李智勇，孫冬梅*，王洛臨

(1.廣東省中醫(yī)藥工程技術(shù)研究院，廣東 廣州 510095；2.廣東省中醫(yī)藥研究開發(fā)重點實驗室，廣東 廣州 510095)

布渣葉總黃酮大孔吸附樹脂純化工藝研究

李智勇1,2，孫冬梅1,2*，王洛臨1,2

(1.廣東省中醫(yī)藥工程技術(shù)研究院，廣東 廣州 510095；2.廣東省中醫(yī)藥研究開發(fā)重點實驗室，廣東 廣州 510095)

目的：確定布渣葉總黃酮(total flavonoids inMicrocospaniculataL.，TFMP)的大孔吸附樹脂純化工藝參數(shù)。方法：采用單因素試驗法篩選適宜的大孔樹脂；并對其純化工藝條件進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果：D101分離TFMP的工藝條件為上柱藥液濃度為0.15 g/mL，上柱流速0.5 BV/h，上樣體積8.5 BV，樹脂柱徑高比為1∶8，以5 BV水洗脫，洗脫溶劑為80%的乙醇，洗脫流速1 BV/h，洗脫體積3.75 BV，大孔樹脂可重復(fù)利用5次，TFMP純化后含量達(dá)84.09%，精制度達(dá)220.03%。結(jié)論： D101可以用于富集，純化TFMP。

布渣葉總黃酮；大孔吸附樹脂；純化工藝

布渣葉為椴樹科植物破布葉(MicrocospaniculataL.)的葉，具有消食化滯，清熱利濕等功效，主要含有黃酮、生物堿、三萜、揮發(fā)油等化合物。前期研究發(fā)現(xiàn)，布渣葉提取物能顯著降低高脂血癥小鼠模型血清中總膽固醇(TC)和甘油三酯(TG)的含有量，其中黃酮類化合物為其主要有效成分。本研究在前期布渣葉總黃酮提取研究的基礎(chǔ)上[1]，采用大孔樹脂進(jìn)行純化工藝研究，為其有關(guān)制劑提供物質(zhì)基礎(chǔ)。

1 儀器與試藥

紫外分光光度計UV PC-2550(島津)；Sartorius BP 211D電子分析天平；Agilent 6890-5973N GC-MS氣質(zhì)聯(lián)用儀；Agilent 7694E頂空進(jìn)樣器；大孔吸附樹脂:D101(天津市海光化工有限公司),AB-8(南開大學(xué)化工廠),HPD100、HPD300、HPD400、HPD450(河北滄州寶恩化工有限公司)。

布渣葉藥材購于廣州養(yǎng)和醫(yī)藥有限公司，經(jīng)廣東省中醫(yī)藥工程技術(shù)研究院孫冬梅主任中藥師鑒定為正品；TFMP提取物(自制)；蘆丁對照品(080-9303,中國藥品生物制品檢定所);藥用乙醇(廣寧縣順寧葡萄糖藥業(yè)有限公司)；鹽酸，氫氧化鈉，亞硝酸鈉，硝酸鋁均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 TFMP的UV測定

2.1.1 對照品溶液的配制

精密稱取在120℃干燥至恒重的蘆丁對照品20.5 mg置100 mL容量瓶中，加70%乙醇至刻度，搖勻，制成每1 mL含0.205 mg蘆丁的對照品溶液。

2.1.2 供試品溶液的配制

取布渣葉提取物(約相當(dāng)于2.5 g布渣葉)，精密稱定，置具塞三角瓶中，精密加入70%乙醇50 mL，密塞，稱定重量，超聲處理(功率200 W，頻率40 KHz)1 h，放冷，再稱定重量，用70%乙醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取濾液，即得[2]。

