李曉娜，汪曉筠，朱艷媚，曹成珠，楊春燕，嚴(yán)云飛，趙延禮，李生花

(青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部生理學(xué)教研室，青海 西寧 810016)

鹽酸川芎嗪通過干預(yù)GABAR和FOXP2的表達(dá)保護(hù)低壓低氧大鼠學(xué)習(xí)記憶

李曉娜，汪曉筠，朱艷媚，曹成珠，楊春燕，嚴(yán)云飛，趙延禮，李生花

(青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部生理學(xué)教研室，青海 西寧 810016)

目的探討鹽酸川芎嗪對低壓低氧大鼠學(xué)習(xí)記憶功能的影響及其作用機制。方法將120只SD大鼠隨機分為2組，低氧對照組(5 500 m)、低氧藥物組(5 500 m)，按時間段不同又分為1 d、3 d、7 d、15 d、30 d組，每組12只；對照組和藥物組在模擬海拔5500 m的低壓氧倉造模，對照組腹腔注射生理鹽水，藥物組用同樣的方法注射鹽酸川芎嗪進(jìn)行干預(yù)。用Morris水迷宮實驗檢測大鼠行為學(xué)變化；Western blot檢測大鼠海馬GABAAα1R、GABAB1R、FOXP2表達(dá)情況。結(jié)果① 通過計算對照組和藥物組定位航行實驗中的總路程和穿越平臺次數(shù)可以得出，兩組1 d結(jié)果差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，從3 d組開始，藥物組總路程較對照組逐漸縮短(P<0.01)，而穿越中心平臺次數(shù)較對照組逐漸增多(P<0.01)；② Western blot檢測海馬GABAAα1R受體，不同時間段對照組與藥物組海馬中該受體表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；GABAB1R受體和FOXP2蛋白，1 d對照組藥物組表達(dá)沒有差異，從3 d組開始，對照組該受體和蛋白表達(dá)量均低于藥物組(P<0.05)；③ 對照組海馬中GABAB1R與水迷宮總路程呈負(fù)相關(guān)(r=-0.738，P<0.05)；對照組海馬中FOXP2蛋白與水迷宮總路程呈負(fù)相關(guān)(r=-0.693，P<0.05)；對照組海馬中GABAB1R、FOXP2蛋白表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.834，P<0.05)。結(jié)論鹽酸川芎嗪對低壓低氧大腦學(xué)習(xí)記憶能力起到一定的保護(hù)作用，其機制可能與增加大鼠腦內(nèi)遞質(zhì)GABAB1R和蛋白FOXP2表達(dá)量有關(guān)。

