賀文煜， 袁昌勁

華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬武漢市中心醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合腫瘤科，武漢 430014

鼠尾草酸聯(lián)合他莫昔芬通過(guò)激活Caspase-3信號(hào)通路誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞凋亡

賀文煜， 袁昌勁△

華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬武漢市中心醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合腫瘤科，武漢 430014

目的 探討鼠尾草酸聯(lián)合他莫昔芬對(duì)乳腺癌細(xì)胞的影響及作用機(jī)制。方法 將乳腺癌細(xì)胞株MCF-7、T47D分為4組，對(duì)照組加入PBS，CA組加入鼠尾草酸，TAM組加入他莫昔芬，CA+TAM組加入鼠尾草酸和他莫昔芬。MTT增殖實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖能力，集落形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞集落形成能力，Transwell小室實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力，細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力，免疫印跡法檢測(cè)各組細(xì)胞Caspase-8、Caspase-3、PARP蛋白表達(dá)。結(jié)果 在0～20 μmol/L藥物濃度時(shí)，CA、TAM、CA+TAM呈劑量依賴性抑制乳腺癌細(xì)胞增殖，但藥物濃度為20 μmol/L與50 μmol/L對(duì)細(xì)胞增殖影響差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。CA+TAM組增殖抑制率明顯高于CA組和TAM組(均P<0.05)。MCF-7和T47D細(xì)胞中，CA組、TAM組、CA+TAM組集落形成率、侵襲細(xì)胞數(shù)、細(xì)胞遷移率顯著低于對(duì)照組(均P<0.05)；CA+TAM組集落形成率、侵襲細(xì)胞數(shù)、細(xì)胞遷移率顯著低于CA組和TAM組(均P<0.05)，CA組和TAM組集落形成率、侵襲細(xì)胞數(shù)、細(xì)胞遷移率比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。在2種乳腺癌細(xì)胞株中，對(duì)照組、CA組、TAM組、CA+TAM組cleaved Caspase-8蛋白表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)，CA組、TAM組、CA+TAM組cleaved Caspase-3、cleaved PARP蛋白表達(dá)顯著高于對(duì)照組(均P<0.05)，CA+TAM組cleaved Caspase-3、cleaved PARP蛋白表達(dá)顯著高于CA組和TAM組(均P<0.05)，CA組和TAM組cleaved Caspase-3、cleaved PARP蛋白表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。結(jié)論 鼠尾草酸聯(lián)合他莫昔芬能夠抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，其作用機(jī)制可能與激活Caspase-3/PARP信號(hào)通路有關(guān)。

鼠尾草酸； 乳腺癌； 他莫昔芬； 侵襲； 遷移； 增殖； 信號(hào)通路

乳腺癌發(fā)病率位居女性惡性腫瘤首位[1]，盡管近20年來(lái)乳腺癌的診療技術(shù)得到了極大的提高，但其遠(yuǎn)期生存率依然不容樂(lè)觀，其中放化療抵抗是導(dǎo)致乳腺癌治療失敗的主要原因[2]。他莫昔芬(tamoxifen，TAM)是乳腺癌內(nèi)分泌治療常用的藥物之一，對(duì)雌激素受體(ER)和孕激素受體(PR)均陽(yáng)性者有效率為60%～70%[3-4]。然而并非所有乳腺癌患者均能從TAM治療中獲益，特別是部分復(fù)發(fā)患者，乳腺癌細(xì)胞可能對(duì)TAM耐藥，導(dǎo)致治療失敗[5]。鼠尾草酸(carnosic acid，CA)是從唇形科植物迷迭香中提取的一種多酚類雙萜化合物，目前已證實(shí)CA具有廣泛的生物學(xué)活性，包括抗炎、抗菌、抗氧化和抗腫瘤等。有報(bào)道顯示[6]鼠尾草酸能抑制K562/AO2細(xì)胞膜上P糖蛋白的表達(dá)，有效逆轉(zhuǎn)人白血病細(xì)胞的多藥耐藥。然而關(guān)于CA對(duì)實(shí)體瘤的作用機(jī)制依然不清楚。本研究擬通過(guò)聯(lián)合CA、TAM處理乳腺癌細(xì)胞株，觀察其對(duì)細(xì)胞增殖、侵襲等生物學(xué)行為的影響及可能的作用機(jī)制，旨在為乳腺癌的治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞來(lái)源和培養(yǎng)

