王定坤， 陸付耳， 鄒 欣， 任妍林， 董 慧， 鞏 靜， 方 珂， 徐麗君， 王開(kāi)富△

華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院 1中西醫(yī)結(jié)合科 2中西醫(yī)結(jié)合研究所,武漢 430030

大鼠靶向α7nAchR基因shRNA真核表達(dá)載體及重組腺病毒構(gòu)建*

王定坤1， 陸付耳2， 鄒 欣2， 任妍林2， 董 慧2， 鞏 靜2， 方 珂2， 徐麗君2， 王開(kāi)富2△

華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院1中西醫(yī)結(jié)合科2中西醫(yī)結(jié)合研究所,武漢 430030

目的 構(gòu)建大鼠煙堿樣乙酰膽堿受體α7亞型(α7nAchR)基因短發(fā)夾RNA(shRNA)真核表達(dá)載體。方法 設(shè)計(jì)并合成編碼α7nAchR基因shRNA的DNA模板引物AY318、AY857、AY444+559、AY318+857，并分別與線性化的質(zhì)粒載體pGenesil-1.1、pGenesil-1.4、pGenesil-1.2，pGenesil-1.3連接，以構(gòu)建可以編碼1條α7nAchR基因shRNA和編碼2條α7nAchR基因shRNA的重組質(zhì)粒載體；重組質(zhì)粒載體感染感受態(tài)的DH5a細(xì)胞，提取細(xì)菌質(zhì)粒進(jìn)行特定酶切，并用1%的瓊脂糖凝膠電泳以鑒定重組質(zhì)粒是否構(gòu)建成功；用LR體外同源重組法將AY318、AY444+559、AY857 shRNA表達(dá)框分別從重組質(zhì)粒pGenesil轉(zhuǎn)移至腺病毒pGSadeno質(zhì)粒表達(dá)載體上，構(gòu)建重組腺病毒質(zhì)粒；用相同的方法感染DH5a細(xì)胞，并鑒定重組腺病毒pGSadeno質(zhì)粒是否構(gòu)建成功；提取線性化的重組腺病毒DNA并轉(zhuǎn)染包裝細(xì)胞HEK293，經(jīng)放大培養(yǎng)獲得滴度為1.0×1010pfu/mL的重組腺病毒上清；將重組腺病毒感染大鼠GH3垂體瘤細(xì)胞，以PCR反應(yīng)鑒定重組腺病毒載體的α7nAchR基因干擾效果。結(jié)果 通過(guò)酶切片段及其大小，初步判斷AY318、AY857、AY444+559、AY318+857 shRNA成功重組入質(zhì)粒載體，重組腺病毒pGSadeno-shRNA包裝成功；重組腺病毒感染HEK293細(xì)胞，在熒光顯微鏡下有綠色熒光蛋白表達(dá)；重組腺病毒感染GH3細(xì)胞后α7nAchR mRNA表達(dá)顯著減少，且pGSadeno-AY857 shRNA干擾效果最明顯(85%)。結(jié)論 具有感染力和干擾大鼠α7nAchR基因表達(dá)的shRNA真核表達(dá)載體構(gòu)建成功，且pGSadeno-AY857 shRNA具有最強(qiáng)的基因干擾效果。

