孫圖成， 周先吾， 李華東， 陳 澍， 許 菲 ， 蔣雄剛△

1廣東省心血管病研究所，廣東省人民醫(yī)院心血管外科，廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院,廣州 510080 2華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院心血管外科,武漢 430022 3武漢大學(xué)附屬中南醫(yī)院消化內(nèi)科,武漢 430071

c-Abl基因在AngⅡ誘導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞氧化應(yīng)激中的作用*

孫圖成1#， 周先吾2#， 李華東2， 陳 澍2， 許 菲3， 蔣雄剛2△

1廣東省心血管病研究所，廣東省人民醫(yī)院心血管外科，廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院,廣州 5100802華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院心血管外科,武漢 4300223武漢大學(xué)附屬中南醫(yī)院消化內(nèi)科,武漢 430071

目的 探討c-Abl基因在血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)誘導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞(VSMCs)氧化應(yīng)激中的作用。方法 構(gòu)建c-Abl基因過表達(dá)和沉默的慢病毒載體，并利用慢病毒轉(zhuǎn)染的方法構(gòu)建c-Abl過表達(dá)和沉默的VSMCs。實(shí)驗(yàn)分6組：①對照組、②AngⅡ組、③STI571組、④lenti-control組、⑤lenti-cAbl-shRNA組、⑥lenti-cAbl組。①～③組為正常VSMCs，③組用STI571預(yù)處理，④～⑥組為分別利用lenti-control、lenti-cAbl-shRNA、lenti-cAbl轉(zhuǎn)染VSMCs，對照組用生理鹽水干預(yù)，其余實(shí)驗(yàn)組用AngⅡ(1×10-7mol/L)干預(yù)30 min，并用Western blot測定c-Abl和p-cAbl蛋白表達(dá)量；活性氧測定：對照組用生理鹽水干預(yù)，其余實(shí)驗(yàn)組用AngⅡ(1×10-7mol/L)干預(yù)36 h，流式細(xì)胞儀分別檢測其活性氧分子(ROS)、二氫羅丹明(DHR)、二氫乙啶(DHE)水平。結(jié)果 AngⅡ刺激后，與對照組比較，lenti-cAbl組的c-Abl和p-cAbl蛋白表達(dá)最強(qiáng)，STI571組和lenti-cAbl-shRNA組p-cAbl蛋白表達(dá)最弱，而lenti-control組與AngⅡ組c-Abl和p-cAbl蛋白水平無明顯差異。AngⅡ干預(yù)36 h后，VSMCs氧化應(yīng)激產(chǎn)物(ROS、DHE、DHR)均增加，但lenti-cAbl組氧化應(yīng)激水平最高，lenti-cAbl-shRNA組、STI571組的氧化應(yīng)激水平較AngⅡ組有所降低。結(jié)論 利用慢病毒載體構(gòu)建過表達(dá)c-Abl基因的VSMCs細(xì)胞系獲得成功；c-Abl基因表達(dá)的增加與AngⅡ刺激下VSMCs的氧化應(yīng)激程度呈正相關(guān)。

慢病毒載體； c-Abl基因； 血管平滑肌細(xì)胞； 氧化應(yīng)激； 血管緊張素Ⅱ

主動(dòng)脈夾層的發(fā)病機(jī)制尚未完全明了，近年來研究表明，主動(dòng)脈壁中層血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cells，VSMCs)功能和結(jié)構(gòu)的改變可能是導(dǎo)致主動(dòng)脈夾層發(fā)生的原因之一[1]。

c-Abl基因編碼的Abelson酪氨酸激酶(c-Abl)屬于Src非受體酪氨酸激酶家族成員，其構(gòu)成細(xì)胞骨架，參與細(xì)胞轉(zhuǎn)化生長、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期、感染和免疫等病理生理過程[2-3]。c-Abl在靜息時(shí)為非活化狀態(tài)，而磷酸化后形成p-cAbl行使激酶功能。我們前期的研究證實(shí)c-Abl基因與VSMCs的生物學(xué)行為相關(guān)，Abl基因敲除導(dǎo)致Crk相關(guān)底物(CAS)蛋白磷酸化和粘附相關(guān)的支架蛋白表達(dá)下降，肌動(dòng)蛋白聚合受到抑制，VSMCs的張力降低[4]。同時(shí)，我們檢測主動(dòng)脈夾層患者的主動(dòng)脈標(biāo)本發(fā)現(xiàn)，與正常對照(心臟移植的供心)相比，夾層患者的主動(dòng)脈標(biāo)本中c-Abl活性和凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)均增加[5]。但c-Abl基因與VSMCs的氧化應(yīng)激的關(guān)系目前尚無研究報(bào)道。