乳腺癌細(xì)胞系MCF-7、T47D和正常人乳腺細(xì)胞MCF-10A購(gòu)自美國(guó)菌種保藏中心(American Type Culture Collection，ATCC)，細(xì)胞接種于RPMI 1640培養(yǎng)液中(含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 mg/mL鏈霉素)，將培養(yǎng)液置于恒溫培養(yǎng)箱中，在37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)。細(xì)胞保持貼壁生長(zhǎng)，每隔2～3 d進(jìn)行1次傳代。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料

RPMI 1640培養(yǎng)液購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，鼠尾草酸、他莫昔芬(純度>98%)均購(gòu)自杭州大洋化工股份有限公司，RIPA裂解液、胰蛋白酶、二甲基亞砜(DMSO)、胎牛血清、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒購(gòu)自廣州碧云天生物技術(shù)研究所。BCA蛋白檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Thermo公司，Transwell小室、Matrigel人工基底膜購(gòu)自美國(guó)BD公司，鼠抗人Caspase-8抗體、鼠抗人cleaved Caspase-8抗體、鼠抗人Caspase-3抗體、鼠抗人cleaved Caspase-3抗體、鼠抗人PARP抗體、鼠抗人cleaved PARP抗體、鼠抗人GAPDH抗體購(gòu)自Santa Cruz公司，ECL顯色試劑盒購(gòu)自美國(guó)Pierce Biotechnology公司，聚烯酰胺、PVDF膜、十二烷基硫酸鈉購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 細(xì)胞分組及處理 實(shí)驗(yàn)前，將CA和TAM分別用DMSO稀釋成濃度為1、5、10、20、50 μmol/L，對(duì)照組加入等量PBS。按1×105/mL濃度將MCF-7、T47D、MCF-10A接種于6孔板中，1組加入等量DMSO作為對(duì)照，2組加入1 μmol/L CA或TAM或CA+TAM，3組加入5 μmol/L CA或TAM或CA+TAM，4組加入10 μmol/L CA或TAM或CA+TAM，5組加入20 μmol/L CA或TAM或CA+TAM，6組加入50 μmol/L CA或TAM或CA+TAM。將培養(yǎng)板置于37℃、5%CO2濕度恒溫培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

1.3.2 MTT增殖實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖能力 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，用不含胎牛血清的培養(yǎng)液調(diào)整濃度為1×105/mL，接種于96孔板，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，37℃、5%CO2濕度下培養(yǎng)。檢測(cè)前4 h，向每孔中加入MTT試劑(20 μL/孔)繼續(xù)孵育24 h，終止培養(yǎng)，1 000 g離心15 min，棄去上清液，每孔中加入150 μL DMSO溶解結(jié)晶物，室溫下振蕩15 min，置于酶標(biāo)儀上檢測(cè)570 nm處吸光度(A)值，以評(píng)價(jià)細(xì)胞生長(zhǎng)能力。

1.3.3 集落形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞集落形成能力 藥物處理的細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)7 d，將克隆細(xì)胞用PBS沖洗2次，4%多聚甲醛固定15 min，Gimsa染色30 min，流水輕輕洗去染液，空氣干燥后鏡檢。集落形成效率=克隆細(xì)胞數(shù)/接種細(xì)胞數(shù)×100%。

1.3.4 Transwell小室實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力 用不含血清的培養(yǎng)液將轉(zhuǎn)染后細(xì)胞濃度調(diào)整為1.0×105個(gè)/mL，Transwell上室每孔接種150 μL細(xì)胞，下室加入600 μL含有20%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液作為趨化劑，37℃培養(yǎng)48 h，多聚甲醛固定，蘇木精復(fù)染10 min，200倍熒光顯微鏡下觀察穿透濾膜的細(xì)胞數(shù)。

1.3.5 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力 將細(xì)胞接種于6孔板，待細(xì)胞融合度≥70%時(shí)進(jìn)行劃痕實(shí)驗(yàn)。用Marker筆在培養(yǎng)板后均勻劃間距為0.5 cm的橫線(確保每孔至少有4條線穿過(guò))，每孔中鋪1×105個(gè)細(xì)胞，細(xì)胞融合度≥80%時(shí)用無(wú)菌移液槍槍頭在單層細(xì)胞沿底部劃出“一”字劃痕，PBS沖洗3次，培養(yǎng)48 h后顯微鏡下測(cè)量劃痕的寬度，并計(jì)算細(xì)胞遷移率。

