肖紅衛(wèi) 鄭新民

（湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所/動(dòng)物胚胎工程及分子育種湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北武漢430064）

轉(zhuǎn)基因豬育種中的小鼠模型

肖紅衛(wèi) 鄭新民*

（湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所/動(dòng)物胚胎工程及分子育種湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北武漢430064）

本研究旨在研究轉(zhuǎn)基因豬育種中的小鼠模型，探討轉(zhuǎn)基因小鼠傳代中可能出現(xiàn)的情況，為轉(zhuǎn)基因豬育種工作提供參考。選用昆明小白鼠制作轉(zhuǎn)基因小鼠，然后進(jìn)行轉(zhuǎn)基因小鼠的傳代，并對(duì)小鼠進(jìn)行檢測(cè)，統(tǒng)計(jì)轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性小鼠的數(shù)量，研究轉(zhuǎn)基因小鼠傳代過(guò)程中陽(yáng)性率的變化以及轉(zhuǎn)基因個(gè)體的選擇、表型分析、性狀分析、育種規(guī)劃以及育種中的線性模型分析。結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因所得的首建陽(yáng)性小鼠的比例為2.3%，轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性小鼠與野生型交配傳代時(shí)陽(yáng)性后代的比例為50%左右；結(jié)果提示，原核顯微注射法制作的轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性個(gè)體在傳代過(guò)程中，后代的比例不會(huì)超過(guò)50%。該結(jié)果將直接用于指導(dǎo)轉(zhuǎn)基因豬的育種工作，即在轉(zhuǎn)基因豬育種中要加強(qiáng)選擇。

轉(zhuǎn)基因豬；育種；小鼠模型

自從1908年Nilsson-Ehle提出微效多基因假說(shuō)（multiple-factor hypothesis）[1]以及1941年Lush[2]提出遺傳力概念后，育種學(xué)擁有了合理的內(nèi)核。20世紀(jì)60年代到70年代，隨著計(jì)算機(jī)的普及以及在動(dòng)物育種上的應(yīng)用，數(shù)量遺傳學(xué)及其相應(yīng)的育種學(xué)進(jìn)入高速發(fā)展時(shí)期。然而正是由于計(jì)算機(jī)的應(yīng)用使得育種規(guī)模越來(lái)越大，限制了其潛力的發(fā)揮。

轉(zhuǎn)基因動(dòng)物技術(shù)，開(kāi)辟了在短期內(nèi)直接改造生物遺傳性的新天地，使以幾十年為進(jìn)化單位的常規(guī)育種縮短到幾年，能將生物種屬間不可逾越的鴻溝徹底填平，并可賦予群體特定的性狀，因此在育種上具有巨大的潛能。

育種——原意是培育新品種，但是由于親本枯竭，新品種培育理論研究陷于停滯，雜種優(yōu)勢(shì)的應(yīng)用和理論研究發(fā)展緩慢，育種學(xué)家轉(zhuǎn)而研究雜種優(yōu)勢(shì)利用，但進(jìn)展緩慢，于是部分科學(xué)家把目光集中到轉(zhuǎn)基因動(dòng)物育種上來(lái)[3-6]。由于轉(zhuǎn)基因豬的制作成本太大，轉(zhuǎn)基因豬的育種工作具有長(zhǎng)期性，因此，我們?cè)趩?dòng)轉(zhuǎn)基因豬育種的同時(shí)，還開(kāi)展以轉(zhuǎn)基因小鼠為育種模型的研究，以期為轉(zhuǎn)基因豬育種工作提供參考。

1 材料和方法

以前期所做9種基因（pOMT-PGH、hDAF、pBHSA、pSHSA、PT-HBV 1.3、Bcl-xL、hCD59、GFP、hCD59+MCP）的轉(zhuǎn)基因小鼠傳代數(shù)據(jù)為研究對(duì)象，研究轉(zhuǎn)基因小鼠傳代過(guò)程中陽(yáng)性率的變化以及轉(zhuǎn)基因個(gè)體的選擇、表型分析、性狀分析、育種規(guī)劃以及育種中的線性模型分析。