為了研究c-Abl基因在血管緊張素Ⅱ(angiotensinⅡ，AngⅡ)誘導(dǎo)VSMCs氧化應(yīng)激中的作用，我們擬構(gòu)建c-Abl基因過表達(dá)和沉默的慢病毒載體，并轉(zhuǎn)染VSMCs，構(gòu)建c-Abl基因過表達(dá)和沉默的VSMCs，通過觀察不同c-Abl活性的VSMCs對AngⅡ誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激的反應(yīng)，從而進(jìn)一步揭示c-Abl基因在主動(dòng)脈夾層發(fā)生發(fā)展中的作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞

小鼠主動(dòng)脈VSMCs細(xì)胞：美國ATCC細(xì)胞庫中國代理公司；293T、HeLa細(xì)胞：中國科學(xué)院細(xì)胞庫。

1.2 主要實(shí)驗(yàn)試劑

lipo 2000、嘌呤霉素(Puromycin)：美國Invitrogen公司；DMEM高糖培養(yǎng)液、胎牛血清、opti-MEM：美國Gibco公司；表達(dá)質(zhì)粒：永聯(lián)生物科技(上海)有限公司；包裝質(zhì)粒：美國ADDGENE公司；DMSO、TBS緩沖液、青-鏈霉素雙抗、胰蛋白酶、AngⅡ：美國Sigma公司；信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑-571(STI571)：美國Selleck公司；c-Abl shRNA慢病毒顆粒、對照的shRNA慢病毒顆粒、copGFP對照的慢病毒顆粒：美國Santa Cruz公司；鼠抗β-actin抗體：天津三箭公司；兔抗P-CABL抗體：美國Assay Biotech公司；兔抗CABL抗體：美國Santa Cruz公司；活性氧檢測試劑盒、Dihydroethidium(超氧化物陰離子熒光探針)：上海碧云天公司；活性氧ROS熒光探針Dihydrorhodamine：南京凱基生物公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 慢病毒載體的構(gòu)建 (1)XbaⅠ和BamHⅠ分別酶切pUC57-cAbl和pCDH-EF1-MCS-T2A-PURO；(2)DNA凝膠電泳分別回收cAbl及pCDH骨架，大小分別為3 435 bp和7 066 bp；(3)利用T4連接酶對片段進(jìn)行連接；(4)連接上目的基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸埃希菌，讓目的基因在大腸埃希菌里擴(kuò)增，然后提取質(zhì)粒。

1.3.2 慢病毒包裝與濃縮 在準(zhǔn)備好的293T細(xì)胞中，加入表達(dá)質(zhì)粒及包裝質(zhì)粒(pCDH-EF1-PURO-cAbl∶pSpAX2.0∶pCMV-VSV-G = 12 μg∶8 μg∶4 μg)以及500 μL的無血清Opti-MEM，輕柔混勻后加入lipo2000室溫孵育，將DNA溶液和脂質(zhì)體溶液輕柔混勻，室溫孵育。293T細(xì)胞更換新鮮培養(yǎng)液后，加入上述的混合物，12 h后換液。轉(zhuǎn)染48～72 h后收集含病毒的上清液，離心后加入5×PEG-8000 NaCl母液(NaCl 8.766 g∶PEG-8000 50 g溶解于200 mL Milli-Q純水中)5 mL?；靹颉⑦^夜、離心、棄上清，加入適量的慢病毒溶解液溶解慢病毒沉淀。濃縮后的病毒懸液儲存于-80 ℃冰箱。

1.3.3 慢病毒滴度測定 將病毒按稀釋度分別為1∶105～109梯度稀釋，將稀釋好的病毒液接種于HeLa細(xì)胞中，接種病毒24 h后，加終濃度為0.3 μg/mL的嘌呤霉素處理細(xì)胞7 d后，選取合適的稀釋度，計(jì)數(shù)HeLa細(xì)胞的細(xì)胞集落個(gè)數(shù)，并計(jì)算病毒滴度。病毒滴度=細(xì)胞集落個(gè)數(shù)×病毒稀釋度(單位：TU/mL)。在本實(shí)驗(yàn)中，構(gòu)建的過表達(dá)慢病毒滴度為：1×1010TU/mL。