鹽酸川芎嗪；低壓低氧；海馬；水迷宮；學(xué)習(xí)記憶；GABAR；FOXP2

隨著高原地區(qū)資源的開發(fā)和旅游業(yè)的發(fā)展，長期或短期進(jìn)入高原地區(qū)的人群與日俱增，由于對高原高寒、低壓、低氧等環(huán)境的不適應(yīng)，將造成機體急性供氧不足，氧的利用受阻，就會產(chǎn)生急、慢性缺氧反應(yīng)，其中腦是最易受到影響的器官之一，特別是大腦的認(rèn)知功能[1-2]。Morris水迷宮(Morris water mase, MWM)是英國心理學(xué)家 Morris于20世紀(jì)80年代初設(shè)計，近年來在神經(jīng)行為學(xué)研究中得到廣泛應(yīng)用[3]，通過對該方法中得到的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析以后，可以對影響行為神經(jīng)效果的相關(guān)藥物做出評價。近年來，隨著腦科學(xué)計劃的提出，低壓低氧條件對學(xué)習(xí)記憶能力影響的研究頗受關(guān)注。川芎嗪(tetramethylpyrazine，TMP)是從傘形科藁本屬植物川芎中分離提純的生物堿單體，主要用于腦供血不全、腦栓塞等疾病，它具有改善循環(huán)、保護(hù)大腦的作用，還可以用于治療由于缺血缺氧引起的腦部疾病[4]。γ-氨基丁酸(gamma aminobutyric acid, GABA)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的一種抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，在大腦海馬、皮質(zhì)等部位都有分布，主要通過與其相應(yīng)的受體結(jié)合而產(chǎn)生作用。GABA受體具有3種亞型，分別為離子型受體GABAR-A、GABAR-C，代謝型受體GABAR-B。其中，GABAR-A、GABAR-B主要分布在海馬、皮質(zhì)等部位，與大腦的認(rèn)知功能相關(guān)[5]。它們又包含不同的亞基，其中GABAA受體α1亞單位在各腦組織表達(dá)強度依次是：海馬、大腦皮質(zhì)等，而GABAB受體存在2種亞型B1和B2，研究發(fā)現(xiàn)B1在大腦認(rèn)知過程中發(fā)揮著很重要的作用。叉頭框蛋白P2(forkhead box P2，F(xiàn)OXP2)是一種與口面部協(xié)調(diào)、學(xué)習(xí)記憶功能有密切聯(lián)系的轉(zhuǎn)錄因子[6]。本文就低壓低氧大鼠經(jīng)過TMP干預(yù)后，通過用水迷宮行為學(xué)中的定位航行實驗，研究其對低壓低氧大鼠學(xué)習(xí)記憶功能的影響，應(yīng)用Western blot方法檢測GABAAα1R、GABAB1R受體和FOXP2表達(dá)情況，為臨床治療缺血缺氧性腦疾病提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1儀器與試劑低氧實驗組選擇在青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院高原醫(yī)學(xué)研究中心低壓氧艙(中航風(fēng)雷，DXY-3000)進(jìn)行模擬；Morris水迷宮采用中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所DMS-2。RIPA、PMSF、轉(zhuǎn)膜液、電泳液，均購自Solarbio；蛋白酶抑制劑，購自羅氏；BCA蛋白定量試劑盒、Marker，購自Thermo；PVDF膜購自Millipore；GABAAα1R(ab33299)、GABAB1R(ab131417)、FOXP2(ab16046)、β-actin(ab8227)的抗體，均購自Abcam；電泳儀、電泳槽、ECL發(fā)光液等，購自Bio-Rad。

1.2實驗動物及分組實驗中所用動物為SPF級健康♂ Sprague Dawley大鼠[SCXK(陜)2012-003，購自西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)實驗動物中心]120只，10～12周齡，體質(zhì)量(210±40)g，隨機分為2組：低氧對照組和低氧藥物組(模擬海拔5 500 m)，并且將低氧組又按照時間不同，分為1 d、3 d、7 d、15 d、30 d組，每組12只。

1.3模擬低壓低氧條件將用于模擬低壓低氧條件的大鼠置于低壓氧艙內(nèi)，以2 m·s-1的速度升至模擬海拔5 500 m，艙內(nèi)溫度(22±2)℃，濕度50%～60%，采用慢性低壓低氧來模擬高原低氧環(huán)境，大鼠自由取食水。

1.4藥物及給藥方法鹽酸川穹嗪(批號:H20054485)，上?，F(xiàn)代哈森(商丘)藥業(yè)有限公司產(chǎn)品。根據(jù)體質(zhì)量(5 mL·kg-1)，1 d和3 d低氧對照組和藥物組大鼠提前5 d開始腹腔注射鹽酸川穹嗪和生理鹽水；從7 d組開始，15 d和30 d低氧對照組和藥物組大鼠，每隔1 d按照上述方法給予TMP和同劑量生理鹽水進(jìn)行干預(yù)。