α7nAchR； shRNA； 基因干擾； 重組質(zhì)粒； 重組腺病毒

RNA干擾(RNA interference，RNAi)是一種先于動(dòng)植物分化，古老而普遍存在于自然界中，保護(hù)生物體抵抗外界環(huán)境刺激的生物現(xiàn)象。RNAi技術(shù)是近些年來(lái)發(fā)展起來(lái)的分子生物學(xué)技術(shù)，旨在于分子水平抑制靶基因表達(dá)，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)特定表型的基因進(jìn)行研究。近年來(lái)，越來(lái)越多的研究表明膽堿能抗炎通路(Cholinergic anti-inflammatory pathway，CAP)在一系列慢性消耗性疾病如2型糖尿病、關(guān)節(jié)炎、動(dòng)脈粥樣硬化病、牛皮癬、哮喘、敗血癥以及潰瘍性結(jié)腸炎中的作用，而這些疾病都與機(jī)體的慢性炎癥反應(yīng)相關(guān)[1]。所謂的膽堿能抗炎通路即Ach-α7nAchR-MAPK/JAK/STAT-NF-κB通路，乙酰膽堿(Ach)作為副交感神經(jīng)系統(tǒng)分支自主神經(jīng)系統(tǒng)的主要神經(jīng)遞質(zhì)，可以通過(guò)作用于α7煙堿樣膽堿能受體(α7 nicotinic acetylcholine receptor，α7nAchR)激活CAP，抑制人體的網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)(RES)如肺、脾、肝、腎和腸道等器官的NF-κB蛋白表達(dá)和核位移，從而抑制炎癥反應(yīng)[2-3]。因此，本研究試圖沉默α7nAchR基因，為進(jìn)一步研究該基因介導(dǎo)的CAP在一些慢性炎癥反應(yīng)性代謝病中的作用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑、儀器

質(zhì)粒pGenesil、腺病毒pGSadeno載體(淅瑪生物技術(shù)有限公司，武漢)；質(zhì)粒提取試劑盒(Sigma-Aldrich公司，美國(guó))；DH5a細(xì)胞(上海閃晶分子生物科技有限公司，上海)；PCR擴(kuò)增試劑、Trizol、限制性?xún)?nèi)切酶(TaKaRa公司，大連)；PCR儀(StepOne公司，美國(guó))；恒溫培養(yǎng)箱(SANYO公司，日本)；HEK293細(xì)胞(ATCC公司，美國(guó))；DMEM培養(yǎng)液(Gibco公司，美國(guó))；高速離心機(jī)(Thermo Scientific公司，美國(guó))；DNA/細(xì)胞轉(zhuǎn)染劑METAFECTENETM(Biontex公司，德國(guó))；熒光顯微鏡(OLYMPUS公司，日本)；NanoDrop 2000核酸/蛋白分析儀(Thermo Scientific公司，美國(guó))；Mastercycler梯度PCR儀(Eppendrof公司，德國(guó))；PCR引物(武漢金開(kāi)瑞生物工程有限公司，武漢)。

1.2 方法

1.2.1 一個(gè)質(zhì)粒載體編碼1條shRNA的重組質(zhì)粒構(gòu)建及鑒定 (1)設(shè)計(jì)并合成編碼α7nAchR基因shRNA序列的DNA模板引物。在GenBank中查找大鼠α7nAchR的全基因序列(ID號(hào)分別為：NM_012832)，拷貝并粘貼在siRNA網(wǎng)上設(shè)計(jì)軟件OptiRNA中，根據(jù)siRNA的設(shè)計(jì)原則，選取G∶C含量在30%～55%之間的核酸片段，并分別從該序列的318號(hào)堿基和857號(hào)堿基開(kāi)始選擇19個(gè)堿基為siRNA的靶序列，并做BLAST分析，保證不與同屬大鼠非靶序列同源。選擇的2條靶序列如下：AY318：5′-GATTTGGAAACCAGACATT-3′；AY857：5′-CATCTGATTCTGTGCCCTT-3′。根據(jù)選定的靶序列，設(shè)計(jì)并體外合成α7nAchR基因shRNA的DNA模板引物，其結(jié)構(gòu)為：BsaⅠ+Sense+Loop+Antisense+終止信號(hào)+SacⅠ+BsaⅠ。引物序列如下：pGenesil-1.1-AY318-A,5′-CACCGATTTGGAAACCAGACATTTCAAGACAATGTCTGG-TTTCCAAATCTTTTTG-3′；pGenesil-1.1-AY318-B,5′-AGCTCAAAAAGATTTGGAAACCAGACAT-TGTCTTGAAATGTCTGGTTTCCAAATC-3′；pGenesil-1.4-AY857-A,5′-TCCCCATCTGATTC-TGTGCCCTTTCAAGACAAGGGCACAGAATC-AGATGTTTTTG-3′；pGenesil-1.4-AY857-B,5′-AGCTCAAAAACATCTGATTCTGTGCCCTTG-TCTTGAAAGGGCACAGAATCAGATG-3′。把設(shè)計(jì)的DNA單鏈模板(正向序列、反向序列)退火形成雙鏈，并分別插入線性化的pGenesil-1.1，pGenesil-1.4質(zhì)粒表達(dá)載體。(2)α7nAchR基因shRNA載體的構(gòu)建及鑒定。分別用退火緩沖液溶解上述AY318及AY857的A片段和B片段，于水浴箱中94℃退火，自然冷卻至室溫，使DNA模板引物鏈接為雙鏈；內(nèi)切酶BsaⅠ酶切質(zhì)粒pGenesil-1.1、pGenesil-1.4構(gòu)建線性化質(zhì)粒載體；在Ligation Mix緩沖液中α7nAchR基因shRNA與線性化質(zhì)粒載體鏈接構(gòu)建重組質(zhì)粒，并感染感受態(tài)細(xì)胞DH5a細(xì)胞，取菌落接種于卡那霉素抗性(終濃度為30 μg/mL)的LB平板上繁殖，質(zhì)粒提取試劑盒提取細(xì)菌質(zhì)粒，并用限制性?xún)?nèi)切酶SacⅠ進(jìn)行酶切?；厥彰盖挟a(chǎn)物，并用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行鑒定。