1.3.4 感染復(fù)數(shù)(MOI)的測定 將copGFP 對照的慢病毒顆粒在冰上解凍后，按MOI值分別為1、10、100的比例，把溶解的copGFP對照的慢病毒顆粒加入計(jì)數(shù)好的VSMCs中，12 h后換液繼續(xù)培養(yǎng)。24～48 h后熒光顯微鏡下觀察熒光強(qiáng)度，為下一步慢病毒轉(zhuǎn)染挑選出合適的MOI值。

1.3.5 構(gòu)建穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的VSMCs 將c-Abl shRNA慢病毒顆粒、對照的shRNA慢病毒顆粒、c-Abl慢病毒顆粒在冰上解凍后，分別按合適的MOI值加入VSMCs中，12 h后換液。24～48 h后加入嘌呤霉素進(jìn)行篩選，每3天換1次含有嘌呤霉素的培養(yǎng)液，1周后通過Western blot驗(yàn)證轉(zhuǎn)染細(xì)胞系是否成功構(gòu)建。

1.3.6 實(shí)驗(yàn)分組 實(shí)驗(yàn)分成6組：①對照組、②AngⅡ組、③STI571組、④lenti-control組、⑤lenti-cAbl-shRNA組、⑥lenti-cAbl組。①～③組為正常VSMCs，其中，③組加入終濃度為2×10-6mol/L的STI571預(yù)干預(yù)2 h；④～⑥組為分別利用lenti-control、lenti-cAbl-shRNA、lenti-cAbl慢病毒載體轉(zhuǎn)染的VSMCs。

1.3.7 Western blot檢測 分組同前，對照組進(jìn)行生理鹽水干預(yù)，其余各實(shí)驗(yàn)組加入AngⅡ(1×10-7mol/L)，30 min后收集各實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞，提取蛋白后-80℃冷凍。用BCA法測樣品蛋白濃度，計(jì)算所需蛋白量。依據(jù)要求加入蛋白樣品30 μg和蛋白marker 5 μL，制10%的SDS-PAGE分離膠和5%濃縮膠。電泳初始為60 V，待溴酚藍(lán)指示劑在2種膠分界處時(shí)電壓調(diào)至100 V。恒流280 mA轉(zhuǎn)移90 min。一抗孵育后加入相應(yīng)二抗(抗體稀釋比：β-actin 1∶8 000，兔抗P-CABL抗體1∶1 000，兔抗CABL抗體1∶500)?；瘜W(xué)發(fā)光，顯影和定影，曝光，得到膠片。實(shí)驗(yàn)結(jié)果判讀：陽性條帶以Quantity One 4.62版凝膠吸光度分析軟件進(jìn)行分析。

1.3.8 氧化應(yīng)激檢測 分組同前，對照組進(jìn)行生理鹽水干預(yù)，其余各實(shí)驗(yàn)組AngⅡ(1×10-7mol / L)處理，36 h后胰酶消化收集各組細(xì)胞后裝載探針。ROS檢測：稀釋DCFH-DA使終濃度為10 μL/L，細(xì)胞收集好后懸浮于配好的DCFH-DA中；DHE檢測：Dihydroethidium探針用DMSO稀釋成15 mmol/L儲存濃度，-20℃保存，按照1∶3 000用無血清培養(yǎng)液稀釋Dihydroethidium，使終濃度為5 μmol/L；DHR檢測：按照1∶300用無血清培養(yǎng)液稀釋Dihydrorhodamine，使終濃度為10 mmol/L。細(xì)胞濃度均為1×108/mL，在37℃培養(yǎng)箱中孵育細(xì)胞20 min；孵育終止后用無血清培養(yǎng)液洗滌3次，PBS重懸細(xì)胞，上機(jī)檢測；流式細(xì)胞儀各項(xiàng)數(shù)據(jù)分析采用WinMDI 2.9軟件進(jìn)行。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 質(zhì)粒圖譜

本研究設(shè)計(jì)的c-Abl過表達(dá)質(zhì)粒載體圖譜見圖1。

2.2 酶切驗(yàn)證

目的基因克隆PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果(圖2)，與設(shè)計(jì)的克隆片段大小相符。