1.5Morris水迷宮實驗不銹鋼噴塑圓柱形水池、圓柱形平臺和圖像采集系統(tǒng)(攝像機、錄像機、顯示器、分析軟件等)三部分組成。不銹鋼圓柱形水池為黑色，高50 cm、直徑120 cm。圓柱形平臺高15 cm、直徑10 cm。實驗開始前，先制備水，要求為超過平臺1～2 cm深，為了不使大鼠產(chǎn)生應(yīng)激，水溫保持在在(22±2)℃；然后，隨意將水池分為4個象限(NE、SE、SW、NW)，平臺置于任意一象限，在每兩個象限中央處，分別貼上空間標(biāo)記物，不同形狀的白色幾何圖形(菱形、長方形、正方形、三角形)，以此來引導(dǎo)大鼠找到平臺；最后，圖像采集系統(tǒng)置于水迷宮上方2～4 cm處，自動采集大鼠游泳軌跡記錄相關(guān)信息，將其輸入計算機系統(tǒng)，用于相應(yīng)指標(biāo)的提取和分析。

1.6水迷宮定位航行實驗大鼠學(xué)習(xí)記憶能力采用經(jīng)典的定位航行實驗進(jìn)行訓(xùn)練，按照組別先分別進(jìn)空間探索實驗，將大鼠每天訓(xùn)練5次，每次從不同的象限將大鼠頭朝水迷宮貼壁處放入，直到其找到平臺，間隔時間為60 s，期間用毛巾將大鼠擦干，以免影響游泳效果。如果大鼠在規(guī)定時間內(nèi)找不到中心平臺，則需要人為引導(dǎo)其找到平臺，并在平臺上停留10 s左右，等到將其訓(xùn)練完以后，d 5時，將訓(xùn)練過的大鼠，撤去平臺，記錄其在120 s內(nèi)在水迷宮內(nèi)的總路程和穿越平臺的次數(shù)，以觀察大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。

1.7Westernblot實驗將大鼠用10%烏來糖(3.5 mL·kg-1)腹腔注射麻醉后，在冰上分離海馬，將其凍存在液氮中，隨后放入-80℃超低溫冰箱保存。在提取蛋白時，按比例加入蛋白裂解液(RIPA ∶PMSF ∶蛋白酶抑制劑=100 ∶1 ∶1)，提取蛋白，勻漿后分裝；分別配備10%分離膠和5%的濃縮膠，用80 V、130 min電泳，轉(zhuǎn)膜2 h，3%脫脂奶粉封閉1 h，之后分別加入GABAAα1R(1 ∶500)、GABAB1R、(1 ∶2 000)、FOXP2(1 ∶1 000)一抗，4℃過夜，洗膜，加入二抗2 h，洗膜，最后用ECL發(fā)光液曝光。

2 結(jié)果

2.1Morris水迷宮行為學(xué)結(jié)果Fig 1結(jié)果顯示，在定位航行實驗中，對照組和藥物組大鼠1 d總路程和穿越平臺次數(shù)比較差異均無顯著性(P>0.05)；從3 d組開始，藥物組大鼠在水迷宮120 s內(nèi)總路程明顯少于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01，F(xiàn)ig 1A)；并且，從3 d組開始，藥物組大鼠在水迷宮120 s內(nèi)穿越中心平臺次數(shù)明顯多于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01，F(xiàn)ig 1B)。

2.2各組大鼠海馬中GABAAα1R、GABAB1R和FOXP2蛋白表達(dá)結(jié)果Fig 2結(jié)果顯示，不同時間段內(nèi)，GABAAα1R蛋白表達(dá)對照組與藥物組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；GABAB1R表達(dá)，從3 d組開始，藥物組明顯多于對照組(P<0.05)；FOXP2蛋白表達(dá)，從3 d組開始，藥物組明顯多于對照組(P<0.05)。

Fig 1 The summary of the change total diatance(A) and the changing trendency of the frequency of crossing platform(B) in Morris water mase of rats(±s, n=12)

Fig 2 The expression of GABAAα1 and GABAB1 receptor and FOXP2 in hippocampus of rats for each group(±s,n=12)

