)明常規(guī)鏡檢可能會(huì)導(dǎo)致部分真菌性陰道炎患者漏檢，故對(duì)于有臨床癥狀而鏡檢未查見真菌的患者，應(yīng)通過(guò)PCR核酸擴(kuò)增或經(jīng)過(guò)真菌培養(yǎng)進(jìn)行診斷。

近年來(lái)，隨著抗真菌藥物的臨床應(yīng)用，特別是耐藥菌株的出現(xiàn)，念珠菌陰道炎的致病菌菌譜發(fā)生了較大的變化。這些念珠菌使用傳統(tǒng)方法鑒別比較困難且耗時(shí)，因此有必要將念珠菌陰道炎的念珠菌菌種進(jìn)行快速有效區(qū)分。本研究發(fā)現(xiàn)白念珠菌是引起念珠菌性陰道炎的主要菌種(占78.5%)，光滑念珠菌次之(占24%)，這與Martens報(bào)道的數(shù)據(jù)相近［9］。目前念珠菌陰道炎診斷的檢測(cè)方法主要還是顯微鏡鏡檢結(jié)合微生物真菌培養(yǎng)，CHROMAgar快速顯色法可用于念珠菌分離和鑒定，其優(yōu)點(diǎn)是使用方便，缺點(diǎn)是且檢查過(guò)程較為費(fèi)時(shí)，并且手工通過(guò)沙堡培養(yǎng)基培養(yǎng)，容易遺漏對(duì)念珠菌的診斷［10］。本研究采用熒光PCR核酸檢測(cè)直接將陰道炎分泌物提取DNA進(jìn)行檢測(cè)，與CHROMAgar顯色培養(yǎng)法對(duì)照，檢測(cè)結(jié)果差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，從而證明了PCR方法的準(zhǔn)確性。而PCR核酸擴(kuò)增檢測(cè)不使用菌落培養(yǎng)，節(jié)省念珠菌培養(yǎng)所需的1～2天時(shí)間，并且可一次鑒定出常見的致病念珠菌(白念珠菌和光滑念珠菌、熱帶念珠菌等菌種)，從而有利于顯著縮短診斷周期，節(jié)約時(shí)間并能準(zhǔn)確地診斷念珠菌陰道炎。這對(duì)于減輕患者痛苦，提高治療效果起到十分重要的作用，將會(huì)為念珠菌的快速鑒別診斷贏得時(shí)間，具有很重要的實(shí)用性。

本研究中有11例樣本鏡檢陽(yáng)性而熒光PCR核酸檢測(cè)卻為陰性，經(jīng)分析標(biāo)本來(lái)源及檢測(cè)方法，可能是由于該11例樣本所感染的真菌并非本研究PCR檢測(cè)的三種真菌，使得鏡檢和PCR核酸擴(kuò)增檢測(cè)結(jié)果不一致，因此，兩種方法結(jié)果可以互為補(bǔ)充。

本研究中有2例樣本查出白色念珠菌和光滑念珠菌混合感染，原因可能為:①患者的確為兩種念珠菌混合感染;念珠菌本是人體正常菌群之一，但其與陰道內(nèi)其他正常菌相互制約的平衡被打破，可能導(dǎo)致陰道念珠菌病的發(fā)生［7］。②樣本污染了白色念珠菌或光滑念珠菌。故應(yīng)結(jié)合患者的具體病史和臨床癥狀和體征進(jìn)行分析，必要時(shí)重新采樣進(jìn)行。

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Comparative analysis of three-types of methods for detection of vaginal Candida infection

LIN Kai-xiu1，RUAN Yan-qiu2(1．Clinical Laboratory，Zigong Traditional Chinese Medicine Hospital，Zigong 643010，China;2．Clinical Laboratory，Zigong First People's Hospital，Zigong 643000，China)

RUAN Yan-qiu

Objective To compare the differences in detection of Candida infection in vaginal secretion by using 3 types of methods．MethodsWe collected 200 Candida positive and 200 negative vaginal secretion specimens from routine microscopic examination，respectively．The Candida types were identified with PCR technique．Then，we randomly selected 30 PCR positive samples for fungal microorganisms'culture to demonstrate the accuracy of classification results．ResultsOf the 200 microscopic positive samples，189 samples were identified as positive by using fluorescence PCR method．In these of fluorescence PCR positive samples，157 were Candida albicans(78.5%)，24 were Smooth candida yeast(12%)，6 were Candida tropicalis(3%)and 2 samples were combined Candida albicans and Smooth candida yeast．There were 11 cases with other fungus(5.5%)．Of the 200 microscopy negative samples，58 sampleswere identified as positive in which 50 were Candida albicans，6 were Smooth candida yeast and 2 were Candida tropicalis．In the randomly selection of 30 fluorescent PCR positive samples，the coincidence rate with fungal culture results was 97%．ConclusionIn the routine clinic examination，microscopic examination of fungal pictures should be the first choice．At the same time，for outpatient with microscopy negative but has clinical symptoms，it is recommended to do molecular biology gene identification．Microscopic examination and molecular biological methods can be complementary but molecular method should be used as standard．

Vaginal secretions;Fungal vaginitis;Fluorescence PCR nucleic acid detection;Candida albicans;Candida glabrata;Candida tropicalis

R37;R446.5

A

1672-6170(2017)04-0212-03

2017-01-12;

2017-03-24)

阮艷秋