1.2.2 一個(gè)質(zhì)粒載體編碼2條shRNA的質(zhì)粒構(gòu)建及鑒定 (1)設(shè)計(jì)合成含2個(gè)shRNA的DNA的模板引物。用同樣的方法，并遵循同樣的原則，從該基因的444位和559位起，分別選擇19和21個(gè)堿基，設(shè)計(jì)合成α7nAchR基因siRNA。其序列如下：AY444，5′-CTCCTGCTACATTGACGTT-3′；AY559，5′-GCAGTGGAACATGTCTGAGTA-3′。各引物序列如下：AY318+857-A，5′-TTGGACAGCACA-ATGTCTGGTTTCCAAATCGGGAAAGAGTGA-TCT-3′；AY318+857-AR，5′-TTTCTCTTGAAA-AGGGCACAGAATCAGATGGGTGTTTCGTCC-TTT-3′；AY318+857-C，5′-TTGAATTCAAGCTTGGATCCAAAAAGATTTGGAAACCAGACATTGGACAGCACAA-3′；AY318+857-CR，5′-TTGGATCCAAGCTTGAATTCAAAAACATCTGAT-TCTGTGCCCTTTCTCTTGAAAA-3′；AY444+559-A，5′-TTGGACAGCACAACGTCAATGTA-GCAGGAGGGGAAAGAGTGATCT-3′；AY444+559-AR，5′-TATCTCTTGAATACTCAGACATG-TTCCACTGCGGTGTTTCGTCCTTT-3′；AY444+559-C，5′-TTTGAATTCAAGCTTAAAAACT-CCTGCTACATTGACGTTGGACAGCACAA-3′；AY444+559-CR，5′-TTTAAGCTTGAATTCAA-AAAGCAGTGGAACATGTCTGAGTATCTCTT-GAATA-3′。DNA模板中引物A及C，AR及CR分別為AY318及AY857的正向序列及反向序列，均含Loop環(huán)序列及保護(hù)堿基，其正向序列含質(zhì)粒連接序列，其反向序列中均含有限制性?xún)?nèi)切酶BamHⅠ、EcoRⅠ、HindⅢ的酶切位點(diǎn)及終止信號(hào)。(2)雙鏈shRNA的合成用2步PCR法構(gòu)建AY318+857的雙鏈shRNA。用如前述的相同方法構(gòu)建AY444+559的shRNA序列。將上述引物分2組，進(jìn)行2步PCR擴(kuò)增，第1輪引物為A+AR，第2輪引物為C+CR，從而構(gòu)建含2個(gè)shRNA的序列。將合成的雙鏈shRNA進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，鑒定雙鏈shRNA是否構(gòu)建成功。(3)一個(gè)載體編碼2條shRNA的重組質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定。分別用限制性?xún)?nèi)切酶HindⅢ+EcoRⅠ，BamHⅠ+EcoRⅠ酶切質(zhì)粒pGenesil-1.2和pGenesil-1.3，使其線性化，并開(kāi)放和AY444+559 shRNA、AY318+857 shRNA結(jié)合的粘性末端，在Ligation Mix中構(gòu)建線性化質(zhì)粒載體。分別感染感受態(tài)的DH5a細(xì)胞，如1.2.1(2)項(xiàng)中同樣的方法進(jìn)行細(xì)菌的繁殖，使重組質(zhì)粒充分克隆。用質(zhì)粒提取試劑盒收集并裂解繁殖菌落，小量提取細(xì)菌質(zhì)粒，并做酶切。收集酶切產(chǎn)物，于1%的瓊脂糖凝膠電泳，觀察切割片段的大小。