1.3.6 免疫印跡法(Western blot)檢測(cè)細(xì)胞Caspase-8、Caspase-3、PARP蛋白表達(dá) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，棄去培養(yǎng)液，PBS沖洗，加入離心管中，再加入1 mL細(xì)胞裂解液置于冰浴上裂解30 min，4℃條件下離心15 min，BCA蛋白濃度試劑盒檢測(cè)蛋白純度。將20 μg蛋白提取液置于10%SDS-PAGE電泳分離，常規(guī)濕法轉(zhuǎn)膜，加入5%脫脂牛奶封閉孵育2 h。加入相應(yīng)的抗體(1∶1 000)鼠抗人Caspase-8抗體、Caspase-3抗體、PARP抗體、GAPDH抗體，4℃孵育24 h。再滴加二抗37℃孵育2 h。PBS沖洗3次，按照ECL化學(xué)發(fā)光顯影試劑盒顯影，以GAPDH作為內(nèi)參照，分析目的條帶相對(duì)表達(dá)量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 CA聯(lián)合TAM對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖的影響

在藥物濃度為0～20 μmol/L時(shí)，CA、TAM、CA+TAM呈劑量依賴性抑制乳腺癌細(xì)胞增殖(圖1A、1B)，CA、TAM、CA+TAM處理后對(duì)正常乳腺細(xì)胞MCF-10A增殖率無(wú)明顯影響(均P>0.05，圖1C)。與空白組比較，當(dāng)藥物濃度達(dá)到10、20、50 μmol/L時(shí)能明顯抑制乳腺癌MCF-7、T47D細(xì)胞的增殖(均P<0.05)，其中10、20、50 μmol/L時(shí)CA+TAM組增殖抑制率明顯高于CA組和TAM組(均P<0.05)。進(jìn)一步分析顯示，20 μmol/L和50 μmol/L的藥物濃度對(duì)MCF-7、T47D細(xì)胞增殖率的影響差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)，因此本研究選擇濃度為20 μmol/L的CA和20 μmol/L的TAM進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

A：對(duì)MCF-7細(xì)胞增殖的影響；B：對(duì)T47D細(xì)胞增殖的影響；C：對(duì)MCF-10A細(xì)胞增殖的影響；與CA組比較，#P<0.05；與TAM組比較，*P<0.05圖1 不同濃度CA、TAM對(duì)細(xì)胞增殖的影響Fig.1 Effects of different concentration of CA and TAM on cell proliferation

2.2 CA聯(lián)合TAM對(duì)乳腺癌細(xì)胞集落形成的影響

在MCF-7和T47D細(xì)胞中，CA組、TAM組、CA+TAM組集落形成率顯著低于對(duì)照組(均P<0.05)；CA+TAM組集落形成率顯著低于CA組和TAM組(均P<0.05)，CA組和TAM組集落形成率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)，見(jiàn)圖2。

A：CA聯(lián)合TAM對(duì)MCF-7細(xì)胞集落形成的影響；B：CA聯(lián)合TAM對(duì)T47D細(xì)胞集落形成的影響；與Control組比較，▲P<0.05；與CA組比較，#P<0.05；與TAM組比較，*P<0.05圖2 CA聯(lián)合TAM對(duì)乳腺癌細(xì)胞集落形成的影響(Gimsa染色)Fig.2 Effects of CA combined with TAM on breast cell colony formation(Gimsa staining)

2.3 CA聯(lián)合TAM對(duì)乳腺癌細(xì)胞侵襲的影響

在MCF-7和T47D細(xì)胞中，CA組、TAM組、CA+TAM組侵襲細(xì)胞數(shù)顯著低于對(duì)照組(均P<0.05)；CA+TAM組侵襲細(xì)胞數(shù)顯著低于CA組和TAM組(均P<0.05)，CA組和TAM組侵襲細(xì)胞數(shù)比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)，見(jiàn)圖3。

2.4 CA聯(lián)合TAM對(duì)乳腺癌細(xì)胞遷移的影響

在MCF-7和T47D細(xì)胞中，CA組、TAM組、CA+TAM組細(xì)胞遷移率顯著低于對(duì)照組(均P<0.05)；CA+TAM組細(xì)胞遷移率顯著低于CA組和TAM組(均P<0.05)，CA組和TAM組細(xì)胞遷移率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)，見(jiàn)圖4。