表1 轉(zhuǎn)基因小鼠陽(yáng)性率

2 結(jié)果及分析

2.1 原核顯微注射所得后代陽(yáng)性率的檢測(cè)結(jié)果

結(jié)果見(jiàn)表1。

2.2 轉(zhuǎn)基因小鼠的遺傳規(guī)律

將4只原代轉(zhuǎn)Bcl-xL基因小鼠分別與野生型小鼠交配傳代[7]，用PCR和Southern雜交確認(rèn)后代中的轉(zhuǎn)基因小鼠；后代中的陽(yáng)性小鼠再與野生型小鼠交配傳代。依此方式傳至第五代。各世代轉(zhuǎn)基因小鼠的比例如表2。

表2 轉(zhuǎn)BcL-xL基因小鼠各世代的比例 （%）

10號(hào)陽(yáng)性鼠經(jīng)過(guò)選擇后的后代，陽(yáng)性率維持在50%左右，與孟德?tīng)栠z傳的理論值相符，表明外源基因已經(jīng)整合在小鼠兩條染色體中的一條上，且遺傳是穩(wěn)定的；而其他3只小鼠，隨著世代的增加，陽(yáng)性率呈下降趨勢(shì)，表明外源基因在傳代中有丟失現(xiàn)象。

2.3 演化

Fisher曾證明，88.7%的新生基因在無(wú)任何壓力影響下，只是隨機(jī)影響，15代以內(nèi)不可避免地消失。消失的極限概率為1，保留的極限概率為0[8]。因此，在轉(zhuǎn)基因育種上，我們也要進(jìn)行選擇，否則所得到的轉(zhuǎn)基因個(gè)體（突變體）也會(huì)消失。

演化的模型為：

G0代轉(zhuǎn)基因純合子個(gè)體第n代后代中的陽(yáng)性個(gè)體比例為：

G0代轉(zhuǎn)基因雜合子個(gè)體第n代后代中的陽(yáng)性個(gè)體比例為：

2.4 選擇

2.4.1 表型選擇

采用表型選擇的方法育成一個(gè)純種群（p=99.96%即視為成功構(gòu)建純種群）需要的代數(shù)是：

小鼠的世代間隔是9周齡（6周齡性成熟，妊娠期3周），育成一個(gè)純種群需要經(jīng)過(guò)49×（9/52）=8.5年。

2.4.2 測(cè)交法選擇純合子種畜留種的方法

采用測(cè)交法選擇純合子公畜留種的方法育成一個(gè)純種群（p=99.96%即視為成功構(gòu)建純種群）需要的代數(shù)是：

小鼠的世代間隔是9周齡（6周齡性成熟，妊娠期3周），育成一個(gè)純種群至少需要經(jīng)過(guò)6×（9/52）=1年。

2.4.3 染色體熒光原位雜交法選擇純合子種畜留種的方法

DDS產(chǎn)生的信號(hào)，經(jīng)過(guò)放大才能在示波器上顯示完整而穩(wěn)定的波形。信號(hào)放大模塊采用的是NE5532芯片[9]。其引腳圖如圖7所示。1引腳、7引腳為輸出引腳；2引腳、6引腳為反相輸入引腳；3引腳、5引腳是同相輸入引腳；4引腳、8引腳分別是負(fù)電源和正電源引腳。

在獲得轉(zhuǎn)基因動(dòng)物個(gè)體之后，用染色體熒光原位雜交法可以在一周內(nèi)鑒定出所測(cè)個(gè)體是否為純合子，節(jié)約了測(cè)交的時(shí)間。

綜上，在選擇時(shí)應(yīng)該采用染色體熒光原位雜交法選擇純合子的方法，可以節(jié)約大量的培育時(shí)間。

2.5 表型值剖分

轉(zhuǎn)基因研究中的目的是通過(guò)外源基因的表達(dá)從而使個(gè)體產(chǎn)生一個(gè)表型，如該表型為個(gè)體基因與外源基因所貢獻(xiàn)，則研究人員需要對(duì)表型值進(jìn)行剖分。

上述9種轉(zhuǎn)基因小鼠研究的目的是通過(guò)外源基因的表達(dá)從而使小鼠產(chǎn)生一個(gè)有別于自身現(xiàn)有的表型，該表型全部為外源基因所貢獻(xiàn)，因此，研究人員不需要對(duì)該表型值進(jìn)行剖分。