2.3 病毒轉(zhuǎn)染MOI值測定

按MOI值分別為1、10、100的比例，把copGFP對照的慢病毒顆粒轉(zhuǎn)染VSMCs，培養(yǎng)24 h后換液，熒光顯微鏡下觀察到：隨著MOI值的倍增，細(xì)胞熒光的亮度增加，遂以MOI值100作為細(xì)胞感染密度(圖3)。

圖1 pCDH-EF1-MCS-T2A-Puro-cAbl質(zhì)粒圖譜Fig.1 Plasmid map of pCDH-EF1-MCS-T2A-Puro-cAbl

M:Marker;1:PCR產(chǎn)物圖2 pUC57-cAbl酶切圖Fig.2 Digestion of pUC57-cAbl by XbaⅠand BamHⅠ

2.4 轉(zhuǎn)染后過表達(dá)及沉默VSMCs的c-Abl和p-cAbl蛋白表達(dá)

6孔板培養(yǎng)不同組細(xì)胞，密度達(dá)到70%時(shí)，對除對照組外的實(shí)驗(yàn)組進(jìn)行AngⅡ(1×10-7mol/L)干預(yù)30 min(對照組用生理鹽水干預(yù)30 min)，并用Western blot測定c-Abl和p-cAbl蛋白表達(dá)量。由結(jié)果(圖4)可知：慢病毒可穩(wěn)定轉(zhuǎn)染并傳代，轉(zhuǎn)染后的c-Abl蛋白表達(dá)符合預(yù)期，AngⅡ刺激后，與對照組比較，過表達(dá)組(lenti-cAbl組)的c-Abl和p-cAbl蛋白表達(dá)最強(qiáng)(P<0.05，P<0.01)，c-Abl激活抑制組(STI571組)和沉默組(lenti-cAbl-shRNA組)p-cAbl蛋白表達(dá)最弱(均P<0.01)，而慢病毒對照組(lenti-control)與AngⅡ組無明顯差別(P>0.05),但均較對照的p-cAbl蛋白水平有明顯升高(均P<0.01)。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，慢病毒過表達(dá)VSMCs細(xì)胞系構(gòu)建成功。

A：MOI值=1；B：MOI值=10；C：MOI值=100圖3 不同MOI值的慢病毒轉(zhuǎn)染VSMCs后的熒光照片(×200)Fig.3 Fluorescence pictures of VSMCs transfected with lentivirus of different MOI values (×200)

1：對照組；2：AngⅡ組；3：STI571組；4：lenti-control組；5：lenti-cAbl-shRNA組；6；lenti-cAbl組；與對照組比較,*P<0.05 **P<0.01圖4 各實(shí)驗(yàn)組的c-Abl和p-cAbl蛋白表達(dá)Fig.4 Expression of c-Abl and p-cAbl protein in each experimental group

2.5 c-Abl對AngⅡ刺激下的VSMCs氧化應(yīng)激的影響

6孔板培養(yǎng)已分組的細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞密度為70%時(shí)，對除對照組外的實(shí)驗(yàn)組AngⅡ(1×10-7mol/L)干預(yù)36 h(對照組用生理鹽水干預(yù)36 h)后，流式細(xì)胞儀檢測各組氧化應(yīng)激水平(ROS、DHE、DHR)。流式細(xì)胞技術(shù)檢測氧化應(yīng)激結(jié)果(圖5、6、7)：AngⅡ干預(yù)后，VSMCs氧化應(yīng)激產(chǎn)物(ROS、DHE、DHR)均增加(均P<0.05)，lenti-cAbl組氧化應(yīng)激水平最高(均P<0.05)，lenti-cAbl-shRNA組、STI571組的氧化應(yīng)激水平較AngⅡ組有所減低(均P<0.05)。因此，c-Abl激酶活性與AngⅡ刺激下VSMCs的氧化應(yīng)激程度呈正相關(guān)。

A：各組ROS流式圖；B：各組ROS熒光強(qiáng)度柱狀圖；與AngⅡ組比較,*P<0.05；與Control組比較,#P<0.05 圖5 各實(shí)驗(yàn)組ROS強(qiáng)度差異Fig.5 Difference of ROS intensity in each experimental group

A：各組DHE流式圖；B：各組DHE熒光強(qiáng)度柱狀圖；與AngⅡ組比較,*P<0.05；與Control組比較,#P<0.05 圖6 各實(shí)驗(yàn)組DHE強(qiáng)度差異Fig.6 Difference of DHE intensity in each experimental group