2.1.3 方法學(xué)考察

精密吸取對照品溶液0，0.5，1.0，2.0，3.0，4.0和5.0 mL，分別置25 mL容量瓶中，加水至6 mL，加5%亞硝酸鈉溶液1 mL，搖勻，放置6 min，加10%硝酸鋁溶液1 mL，搖勻，放置6 min，加氫氧化鈉試液5 mL，再加水至刻度，搖勻，放置15 min；以相應(yīng)試劑為空白，測定500 nm處吸光度[2]，以吸光度(A)為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)(C)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程A=0.011 49 C-0.009 64(r=0.999 63)，表明線性良好。取同一供試品溶液，在顯色后5，10，15，20，25，30 min測定，結(jié)果顯示經(jīng)過20 min后吸光度明顯下降，因此控制測定時間在顯色后20 min以內(nèi)。

2.1.4 測定法

精密量取供試品溶液0.2 mL，置25 mL容量瓶中，照“2.1.3”項下的方法，自“加水至6 mL”起，依法測定吸光度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀取濃度，計算總黃酮含量。經(jīng)測定，本實驗用布渣葉中總黃酮含量為6.81%。

2.2 TFMP的大孔吸附樹脂純化工藝研究

2.2.1 布渣葉提取液的制備

取布渣葉500 g，照優(yōu)選的提取工藝提取，回收乙醇，濃縮至無醇味，加入一倍量的蒸餾水，攪勻，靜置過夜，濾過，沉淀物用水洗滌2次，洗滌液與濾液合并，置1 000 mL容量瓶中，加水至刻度，搖勻，即得。依法測定吸光度并計算總黃酮的得率為6.29%。

2.2.2 大孔吸附樹脂的選擇[3]

稱取已預(yù)處理[4]的HPD100、HPD300、HPD400、HPD450、AB-8、D101等大孔吸附樹脂各3 g，置100 mL具塞三角瓶中，加入30 mL布渣葉提取液，搖床振搖12 h，過濾，大孔吸附樹脂以30 mL水洗滌，合并水洗液和濾液，轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中，加水至刻度，搖勻，備用；樹脂轉(zhuǎn)移至100 mL具塞三角瓶中，加入乙醇25 mL，超聲處理(功率200 W，頻率40 KHz)15 min，取出，放置3 h，過濾，繼續(xù)加乙醇洗滌至洗出液呈無色，合并濾液和洗滌液，轉(zhuǎn)移至100 mL量瓶中，加乙醇至刻度，搖勻，備用；分別測定吸光度，計算比吸附量，比洗脫量和解吸附率，結(jié)果如表1。

表1 不同大孔吸附樹脂對TFMP的吸附考察

注：比吸附量=(上樣量-殘余量)/樹脂重量；比洗脫量= 醇洗脫量/樹脂重量；解吸附率(%)=醇洗脫量/吸附量×100%。

結(jié)果可知，除HPD450的比吸附量和比洗脫量相對較低外，其余均無顯著差異，但從解吸附率來看，D101型的解吸附率優(yōu)于其他各型號，確定選用D101。

2.3 吸附條件優(yōu)化

2.3.1 上樣液pH值對D101總黃酮吸附率的影響[5]

取布渣葉提取液(pH值為3.4)，加入稀HCl試液或稀NaOH試液，調(diào)節(jié)使pH值分別為2、4、6、8，吸取原液和各pH值溶液各20 mL，置入已稱取2 g D101的三角瓶中，輕輕振搖，并放置過夜，過濾，D101以30 mL水洗滌，合并，轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中，加水至刻度，搖勻，依法測定吸光度，計算總黃酮吸附率[計算公式：吸附率(%)=(上樣量-殘余量)/上樣量×100%]。結(jié)果上樣藥液pH值2、3.4、4、6、8時TFMP吸附率分別為93.86%、92.19%、87.56%、88.4%、91.38%，考慮到生產(chǎn)的方便性和實際操作性，選用原液(pH值3.4)上樣。

2.3.2 上樣濃度對D101總黃酮吸附率的影響[6]

取布渣葉提取液，分別加水稀釋成每毫升含總黃酮10.76、7.17、4.30、2.69 mg的溶液，以0.5 BV/h的速度通過D101樹脂柱，收集流出液，轉(zhuǎn)移至50 mL量瓶中，加水至刻度，搖勻，依法測定吸光度，結(jié)果 計算得總黃酮吸附率分別為91.67%、90.05%、92.98%、96.83%，考慮上樣濃度過低明顯增加上樣時間，選擇上樣濃度10.76 g/L(約每毫升含0.15 g生藥)。