2.5.1 基因型與群體均值的關(guān)系

小鼠獲得的外源基因就是小鼠的基因型，其特點(diǎn)是表型決定于基因型，偏離群體均值以上的部分就是外源基因的貢獻(xiàn)。

2.5.2 基因的平均效應(yīng)

將外源基因以隨機(jī)方式與群體的基因（或基因樣本）相結(jié)合而形成的合子的平均基因型值對(duì)群體平均值的離差，就是該基因在特定群體中的平均效應(yīng)。

2.5.3 基因取代的平均效應(yīng)

如果以一個(gè)等位基因（A1）隨機(jī)取代另一個(gè)等位基因（A2）所產(chǎn)生的基因型值變化，稱(chēng)為基因取代的平均效應(yīng)。被取代的等位基因來(lái)自純合子和雜合子的概率。

2.5.4 基因取代的平均效應(yīng)與基因平均效應(yīng)的直接轉(zhuǎn)換

基因取代的平均效應(yīng)是取代基因的平均效應(yīng)與被取代基因頻率之比，也是被取代基因平均效應(yīng)與取代基因頻率之比的負(fù)值。

2.5.5 關(guān)于育種值的群體遺傳學(xué)分析

個(gè)體育種值是個(gè)體所有位點(diǎn)全部基因的平均效應(yīng)之和，對(duì)于轉(zhuǎn)基因動(dòng)物而言，主要是考察外源基因的效應(yīng)。育種值具備世代連續(xù)性：個(gè)體傳遞給后代的是基因而不是基因型，只有基因決定的加性效應(yīng)即育種值是聯(lián)系世代的唯一能夠穩(wěn)定遺傳的成分。

2.6 來(lái)自轉(zhuǎn)基因性狀的遺傳參數(shù)

由于大部分轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中的目的性狀是質(zhì)量性狀，因此，其遺傳參數(shù)是0或者1。如果轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的目的性狀是數(shù)量性狀，并且針對(duì)外源基因進(jìn)行選擇，那么其遺傳參數(shù)還是0或者1。

2.7 育種規(guī)劃

在轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性動(dòng)物中并不全部為純合子，雜合子也表現(xiàn)為陽(yáng)性，而且在雜合子的后代中會(huì)出現(xiàn)野生型的后代，因此在育種開(kāi)始之前所用的親本育種素材必須全部是純合子[10]。

2.8 畜禽育種中的線性模型

常規(guī)育種所用的模型多能用數(shù)學(xué)方程式來(lái)表達(dá)，數(shù)學(xué)期望、方差以及協(xié)方差可以描述，可以假設(shè)及約束條件[11]。而轉(zhuǎn)基因育種時(shí)首要選擇的是質(zhì)量性狀即表達(dá)了外源基因的個(gè)體，淘汰沒(méi)有表達(dá)外源基因的個(gè)體。在完成外源基因在染色體上的純合后，可以借鑒常規(guī)育種中所用的線性模型。

3 討論

當(dāng)今的動(dòng)物育種科學(xué)已經(jīng)從過(guò)去的表型育種、雜交育種進(jìn)入到分子育種或基因工程育種的新階段。轉(zhuǎn)基因動(dòng)物育種與傳統(tǒng)的動(dòng)物育種相比，因其在改良動(dòng)物遺傳特性、提高其經(jīng)濟(jì)性狀等上面所需要的時(shí)間短，就成為動(dòng)物分子育種學(xué)的重要研究?jī)?nèi)容之一。然而，轉(zhuǎn)基因育種與常規(guī)育種存在巨大的分歧，并隨著研究的深入逐漸顯示出來(lái)。

3.1 常規(guī)育種

目前，在商品豬生產(chǎn)上利用的是豬的雜交優(yōu)勢(shì)，在育種上是培育有特色經(jīng)濟(jì)性狀的品系，然后篩選配合力高的組合，雜種后代性狀突出、體型又符合主流育種界認(rèn)可就可以推向市場(chǎng)[3]。在經(jīng)過(guò)幾個(gè)世代之后，所用的品種會(huì)逐漸退化。