1.2.3 重組腺病毒rAd5-AY444+559、AY318、AY857 shRNA構(gòu)建、包裝 LR體外同源重組法將AY318、AY444+559、AY857 shRNA表達(dá)框分別從質(zhì)粒pGenesil(1.1，1.2，1.4)轉(zhuǎn)移至腺病毒pGSadeno表達(dá)載體上，構(gòu)建重組腺病毒質(zhì)粒(AY318+857 shRNA由于制作重組腺病毒效率低，故而舍棄)。重組后的腺病毒感染DH5a，用同樣方法進(jìn)行克隆增殖。用質(zhì)粒提取試劑盒提取上一步中克隆增殖的質(zhì)粒，并用XbaⅠ內(nèi)切酶進(jìn)行單酶切，收集酶切產(chǎn)物，用1%瓊脂糖凝膠電泳，根據(jù)切出的片段大小，判斷shRNA是否重組入腺病毒質(zhì)粒。用內(nèi)切酶PacⅠ酶切重組腺病毒DNA使之線性化，并提取獲得線性化的腺病毒DNA。線性化的腺病毒DNA與DNA細(xì)胞轉(zhuǎn)染劑METAFECTENETM以DNA∶lipid=1∶3的比例混勻，轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，熒光顯微鏡下觀察到HEK293細(xì)胞熒光蛋白表達(dá)。當(dāng)HEK293細(xì)胞有明顯的細(xì)胞病態(tài)反應(yīng)(CPE)反應(yīng)，且有一半以上的細(xì)胞脫壁時(shí)即裂解細(xì)胞收集病毒，并進(jìn)行放大培養(yǎng)從而獲得滴度為1.0×1010pfu/mL的病毒。

1.2.4 構(gòu)建HK的重組腺病毒 用1.2.1同樣的方法，構(gòu)建1個(gè)質(zhì)粒載體含1個(gè)無(wú)基因干擾效果的無(wú)效干擾對(duì)照序列(HK)shRNA重組質(zhì)粒，并按上述同樣的方法，構(gòu)建HK干擾質(zhì)粒的重組腺病毒。HK序列如下：5′-GACTTCATAAGGCGCATGC-3′。編碼HK shRNA的DNA模板引物如下：HK-1.1-A，5′-CACCGACTTCATAAGGCGCATGCTTCAAGACGGCATGCGCCTTATGAAGTCTTT-TTTG-3′；HK-1.1-B，5′-AGCTCAAAAAAGAC-TTCATAAGGCGCATGCCGTCTTGAAGCATG-CGCCTTATGAAGTC-3′。

1.2.5 shRNA重組腺病毒感染GH3細(xì)胞 以3×105/孔的細(xì)胞數(shù)量將GH3細(xì)胞接種于6孔板中，并用含15%滅活FBS、青鏈霉素(青霉素100 U/mL，鏈霉素100 μg/mL)的DMEM培養(yǎng)液于5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到80%～90%時(shí)，棄去培養(yǎng)液，換為不含血清和雙抗的DMEM完全培養(yǎng)液。將一定體積4種shRNA(HK，AY318，AY444+559，AY857)重組腺病毒上清加入培養(yǎng)液中進(jìn)行過(guò)量感染，并設(shè)正常對(duì)照組。72 h后棄去培養(yǎng)液，加胰酶消化細(xì)胞，并離心收集細(xì)胞。用Trizol提取收集細(xì)胞的RNA，并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，用PCR擴(kuò)增試劑盒分別對(duì)GAPDH和α7nAchR擴(kuò)增，并用1%瓊脂糖凝膠電泳擴(kuò)增產(chǎn)物。目的基因表達(dá)相對(duì)量以α7nAchR與GAPDH灰度值的比值(α7nAchR/GAPDH)表示。引物序列如下：GAPDH上游引物：5′-ACAGCAACAGGGTGGTGGAC-3′，下游引物：5′-TTTGAGGGTGCA-GCGAACTT-3′；α7nAchR上游引物：5′-CCATACCCAGATGTCACCTAC-3′，下游引物：5′-CAGCAAGAATACCAGCAGAG-3′。