2.3.3 上樣流速對D101總黃酮吸附率的影響

取布渣葉提取液(每毫升含0.15 g生藥)，分別以0.5、1、2、3 BV/h的流速通過D101樹脂柱，分別收集流出液，轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中，加水至刻度，搖勻，依法測定吸光度，計算得總黃酮吸附率分別為89.02%、82.23%、79.72%、67.75%，故選擇上樣流速為0.5 BV/h。

2.3.4 樹脂柱徑高比對D101純化TFMP的影響

稱取D1015份，濕法裝于不同的玻璃柱中，使徑高比分別為1∶6、1∶7、1∶8、1∶9、1∶10，各取6 BV的布渣葉提取液(0.15 g/mL)，以0.5 BV/h的速度通過樹脂柱，收集殘余液；取蒸餾水以1 BV/h的速度洗脫至無色，收集水洗液；再以80%乙醇洗至無色，收集醇洗液；殘余液，水洗液和醇洗液，分別濃縮至適量，轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中，加水至刻度，搖勻，依法測定吸光度，并計算吸附殘余率，水洗損失率，總黃酮得率及其總和，結(jié)果如表2，選擇徑高比為1∶8。

表2 樹脂柱徑高比對D101純化TFMP的影響

注：吸附殘余率(%)=吸附殘余量/上樣量×100%； 水洗損失率(%)=水洗損失量/上樣量×100%；總黃酮得率(%)=醇洗脫量/上樣量×100%；總和(%)=吸附殘余率+水洗損失率+總黃酮得率。

2.3.5 吸附泄漏曲線的考察

取布渣葉提取液，以0.5 BV/h的流速通過D101樹脂柱(柱體積約20 mL)，分段收集流出液，每份10 mL，依法測定吸光度，計算總黃酮濃度，并繪制泄漏曲線圖(如圖1)。結(jié)果顯示，在上樣體積180 mL處流出液總黃酮濃度達(dá)到47.71 mg/L，約相當(dāng)于170 mL處流出液濃度25.65 mg/L的2倍，確定上樣溶液的體積為170 mL，約為8.5 BV。

圖1 TFMP泄露曲線

2.4 洗脫條件優(yōu)選

2.4.1 不同濃度醇溶液對總黃酮靜態(tài)解吸附的影響

稱取D1016份，每份3 g，分別置于100 mL具塞的三角瓶中，加入布渣葉提取30 mL，時時振搖，放置過夜，使充分吸附，濾過，D101水洗至無色，抽干，分別加入對應(yīng)濃度為40%、50%、60%、70%、80%、90%的乙醇各20 mL，搖床振搖6 h后，濾過，并以相同濃度的乙醇分別洗滌，合并洗滌液和濾液，轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中，加乙醇至刻度，搖勻。依法測定吸光度，計算。結(jié)果總黃酮得率分別為50.18%，63.88%，74.5%，75.57%，82.64%，76.57%。故選用80%乙醇作為洗脫溶劑。

2.4.2 洗脫速度對總黃酮得率的影響

取布渣葉提取液4份，分別以0.5 BV/h通過D101樹脂柱，分別用8倍量80%乙醇分別以0.5、1.0、2.0、3.0 BV/h流速洗脫，收集洗脫液，依法測定吸光度，計算得總黃酮得率分別為86.49%、83.59%、76.01%、69.65%，表明隨著洗脫流速加大，總黃酮得率呈下降趨勢，兼顧生產(chǎn)效率和生產(chǎn)實際可操作性，選擇洗脫速度為1 BV/h。

2.4.3 洗脫體積的選擇[7]

取布渣葉提取液，以0.5 BV/h的流速通過D101樹脂柱，再用80%乙醇以1 BV/h的流速洗脫，分段收集洗脫液，每份5 mL，依法測定吸光度，計算洗脫液中的總黃酮含量和洗脫體積，并繪制洗脫曲線，結(jié)果如圖2。由洗脫曲線可知，當(dāng)洗脫體積達(dá)到45 mL時洗脫液中總黃酮的含量趨近于洗脫平衡，因此可確定洗脫體積為45 mL(約3.75 BV)。