A：.各組DHR流式圖；B：各組DHR熒光強(qiáng)度柱狀圖；與AngⅡ組比較,*P<0.05；與Control組比較,#P<0.05 圖7 各實(shí)驗(yàn)組DHR強(qiáng)度差異Fig.7 Difference of DHR intensity in each experimental group

3 討論

主動(dòng)脈夾層的發(fā)生與動(dòng)脈中層的退行性變相關(guān)，動(dòng)脈中層主要由VSMCs和細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)組成，其中VSMCs對維持主動(dòng)脈壁的完整性和收縮功能具有重要作用，其損傷或生物學(xué)行為的改變是主動(dòng)脈夾層產(chǎn)生的重要原因之一[6-7]。

慢病毒載體是一種以人類免疫缺陷Ⅰ型病毒為基礎(chǔ)發(fā)展起來的基因表達(dá)載體，可長時(shí)間、穩(wěn)定地表達(dá)外源基因。相比于腺病毒，其優(yōu)點(diǎn)在于可以有效地感染多種難感染的細(xì)胞，比如原代細(xì)胞、干細(xì)胞、神經(jīng)元細(xì)胞等，又很少引發(fā)機(jī)體免疫反應(yīng)，能達(dá)到良好的基因治療效果，具有廣闊的應(yīng)用前景[8-10]。在本實(shí)驗(yàn)中使用的是pCDH系列慢病毒載體，構(gòu)成過表達(dá)的重組慢病毒載體pCDH-EF1-MCS-T2A-Puro-cAbl，將慢病毒載體轉(zhuǎn)入到HeLa細(xì)胞，并用嘌呤霉素處理細(xì)胞7 d后，選取合適的稀釋度計(jì)算病毒滴度。

前期研究發(fā)現(xiàn)，c-Abl與VSMCs的生物學(xué)行為相關(guān)，c-Abl基因是Abelson小鼠白血病病毒原癌基因v-abl的同源基因，位于人的第9號染色體，其編碼蛋白的分子量為140 kD，分布于包括VSMCs、內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞在內(nèi)的多種細(xì)胞和組織的細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)中。c-Abl激活后使下游的Crk相關(guān)底物(p130CAS)磷酸化，而磷酸化的p130CAS與CrkⅡ及DOCK180蛋白形成復(fù)合體，是調(diào)節(jié)下游信號GTP結(jié)合蛋白Rac1的關(guān)鍵步驟，Rac1則通過作用于JNK和Nox調(diào)控相關(guān)基因表達(dá)[11]，參與細(xì)胞骨架重塑、DNA損傷和氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞轉(zhuǎn)化等生命活動(dòng)。在本實(shí)驗(yàn)中，我們驗(yàn)證了c-Abl在靜息時(shí)為非活化狀態(tài)，而磷酸化后形成p-cAbl實(shí)現(xiàn)激酶功能。信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑-571(STI571)可粘附于c-Abl的無活性構(gòu)象[12]，占據(jù)其激活環(huán)和螺旋αC之間的空間，防止激活環(huán)構(gòu)象改變，從而阻止c-Abl的磷酸化激活。實(shí)驗(yàn)中，我們利用shRNA下調(diào)了c-Abl表達(dá)，利用c-Abl激活抑制劑STI571抑制了c-Abl的活性成分p-cAbl。研究結(jié)果表明，下調(diào)c-Abl基因的表達(dá)，或降低其活性均可使AngⅡ?qū)е碌腣SMCs氧化應(yīng)激效應(yīng)降低，提示c-Abl基因在VSMCs過氧化損傷中的非保護(hù)性調(diào)控作用。