A：CA聯(lián)合TAM對(duì)MCF-7細(xì)胞侵襲能力的影響；B：CA聯(lián)合TAM對(duì)T47D細(xì)胞侵襲能力的影響；與Control組比較，▲P<0.05；與CA組比較，#P<0.05；與TAM組比較，*P<0.05。圖3 CA聯(lián)合TAM對(duì)乳腺癌侵襲能力的影響(蘇木精-伊紅染色,×100)Fig.3 Effects of CA combined with TAM on breast cell invasion capacity (HE staining,×100)

A：CA聯(lián)合TAM對(duì)MCF-7細(xì)胞遷移能力的影響；B：CA聯(lián)合TAM對(duì)T47D細(xì)胞遷移能力的影響；與Control組比較，▲P<0.05；與CA組比較，#P<0.05；與TAM組比較，*P<0.05圖4 CA聯(lián)合TAM對(duì)乳腺癌細(xì)胞遷移能力的影響(×100)Fig.4 Effects of CA combined with TAM on breast cell migration capacity (×100)

2.5 CA聯(lián)合TAM對(duì)Caspase-3信號(hào)通路的影響

Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，MCF-7和T47D細(xì)胞中，對(duì)照組、CA組、TAM組、CA+TAM組cleaved Caspase-8蛋白表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)；CA組、TAM組、CA+TAM組cleaved Caspase-3、cleaved PARP蛋白表達(dá)顯著高于對(duì)照組(均P<0.05)；CA+TAM組cleaved Caspase-3、cleaved PARP蛋白表達(dá)顯著高于CA組和TAM組(均P<0.05)，CA組和TAM組cleaved Caspase-3、cleaved PARP蛋白表達(dá)比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)，見(jiàn)圖5。

A：MCF-7細(xì)胞凋亡蛋白表達(dá)水平；B：T47D細(xì)胞凋亡蛋白表達(dá)水平；與Control組比較，▲P<0.05；與CA組比較，#P<0.05；與TAM組比較，*P<0.05 圖5 各組細(xì)胞凋亡蛋白表達(dá)水平Fig.5 Expression of apoptosis-related protein in earch group

3 討論

TAM是治療乳腺癌的常用藥物，然而并非所有乳腺癌患者均能從TAM治療中受益，特別是TAM首次治療后復(fù)發(fā)的患者，由于TAM耐藥導(dǎo)致后期治療失敗。在過(guò)去的幾十年里，大量從自然界中提取的有效單體，如生物堿、多酚類、黃酮類等化合物在抗腫瘤治療中起到重要的作用。鼠尾草酸是從唇形科迷迭香中提取的一類多酚類化合物，研究證實(shí)鼠尾草酸除了具有抗氧化作用，還具有抗炎、抗菌、抗病毒等活性[7-8]。陶萍華等[9]報(bào)道稱鼠尾草酸能夠保護(hù)氧自由基損傷的肝細(xì)胞，其作用機(jī)制與激活PI3K/Akt-Nrf2通路有關(guān)。

鼠尾草酸能夠通過(guò)誘導(dǎo)抑癌基因表達(dá)、促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡、抑制腫瘤細(xì)胞增殖等方式發(fā)揮抗癌作用[10]。Kar等[11]報(bào)道稱鼠尾草酸以劑量和時(shí)間依賴性的方式抑制前列腺癌細(xì)胞的增殖，其作用機(jī)制與調(diào)節(jié)Akt/IKK/NF-κB通路激活磷酸酶2A有關(guān)。Roche等[12]則證實(shí)鼠尾草酸的結(jié)構(gòu)與β-連環(huán)蛋白酶抑制劑相似，在體內(nèi)發(fā)揮抗結(jié)直腸癌增殖作用。除了自身抗腫瘤活性外，鼠尾草酸亦有協(xié)同抗癌活性。李顥等[13]報(bào)道顯示鼠尾草酸與姜黃素、三氧化二砷等聯(lián)合使用，能夠誘導(dǎo)Bax、Caspase-3等基因表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)急性髓性白血病細(xì)胞的分化。本研究采用鼠尾草酸聯(lián)合他莫昔芬處理乳腺癌細(xì)胞，結(jié)果顯示CA、TAM、CA+TAM呈劑量依賴性抑制乳腺癌細(xì)胞增殖，且CA+TAM組增殖抑制率明顯高于CA組和TAM組，提示鼠尾草酸聯(lián)合他莫昔芬能夠抗乳腺癌細(xì)胞增殖。但是正常乳腺細(xì)胞MCF-10A增殖率無(wú)明顯變化，提示CA+TAM對(duì)正常乳腺細(xì)胞增殖影響小，具有較高的安全性，這亦為乳腺癌治療提供了一個(gè)新的思路。鼠尾草酸還具有逆轉(zhuǎn)耐藥的作用，Bobilev等[14]用20 μmol/L鼠尾草酸處理阿霉素耐藥的白血病細(xì)胞株AO2，結(jié)果顯示AO2細(xì)胞耐藥基因mdr1、p-gp明顯下調(diào)，使藥物外排減少，從而發(fā)揮逆轉(zhuǎn)耐藥的作用。由于本研究未選擇TAM耐藥乳腺癌細(xì)胞株進(jìn)行研究，因此尚無(wú)法判斷鼠尾草酸是通過(guò)協(xié)同抗癌還是抑制細(xì)胞耐藥發(fā)揮乳腺癌細(xì)胞增殖抑制的作用。