圖2 TFMP洗脫曲線

2.5 D101再生重復(fù)使用次數(shù)考察[7]

根據(jù)確定的D101吸附條件，重復(fù)多次吸附與解吸附，每次解吸附后用95%乙醇和蒸餾水依次進(jìn)行洗脫再生，再進(jìn)行下一次試驗。分別收集各次80%乙醇洗脫液，依法測定吸光度，計算總黃酮得率。

總黃酮得率(%)=醇洗脫量/上樣量×100%

表3 D101不同再生重復(fù)使用次數(shù)總黃酮得率(n=2)

結(jié)果如表3所示，新D101的總黃酮得率與重復(fù)再生1，2，3，4，5次的總黃酮得率差別不大，在重復(fù)使用6次后，總黃酮得率明顯下降，不利于總黃酮的富集。因此D101重復(fù)利用5次可以保證吸附效果。

2.6 驗證試驗

按照確定的純化工藝進(jìn)行3次驗證試驗(投藥量分別為1 kg、5 kg、20 kg)，結(jié)果顯示，TFMP純化前總黃酮的平均得率為藥材的4.10%，總黃酮平均含量為38.22%，RSD為0.04%(n=3)，純化后的平均含量為84.09%，RSD為2.16%(n=3)，精制度達(dá)220.03%[精制度(%)=純化后總黃酮含量/純化前總黃酮含量×100%]。說明該純化工藝穩(wěn)定，可靠。

3 小結(jié)與結(jié)論

本研究基于將布渣葉總黃酮提取物用于醫(yī)藥用途，因此在提取、純化、分離工藝中選擇溶劑時盡量避開易燃易爆、毒性較強(qiáng)的有機(jī)溶媒，而選用藥用乙醇等作為溶劑，以便利于后續(xù)純化和藥品生產(chǎn)。并在前期提取的研究基礎(chǔ)上，采用單因素考察法對TFMP的大孔樹脂純化工藝參數(shù)進(jìn)行了篩選，確定了其純化工藝，結(jié)果顯示其精制度達(dá)220.03%，說明采用D101可以較好地富集，純化布渣葉總黃酮，從而為其進(jìn)一步制劑奠定基礎(chǔ)。

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PurificationProcessofTotalFlavonoidsinMicrocosPaniculatawithMacroporousAdsorptionResin

LIZhi-yong1,2,SUNDong-mei1,2*,WANGLuo-lin1,2

(1.GuangdongProvinceEngineeringTechnologyResearchInstituteofT.C.M.，Guangzhou510095,China; 2.GuangdongProvincialKeyLaboratoryofR&DinT.C.M.，Guangzhou510095,China)

Objective: To determine the parameters of purification process of total flavonoids inMicrocospaniculataL.(TFMP)with macroporous resin. Methods: Single factor test was used to choose the suitable macroporous. Optimize the purification process conditions. Results: D101isolated TFMP process conditions on the concentration was 0.15 g/mL; the flow rate was 0.5 BV/h; the sample volume was 8.5 BV; resin column diameter to height ratio was 1∶8; with 5BV water washed; 3.75 BV ethanol 80% with flow rate 1 BV/h, microporous resin could be reused for 5 times; the purification of TFMP reached 84.09%, up to 220.03% of refining. Conclusion: D101can be used to enrich and purify TFMP.

Total flavonoids inMicrocospaniculataL.; Macroporous adsorption resin; Purification process

廣東省科技計劃項目重大科技專項項目(No.2012A080202016)

李智勇(1977-)，男，博士，主任中藥師，主要研究方向：中藥制劑及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究。

孫冬梅*(1969-)，女，教授，博士研究生導(dǎo)師，主任中藥師，主要研究方向：中藥質(zhì)量評價研究。

2016-09-01

修回日期：2016-09-15

R284

：A

：1002-2406(2017)05-0024-04