2.3相關(guān)性分析結(jié)果Fig 3結(jié)果顯示，對照組海馬中GABAB1R表達(dá)與水迷宮總路程呈負(fù)相關(guān)(r=-0.738，P<0.05，F(xiàn)ig 3A)，對照組海馬中FOXP2蛋白表達(dá)與水迷宮總路程呈負(fù)相關(guān)(r=-0.693，P<0.05，F(xiàn)ig 3B)。由Fig 4可見，對照組海馬中GABAB1R與FOXP2蛋白表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.834，P<0.05)。

3 討論

當(dāng)機體短期或長期處于缺血缺氧環(huán)境時，會使腦血管通透性增高，神經(jīng)細(xì)胞出現(xiàn)代謝障礙，ATP生成減少，導(dǎo)致腦血管性和腦細(xì)胞毒性水腫的發(fā)生，顱內(nèi)壓升高，后者又進(jìn)一步加重腦缺血缺氧癥狀和一些神經(jīng)退行性疾病，最終使得大腦的學(xué)習(xí)記憶能力受到損傷[7]。TMP是傳統(tǒng)中藥川芎的主要有效成分，很早就被發(fā)現(xiàn)它可以抑制細(xì)胞凋亡和維持大腦氧化抗氧化系統(tǒng)平衡，主要用于腦血管性疾病[8-9]。近年來也有文獻(xiàn)報道，TMP可以通過調(diào)節(jié)腦內(nèi)遞質(zhì)谷氨酸(glutamic acid, Glu)和GABA含量，對神經(jīng)元興奮性進(jìn)行調(diào)節(jié)[10]；TMP也可以升高大腦多巴胺(dopamine，DA)、五羥色胺(5-hydroxytryptamine，5-HT)以及降低去甲腎上腺素(norepinephrine，NE)的含量，保護(hù)大腦認(rèn)知功能；TMP還可通過下調(diào)大鼠海馬區(qū)細(xì)胞周期蛋白E(cycline E)和上調(diào)p21蛋白表達(dá)量，抑制細(xì)胞凋亡，最終提高大腦學(xué)習(xí)記憶力[11]。

Fig 3 The correlation analysis of GABAAB1receptor(A), FOXP2 protein(B) and total distancein hippocampus of rats for control group(±s,n=12)

Fig 4 The correlation analysis of GABAB1 receptor and FOXP2 protein in hippocampus of rats for control group(±s,n=12)

本研究中，通過Morris水迷宮行為學(xué)實驗結(jié)果，計算定位航行實驗中的大鼠在水迷宮的游泳總路程和穿越中心平臺次數(shù)可以得出，從3 d組開始，對照組大鼠的水迷宮總路程呈現(xiàn)不斷增長的趨勢，而穿越中心平臺次數(shù)卻減少，說明低壓低氧環(huán)境會使大腦學(xué)習(xí)記憶能力下降，與Cha等[2]研究結(jié)果相一致。大腦作為人體的核心器官，其氧耗量大，約占人體總氧耗量的23%，低壓低氧條件使大腦的抗氧化應(yīng)激、能量代謝、信號通路、神經(jīng)遞質(zhì)等正常代謝和功能都受到影響，最終損傷大腦的學(xué)習(xí)記憶能力。而經(jīng)過TMP干預(yù)后，從3 d組開始，藥物組游泳總路程明顯短于對照組，而穿越中心平臺次數(shù)明顯多于對照組，說明TMP對這種低壓低氧導(dǎo)致學(xué)習(xí)記憶功能障礙有著一定的保護(hù)作用，這與Liu等[8]的研究結(jié)果一致。