2 結(jié)果

2.1 質(zhì)粒pGenesil的酶切結(jié)果

質(zhì)粒pGenesil-1.1和pGenesil-1.4的BsaⅠ酶切結(jié)果見(jiàn)圖1，質(zhì)粒pGenesil-1.1-AY318和pGenesil-1.4-AY857的SacⅠ酶切結(jié)果見(jiàn)圖2。

M：DL2000 marker；1：pGenesil-1.1；2：pGenesil-1.4圖1 質(zhì)粒經(jīng)BsaⅠ酶切后的瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.1 Agarose gel electrophoresis of plasmid after digested by BsaⅠ

M：DL2000 marker；1、2：pGenesil-1.1-AY318；3、4：pGenesil-1.4-AY857圖2 重組質(zhì)粒pGenesil-shRNA經(jīng)SacⅠ酶切后的瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.2 Agarose gel electrophoresis of recombinant plasmid pGenesil-shRNA after digestion with SacⅠ

經(jīng)酶切結(jié)果分析：如圖1和圖2所示，質(zhì)粒pGenesil-1.1、pGenesil-1.4的結(jié)構(gòu)中只有1個(gè)SacⅠ酶切位點(diǎn)，而重組質(zhì)粒pGenesil-1.1-AY318，pGenesil-1.4-AY857能夠分別被限制性?xún)?nèi)切酶SacⅠ切出約1 000 bp和700 bp的DNA片段，說(shuō)明含有SacⅠ酶切位點(diǎn)的AY318 shRNA和AY857 shRNA已經(jīng)分別重組入質(zhì)粒pGenesil-1.1和pGenesil-1.4里。

2.2 AY318+857、AY444+559 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果

結(jié)果見(jiàn)圖3。

M：DL5000 marker；1：AY318+857；2：AY444+559圖3 AY318+857、AY444+559 PCR擴(kuò)增電泳圖Fig.3 Agarose gel electrophoresis of AY318+857 and AY444+559 shRNA amplification

2.3 重組質(zhì)粒pGenesil-1.3-AY318+857、pGenesil-1.2-AY444+559用HindⅢ和EcoRⅠ雙酶切結(jié)果

結(jié)果見(jiàn)圖4。

M：DL2000 marker；1：pGenesil-1.3-AY318+857；2：pGenesil-1.2-AY444+559圖4 重組質(zhì)粒pGenesil-1.3-AY318+857，pGenesil-1.2-AY444+559HindⅢ和EcoRⅠ雙酶切電泳圖Fig.4 Agarose gel electrophoresis of recombinant plasmid pGenesil-1.3-AY318+857 and pGenesil-1.2-AY444+559 after digestion with HindⅢ and EcoRⅠ

從圖3和圖4可知，AY318+857 shRNA，AY444+559 shRNA的大小約700 bp，且其中有HindⅢ和EcoRⅠ的酶切位點(diǎn)。因?yàn)橹亟M質(zhì)粒載體pGenesil-1.3-AY318+857和pGenesil-1.2-AY444+559能被限制性?xún)?nèi)切酶HindⅢ和EcoRⅠ酶切出一條約700 bp的DNA條帶，說(shuō)明目的基因片段已經(jīng)分別成功插入到質(zhì)粒載體里。