主動(dòng)脈夾層是兇險(xiǎn)復(fù)雜的大血管疾病，目前認(rèn)為主動(dòng)脈壁中層VSMCs的損傷在主動(dòng)脈夾層病變的形成過程中起到重要作用[13-14]，而大量過氧化物的產(chǎn)生可加重VSMCs的損傷。我們發(fā)現(xiàn)AngⅡ誘導(dǎo)的c-Abl激活是ROS依賴性的，并且c-Abl活性越高，其ROS產(chǎn)物越多。AngⅡ通過活化一種質(zhì)膜蛋白NAD(P)H氧化酶，并以此為第二信使，介導(dǎo)有絲分裂原的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而導(dǎo)致VSMCs增殖[15]。ROS可通過MAPKs通路、NF-κB通路調(diào)控MMP的表達(dá)，影響細(xì)胞外基質(zhì)的成分，改變彈性纖維的合成與降解過程[16-17]，這可能是引發(fā)夾層的原因之一。本實(shí)驗(yàn)中，c-Abl活性被抑制后，AngⅡ?qū)е碌腣SMCs氧化應(yīng)激水平也降低，VSMCs的損傷可能減少。因此，通過抑制c-Abl活性而阻斷AngⅡ誘導(dǎo)VSMCs的氧化應(yīng)激效應(yīng)，可能成為預(yù)防主動(dòng)脈夾層發(fā)生、發(fā)展的治療靶點(diǎn)。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)通過在DNA、RNA、蛋白質(zhì)3個(gè)水平觀察具有不同活性cAbl的VSMCs在AngⅡ刺激后的氧化應(yīng)激效果，發(fā)現(xiàn)c-Abl基因過表達(dá)的VSMCs，其AngⅡ刺激后的氧化應(yīng)激效應(yīng)增加，而c-Abl基因沉默和c-Abl活性抑制的VSMCs，其AngⅡ刺激后的氧化應(yīng)激效應(yīng)降低。這些結(jié)果提示c-Abl基因與AngⅡ誘導(dǎo)的VSMCs氧化應(yīng)激呈正相關(guān)。但其介導(dǎo)的具體信號通路和分子機(jī)制，尚需進(jìn)一步研究論證。

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(2017-04-22 收稿)

Role of c-Abl Gene in AngⅡ-induced Oxidative Stress of Vascular Smooth Muscle Cells

Sun Tucheng1#，Zhou Xianwu2#，Li Huadong2etal

1Guangdong Cardiovascular Institute，Guangdong General Hospital，Guangdong Academy of Medical Sciences，Guangzhou 510080，China2Department of Cardiovascular Surgery，Union Hospital，Tongji Medical College，Huazhong University of Science and Technology，Wuhan 430022，China

Objective To investigate the role of c-Abl gene in angiotensinⅡ(AngⅡ)-induced oxidative stress in vascular smooth muscle cells(VSMCs).Methods We constructed the c-Abl gene overexpression and silence lentiviral vectors and used lentivirus transfection method to construct c-Abl overexpression and silence VSMCs.The test group VSMCs were divided into six groups：control group，AngⅡ group，STI571 group，lenti-control group，lenti-cAbl-shRNA group，lenti-cAbl group (groups 1-6).Groups 1-3 were normal VSMCs，Group 3 was pretreated with STI571，and groups 4-6 were VSMCs transfected by lenti-control，lenti-cAbl-shRNA and lenti-cAbl，respectively.the control group was treated with normal saline for 30 min，while the other experimental groups were treated with AngⅡ(1×10-7mol/L)for 30 min，then we used Western blotting to detect the protein expression of c-Abl and p-cAbl.For determination of reactive oxygen species(ROS)，the control group was treated with normal saline，while the other experimental groups were treated with AngⅡ(1×10-7mol/L)for 36 h，then flow cytometry was used to detect the oxidative stress levels of reactive oxygen species(ROS)，dihydroethidium(DHE)and dihydrorhodamine(DHR)，respectively.Results Compared with the control group，the expression of p-cAbl protein was the highest in the lenti-cAbl group and the weakest in STI571 and lenti-cAbl-shRNA groups.There were no significant differences in the levels of c-Abl and p-cAbl protein between lenti-control group and AngⅡ group.ROS，DHE and DHR levels increased after 36 h of AngⅡ stimulation，but the oxidative stress level of lenti-cAbl group was the highest among all the groups.Compared with the AngⅡ group，the oxidative stress levels of lenti-cAbl-shRNA group and STI571 group were reduced.Conclusion The VSMCs with the overexpressing c-Abl gene was successfully constructed by lentiviral vector technique.The increase of c-Abl gene expression was positively correlated with the oxidative stress of VSMCs stimulated by AngⅡ.

lentiviral vector； c-Abl gene； VSMCs； oxidative stress; angiotensinⅡ

*國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.81370416)

R543.1

10.3870/j.issn.1672-0741.2017.04.003

#共同第一作者

孫圖成，男，1973年生，副教授，E-mail：suntucheng@126.com；周先吾，男，1991年生，醫(yī)學(xué)碩士，E-mali：zhouxianwu1991@hotmail.com

△通訊作者，Corresponding author，E-mail：jiangxionggang@hotmail.com