GABA是一種抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，當(dāng)與其相應(yīng)受體結(jié)合后，在海馬、小腦等部位起作用。其中，GABAB1R主要分布在海馬，研究表明它們對大腦的學(xué)習(xí)記憶功能有著很重要的作用，并且持續(xù)低壓低氧會使得大腦內(nèi)的GABA含量明顯減少，這與本項目隨著大鼠暴露低氧時間的延長，海馬組織中的GABAB1R表達(dá)量逐漸減少的研究結(jié)果是一致的。有研究報道[12]，GABABR激動劑能夠拮抗神經(jīng)元損傷，其機制可能是因為GABAR可以干預(yù)Glu受體下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，抑制Glu受體的神經(jīng)毒性，對大腦學(xué)習(xí)、記憶起到保護(hù)作用。我們的研究也發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過TMP干預(yù)后，GABAB1R表達(dá)量均明顯比同一暴露低氧時間的對照組高(P<0.05)，并具有時間依賴性，說明TMP能夠提高GABAB1R表達(dá)量，從而對海馬學(xué)習(xí)記憶起到保護(hù)作用，這與孫正啟等[12-13]研究結(jié)果相符合。其機制可能是在低壓低氧條件下，磷酸化的Glu受體和N-甲基-D-天冬氨酸受體(N-methyl-D-aspartic acid receptor，NMDA)表達(dá)量均明顯升高，Glu是一種廣泛存在于大腦的興奮性氨基酸，在大腦學(xué)習(xí)記憶功能中有著重要的意義。NMDA受體又是Glu的一種離子型受體，是參與形成大腦的長時程抑制(LTP)的主要受體，低壓低氧下產(chǎn)生過量的Glu，使得Glu與NMDA受體更多地結(jié)合，使Ca2+通道處于持續(xù)開放的狀態(tài)，對大腦產(chǎn)生興奮毒性作用，造成神經(jīng)細(xì)胞凋亡，最終影響大腦的學(xué)習(xí)記憶功能[14]。而在本實驗中，GABAAα1R蛋白表達(dá)量在對照組和藥物組差異無統(tǒng)計學(xué)意義，說明TMP并不是通過調(diào)節(jié)該受體對大腦學(xué)習(xí)記憶進(jìn)行干預(yù)。

FOXP2是一種與學(xué)習(xí)記憶、語言等功能相關(guān)的蛋白，它主要在大腦的海馬表達(dá)。Ma等[6]研究發(fā)現(xiàn)，該蛋白的高表達(dá)與高原鼢鼠學(xué)習(xí)記憶能力有關(guān)。韋娜[15]研究發(fā)現(xiàn)，通過增加靶基因FOXP2的表達(dá)量，保護(hù)海馬神經(jīng)環(huán)路突觸可塑性，進(jìn)而逆轉(zhuǎn)學(xué)習(xí)和記憶功能障礙。本實驗研究發(fā)現(xiàn)，持續(xù)低氧干預(yù)后，隨著大鼠暴露低氧的天數(shù)增加，F(xiàn)OXP2出現(xiàn)逐漸減少的趨勢(P<0.05)，而經(jīng)過TMP干預(yù)后，其表達(dá)量明顯高于對照組，表明TMP能夠上調(diào)FOXP2蛋白，這種變化趨勢是否與GABAB1R以及游泳總路程等學(xué)習(xí)記憶功能有關(guān)？我們通過分析發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)OXP2蛋白灰度值與水迷宮總路程具有較高的負(fù)相關(guān)性(r=-0.693，P<0.05)，表明FOXP2蛋白參與了大鼠在水迷宮實驗中的學(xué)習(xí)記憶過程，即FOXP2蛋白表達(dá)越高，總路程時間越短，學(xué)習(xí)記憶能力越強。另外，GABAB1R灰度值與水迷宮總路程也存在較高的負(fù)相關(guān)(r=-0.738，P<0.05)，表明該受體也參與大鼠在水迷宮中的學(xué)習(xí)記憶過程。而GABAB1R與FOXP2蛋白相關(guān)性分析表明，兩者間存在高度正相關(guān)性(r=0.834，P<0.05)，說明在低氧對海馬組織損傷以及TMP調(diào)節(jié)干預(yù)中，GABAB1R與 FOXP2均發(fā)生了同步性變化。換言之，兩者之間存在一種協(xié)同作用，至于是GABAB1R改變影響了FOXP2，還是由于FOXP2改變影響了GABAB1R，兩者之間存在怎樣的信號通路對學(xué)習(xí)記憶起調(diào)節(jié)作用，尚不清楚，有待于進(jìn)一步研究證實。