2.4 重組腺病毒質(zhì)粒載體pGSadeno-AY444+559、AY318、AY857 shRNA經(jīng)XbaⅠ單酶切結(jié)果

酶切結(jié)果分析：根據(jù)前期的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，shRNA如果插入腺病毒質(zhì)粒，將切出一條約2.5 kb的DNA條帶，如圖5示，可知目的克隆是正確的，并將其分別命名為AY444+559、AY318、AY857 shRNA。

M1：DL15000 marker；M2：DL2000 marker；1：pGSadeno-AY444+559 shRNA；2：pGSadeno-AY318 shRNA；3：pGSadeno-AY857 shRNA圖5 重組腺病毒質(zhì)粒載體pGSadeno-AY444+559、AY318、AY857 shRNA XbaⅠ酶切電泳圖Fig.5 Agarose gel electrophoresis of recombinant plasmid pGSadeno-AY444+559，AY318 and AY857 shRNA after digestion with XbaⅠ

2.5 重組腺病毒感染包裝細(xì)胞HEK293細(xì)胞

因?yàn)橹亟M腺病毒的DNA序列中有綠色熒光蛋白表達(dá)基因，在熒光顯微鏡下可以見(jiàn)到感染了重組腺病毒的HEK293細(xì)胞有綠色熒光蛋白表達(dá)，而正常細(xì)胞沒(méi)有(圖6)，說(shuō)明具有感染力的重組腺病毒包裝成功。

A：正常HEK293細(xì)胞；B：感染pGSadeno-HK shRNA的HEK293細(xì)胞；C：感染pGSadeno-AY318 shRNA的HEK293細(xì)胞；D：感染pGSadeno-AY444+559 shRNA的HEK293細(xì)胞；E：感染pGSadeno-AY857 shRNA的HEK293細(xì)胞圖6 重組腺病毒感染HEK293細(xì)胞(×200)Fig.6 Recombinant adenovirus infects HEK293 cells (×200)

2.6 重組腺病毒對(duì)GH3細(xì)胞α7nAchR mRNA表達(dá)的影響

從圖7分析可知，重組腺病毒能夠明顯抑制α7nAchR基因的表達(dá)。通過(guò)mRNA電泳條帶灰度分析發(fā)現(xiàn)，pGSadeno-AY857 shRNA的抑制效果最強(qiáng)(85%)，pGSadeno-AY318 shRNA的抑制效果次之(76%)，而pGSadeno-HK shRNA對(duì)α7nAchR基因的表達(dá)與正常GH3相比，幾乎沒(méi)有差異。故而篩選出pGSadeno-AY857 shRNA為理想的重組腺病毒載體。