3.2 轉(zhuǎn)基因育種

轉(zhuǎn)基因豬育種工作既要考慮外源基因在后代的傳遞，又要考慮不同組合間的配合力。在早期的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物研究中，我們發(fā)現(xiàn)外源基因的整合發(fā)生在二細(xì)胞胚胎后期，會(huì)產(chǎn)生嵌合體的現(xiàn)象，導(dǎo)致出現(xiàn)外源基因不能穩(wěn)定遺傳的現(xiàn)象。且G0代與野生型交配傳代到F1代時(shí)所有個(gè)體中陽(yáng)性個(gè)體的比例是50%或100%，F(xiàn)1代陽(yáng)性個(gè)體與野生型交配傳代到F2代時(shí)所有個(gè)體中陽(yáng)性個(gè)體的比例是25%，F(xiàn)2代陽(yáng)性個(gè)體與野生型交配傳代到F3代時(shí)所有個(gè)體中陽(yáng)性個(gè)體的比例是12.5%。即外源基因在G0代陽(yáng)性個(gè)體后代中的比例是遞減的，這個(gè)發(fā)現(xiàn)使轉(zhuǎn)基因動(dòng)物育種有別于常規(guī)育種，即在做轉(zhuǎn)基因育種研究時(shí)必須先得到純合的G0代轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，之后還要考慮不同血統(tǒng)的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物存在。

[1]Nilsson-Ehle H.Einige Ergebnisse von Krenzunger bei Hafer und Weizen[J].Bot.Notiser,1908:257-294.

[2]Lush JL.Intra-sire correlations or regressions of offspring on dam as a method of estimating heritability of characteristics[J]. Proc Am Soc Anim Prod,1940,33:293-301.

[3]劉震乙.家畜育種學(xué)[M].北京:中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社,1981: 66-77.

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[5]肖紅衛(wèi),華文君,張立蘋(píng),等,轉(zhuǎn)基因動(dòng)物技術(shù)及其在動(dòng)物育種中的應(yīng)用[J].中國(guó)豬業(yè),2016(4):57-59.

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Mice Model in Transgenic Pig Breeding

XIAO HongweiZHENG Xinmin
(Institute of Animal Husbandry and Veterinary/Hubei Key Laboratory of Animal Embryo and Molecular Breeding,Hubei Academy of A-griculture Sciences,Wuhan 430064,China)

This study was focused on the transgenic mouse model for transgenic pig breeding and to explore the possible occurrence of transgenic mice which will provide reference for the transgenic pig breeding.The transgenic mice were made from Kunming mice,and the transgenic mice were passaged.The positive offspring number of transgenic mice,the change of positive rate in the passage of transgenic mice,the selection of individual gene, phenotype analysis,character analysis,breeding program and linear model analysis in breeding were discussed. The results showed that the G0 transgenic mice is 2.3%and the positive offspring by mating G0 transgenic mice with wild type mice were about 50%.The results suggested that the proportion of offspring during passage of transgenic positive individuals by pronuclear microinjection was no more than 50%.The results will be used directly to guide the breeding of transgenic pigs and to strengthen selection in transgenic pig breeding.

Transgenic pig;breeding;mice model

*通訊作者：鄭新民（1960-），男，漢族，陜西渭南人，研究員，主要從事動(dòng)物生物技術(shù)研究，E-mail：anbit20＠163.com

S813.2

1673-4645(2017)07-0044-04

2017-06-08

轉(zhuǎn)基因生物新品種培育重大專(zhuān)項(xiàng)（2016ZX08010003-006），湖北省農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新中心（2017-620-004-001），湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院青年基金（2016NKYJJ19），湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院競(jìng)爭(zhēng)性項(xiàng)目（2016jzxjh013），湖北省技術(shù)創(chuàng)新專(zhuān)項(xiàng)重大項(xiàng)目（2016ABA117）

肖紅衛(wèi)（1979-），男，漢族，江蘇鹽城人，碩士，助理研究員，主要從事轉(zhuǎn)基因豬遺傳繁育研究，E-mail：xiaohongwei2003＠163.com