綜上所述，本研究結(jié)果表明，低壓低氧環(huán)境會減弱大鼠大腦的學(xué)習(xí)記憶能力，但是通過TMP對GABAB1R與FOXP2蛋白表達(dá)量的調(diào)節(jié)，可以增強腦的學(xué)習(xí)記憶能力，對低氧腦損傷具有一定的防治作用，這將為后續(xù)醫(yī)學(xué)研究和高原地區(qū)臨床工作提供一定的參考價值。

(致謝：本實驗在青海大學(xué)高原醫(yī)學(xué)研究中心和青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究中心完成，非常感謝研究中心各位老師和同學(xué)在實驗技術(shù)上的無私幫助。)

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TetramethylpyrazineprotectslearningmemoryofhypoxichypoxiaratsthroughinterferingexpressionofGABAreceptorandFOXP2

LI Xiao-na,WANG Xiao-jun, ZHU Yan-mei,CAO Cheng-zhu, YANG Chun-yan,YAN Yun-fei, ZHAO Yan-li, LI Sheng-hua
(DeptofPhysiology,FacultyofBasicMedicine,QinghaiUniversityMedicalCollege,Xining810016,China)

AimTo examine the influence of tetramethylpyrazine on learning and memory function of hypoxic hypoxia rats, and the expression of gamma aminobutyric acid(GABA) receptor and forkhead box P2(FOXP2) in hippocampus of rats.MethodsA total of 120 Sprague Dawley rats were randomly divided into low hypoxic hypoxia and high hypoxic hypoxia groups, then according to different time points every group was divided into 1 d, 3 d, 7 d 15 d, 30 d group, with 12 rats per each group. Experiment group and the control group were treated with tetramethylpyrazine and 0.9% normal saline, respectively. The hypoxic hypoxia environment was achieved by putting the rats in a hypobaric chamber at a simulated altitude of 5 500 meters for different days. The capabilities of learning and memory of rats were detected by Morris water maze test. The expression of GABA receptor and FOXP2 protein in hippocampus of rat was determined by Western blot.Results① Morris water maze test showed that the total distance of rats in the simulated hypobaric hypoxia control group was longer than that in the tetramethylpyrazine group(P<0.01) and the number of crossing the bestride platform increased compared with that in the hypobaric hypoxia control group(P<0.01) from the third day;② Western blot results showed that the expression of GABAAα1 receptor have no statistical significance(P>0.05);however,GABAB1 receptor and FOXP2 protein rose from the third day(P<0.05). The expression of GABAAα1 receptor and FOXP2 protein expression were correlated to total distance of Morris water maze in the control group(r=-0.738,P<0.05;r=-0.693,P<0.05), and the expression of GABAB1 receptor was correlated with FOXP2 protein level(r=0.834,P<0.05).ConclusionThe simulated high-altitude hypobaric hypoxia can decrease the learning and memory abilities of rats, which may be ameliorated by tetramethylpyrazine intervention, and this effect might be related to the increase of GABAB1R receptor and FOXP2 expression in hippocampus of rats.

tetramethylpyrazine; hypobaric hypoxia; hippocampus; Morris water maze test; learning and memory; GABA receptor; FOXP2

時間：2017-8-20 16:47 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20170820.1647.038.html

2017-05-18,

2017-06-30

青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院中青年科研基金資助項目(No 2015-KT-5)

李曉娜(1991-)，女，碩士生，研究方向：低氧神經(jīng)生理學(xué)，E-mail：863996552@qq.com； 李生花(1966-)，女，碩士，教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向：高原低氧神經(jīng)與心血管生理學(xué)，通訊作者，E-mail：lshls@126.com

10.3969/j.issn.1001-1978.2017.09.019

A

：1001-1978(2017)09-1285-06

R-332；R284.1；R322.81；R338.64；R392.11；R442.9；R845.22