3 討論

隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，科學(xué)家們對(duì)具有基因表達(dá)調(diào)控功能的小片段非編碼RNA在動(dòng)植物體內(nèi)的作用更加重視[4]。Fire等[5]在上世紀(jì)90年代率先通過(guò)小分子雙鏈RNA(double strand RNA，dsRNA)沉默特定序列基因證實(shí)了RNAi在新桿狀線蟲(chóng)中的存在，并且這種干擾效果是任何一條正義鏈或反義鏈的數(shù)倍。目前，研究者認(rèn)為該技術(shù)的原理主要是利用外源的小分子dsRNA通過(guò)特定載體轉(zhuǎn)移到被感染的細(xì)胞或動(dòng)植物體內(nèi)，被屬于Dicer家族的Rnase Ⅲ切割為只有21～23個(gè)核苷酸(nt)的小干擾RNA(small interference RNA，siRNA)，而這些siRNA通過(guò)核酸酶-RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合物(RNA-induced silencing complex，RISC)介導(dǎo)與之同源的mRNA降解[6]，從而達(dá)到沉默基因表達(dá)，抑制蛋白合成的作用。事實(shí)上，RNAi在基因表達(dá)的多個(gè)層面發(fā)揮作用，如轉(zhuǎn)錄后水平的RNAi主要是mRNA降解和啟動(dòng)子、內(nèi)含子失活而導(dǎo)致基因沉默；暴露于dsRNA后的基因組中同源基因序列的甲基化[7]；以及染色體結(jié)構(gòu)的改變層面影響基因表達(dá)。但是，轉(zhuǎn)錄后水平的RNAi機(jī)制更受到重視，也研究得更加透徹。運(yùn)用RNAi技術(shù)抑制靶基因的表達(dá)，從而驗(yàn)證靶蛋白在生物體中的作用及與之相關(guān)的機(jī)制成為現(xiàn)代生命科學(xué)領(lǐng)域的一種新方法。作為基因治療(Gene Therapy)的重要手段，應(yīng)用現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)通過(guò)人工體外合成的小干擾RNA可以沉默內(nèi)源性疾病基因的表達(dá)，這種方法比起那些效果不穩(wěn)定的小分子、蛋白和單克隆抗體更具可靠性，已經(jīng)成為現(xiàn)代基因治療技術(shù)研究的重要手段[8]。RNAi可以通過(guò)多種方式導(dǎo)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞，既可以合成21～23 bp長(zhǎng)度的siRNA，也通過(guò)可以表達(dá)shRNA的質(zhì)粒和病毒媒介系統(tǒng)[9]。Siolas等[10]的研究表明shRNA具有比siRNA更強(qiáng)的RNAi效果。RNAi具有高特異性、高效性沉默目的基因的特點(diǎn)[11]，已經(jīng)廣泛成為體內(nèi)和體外研究哺乳動(dòng)物基因功能的重要實(shí)驗(yàn)工具，尤其是致病基因的功能，如沉默基因帶來(lái)的一系列的細(xì)胞內(nèi)過(guò)程，包括細(xì)胞吞噬、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、凋亡和細(xì)胞循環(huán)等細(xì)胞功能紊亂過(guò)程。目前，有學(xué)者對(duì)RNAi在腫瘤性疾病[12]、感染性疾病[13]以及呼吸系統(tǒng)疾病[14]等多種疾病中的作用進(jìn)行研究，證實(shí)了RNAi作為一種基因沉默技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)和可靠性，也開(kāi)展了多項(xiàng)RNAi相關(guān)的基因治療臨床實(shí)驗(yàn)[15]。

M：DL2000 marker；1：正常GH3細(xì)胞；2：GH3細(xì)胞+pGSadeno-HK shRNA；3：GH3細(xì)胞+pGSadeno-AY318 shRNA；4：GH3細(xì)胞+pGSadeno-AY857 shRNA；5：GH3細(xì)胞+pGSadeno-AY444+559 shRNA圖7 重組腺病毒感染GH3細(xì)胞GAPDH(A)及α7nAchR(B)基因電泳圖Fig.7 GAPDH (A) and α7nAchR(B) mRNA expression in HEK293 cells infected by recombinant adenovirus

本實(shí)驗(yàn)中，選用可以誘導(dǎo)更穩(wěn)定的RNAi效果的shRNA，通過(guò)重組入腺病毒質(zhì)粒載體中，誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)與之同源的mRNA的降解，從而達(dá)到抑制特定基因表達(dá)的作用。為了設(shè)計(jì)出具有更佳基因沉默效果的shRNA，我們從GenBank查找出大鼠α7nAchR基因序列，根據(jù)siRNA的設(shè)計(jì)原則，分別選擇該基因的318位、857位、444位和559位為起始的堿基序列為模板，設(shè)計(jì)出能夠克隆該基因shRNA的DNA模板引物，導(dǎo)入pGenesil質(zhì)粒載體中。為了驗(yàn)證表達(dá)1條shRNA和同時(shí)表達(dá)2條shRNA對(duì)基因干擾的效果好壞，實(shí)驗(yàn)中同時(shí)設(shè)計(jì)了能夠編碼1條shRNA的質(zhì)粒載體pGenesil-1.1-AY318-shRNA，pGenesil-1.4-AY857-shRNA和能夠同時(shí)編碼2條shRNA的質(zhì)粒載體pGenesil-1.3-AY318+857-shRNA，pGenesil-1.2-AY444+559-shRNA。因?yàn)榫幋ashRNA的DNA模板和pGenesil質(zhì)粒上都有特殊的酶切位點(diǎn)，且pGenesil質(zhì)粒上有卡那霉素抗性基因，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)的DH5a細(xì)胞，并用含卡那霉素的培養(yǎng)液進(jìn)行重組質(zhì)粒篩選和克隆，用特定的限制性?xún)?nèi)切酶對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行酶切，并對(duì)酶切片段用1%瓊脂糖凝膠電泳，根據(jù)酶切的片段數(shù)目及大小確定重組質(zhì)粒是否成功。然而在病毒的質(zhì)粒中，shRNA可以獲得更持久、更穩(wěn)定的表達(dá)[16]，故而把pGenesil上的shRNA表達(dá)框轉(zhuǎn)移至腺病毒pGSadeno表達(dá)載體上，并用相似的技術(shù)驗(yàn)證轉(zhuǎn)移的成功與否。通過(guò)重組腺病毒感染GH3細(xì)胞，PCR反應(yīng)檢驗(yàn)α7nAchR基因的表達(dá)量，篩選出具有最佳基因沉默效果的AY857-shRNA。

本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建了多個(gè)能夠表達(dá)具有α7nAchR基因沉默效果的shRNA腺病毒表達(dá)載體，并明確pGSadeno-AY857-shRNA表達(dá)載體具有最佳的基因沉默效果，為進(jìn)一步研究該基因在慢性炎癥性代謝性疾病中的作用奠定了良好的基礎(chǔ)。

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(2016-08-04 收稿)

Construction of Eukaryotic Expression Vector for Short Hairpin RNA Targeting Gene of Rat α7nAchR and Production of Recombinant Adenovirus

Wang Dingkun1，Lu Fu’er2，Zou Xin2etal

1Department of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine，2Institute of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine，Tongji Hospital，Tongji Medical College，Huazhong University of Science and Technology，Wuhan 430030，China

Objective To construct eukaryotic expression vector for shRNA targeting gene of rat α7nAchR.Methods We designed and synthesized DNA templates(AY318，AY857，AY444+559，AY318+857)which would encode shRNA of α7nAchR.To construct recombinant plasmid vector which would encode one or two shRNA of α7nAchR，DNA templates listed were connected with linearized plasmid vector (pGenesil-1.1，pGenesil-1.4，pGenesil-1.2，pGenesil-1.3).To identify the recombinant plasmid vectors，DH5a cells were infected with the recombinant plasmid vectors，and plasmids from DH5a were extracted and electrophoresed in 1% agarose gel.To construct recombinant adenovirus plasmid，LR homologous recombination methodinvitrowas used to transfer AY318，AY444+559，AY857 shRNA expression cassettes of shRNA from pGenesil to pGSadeno from adenovirus plasmids，and a similar method was used to identify the recombinant adenovirus plasmid of pGSadeno.To obtain specific titer of recombinant adenovirus，we extracted DNA from the recombinant adenovirus and infected HEK293 cells increasingly.To identify the effect of α7nAchR gene silencing，we infected GH3 cells with the recombinant adenovirus and PCR was applied to detect the expression of α7nAchR mRNA in different groups(pGSadeno+AY318 shRNA，pGSadeno +AY857 shRNA，pGSadeno+AY444+559 shRNA，pGSadeno+HK shRNA and Normal group).Results We succssefully constructed the recombinant plasmids(pGenesil-AY318，AY857，AY318+857 and AY444+559 shRNA)and pGSadeno shRNA.HEK293 cells expressed green fluorescent protein under infection of recombinant adenovirus.The mRNA expression of α7nAchR was decreased in GH3 cells infected with the recombinant adenovirus(pGSadenoAY318，AY857，AY444+559 shRNA)，and pGSadeno-AY857 shRNA showed the best effect of α7nAchR gene silencing.Conclusion We have constructed the recombinant adenovirus of pGSadeno-α7nAchR-shRNA successfully，and pGSadeno-AY857 shRNA shows the best effect of gene interference.

α7nAchR； shRNA； gene interference； recombinant plasmid vector； recombinant adenovirus

*國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.81373872，No.81573785)

R34

10.3870/j.issn.1672-0741.2017.04.002

王定坤，男，1986年生，住院醫(yī)師，醫(yī)學(xué)博士，E-mail：wdkung@163.com

△通訊作者,Corresponding author，E-mail：wkf58@163.com