本研究進(jìn)一步分析了鼠尾草酸聯(lián)合他莫昔芬對(duì)乳腺癌細(xì)胞株水平運(yùn)動(dòng)能力的影響，結(jié)果顯示CA+TAM組集落形成率、侵襲細(xì)胞數(shù)、細(xì)胞遷移率均顯著低于CA組和TAM組，說(shuō)明鼠尾草酸聯(lián)合他莫昔芬具有抑制乳腺癌細(xì)胞運(yùn)動(dòng)和侵襲的作用，這也為乳腺癌遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和增殖提供了潛在的治療策略。研究表明鼠尾草酸能夠通過(guò)多種作用機(jī)制抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。Tai[15]等研究發(fā)現(xiàn)，鼠尾草酸能夠阻斷卵巢癌細(xì)胞的分裂周期，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。曲輝等[16]報(bào)道顯示鼠尾草酸通過(guò)抑制基底膜基質(zhì)蛋白的表達(dá)，發(fā)揮抑制腫瘤細(xì)胞遷移、侵襲的作用。Einbond等[17]采用不同劑量鼠尾草酸處理乳腺癌細(xì)胞株，結(jié)果發(fā)現(xiàn)低劑量時(shí)鼠尾草酸能夠抑制細(xì)胞中谷胱甘肽的表達(dá)，高劑量時(shí)不僅能夠誘導(dǎo)促凋亡蛋白的表達(dá)，還能抑制細(xì)胞周期調(diào)節(jié)基因和轉(zhuǎn)錄抑制因子的表達(dá)，抑制雌激素受體陰性的乳腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)。

雖然部分研究發(fā)現(xiàn)了鼠尾草酸的抗腫瘤活性，但是關(guān)于其作用機(jī)制依然報(bào)道較少。研究證實(shí)絕大多數(shù)腫瘤細(xì)胞的凋亡最后均通過(guò)Caspase通路完成[18-19]，包括Cyto C介導(dǎo)線粒體凋亡途徑和TNF-α介導(dǎo)的死亡受體凋亡通路。Caspase屬于白介素-1轉(zhuǎn)化酶家族，Caspase-8、Caspase-3是位于凋亡通路上的2個(gè)關(guān)鍵基因。Caspase-8對(duì)來(lái)自細(xì)胞外的凋亡誘導(dǎo)因子的刺激作出應(yīng)答，以啟動(dòng)細(xì)胞解體。Caspase-3則通過(guò)激活下游靶基因PARP，促進(jìn)細(xì)胞全面自殺性解體。Kamal等[20]報(bào)道稱Caspase-3/PARP和Caspase-8信號(hào)通路均參與了藥物性誘導(dǎo)的乳腺癌細(xì)胞凋亡，并上調(diào)下游Bax、Bad、Bcl-2等凋亡基因表達(dá)，抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖。為了進(jìn)一步證實(shí)鼠尾草酸聯(lián)合他莫昔芬抑制乳腺癌細(xì)胞可能的作用機(jī)制，本研究采用免疫印跡法檢測(cè)MCF-7和T47D細(xì)胞cleaved Caspase-8、cleaved Caspase-3、cleaved PARP蛋白表達(dá)，結(jié)果顯示4組細(xì)胞cleaved Caspase-8蛋白表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，CA+TAM組cleaved Caspase-3、cleaved PARP蛋白表達(dá)顯著高于CA組和TAM組，提示鼠尾草酸聯(lián)合他莫昔芬可能是通過(guò)激活Caspase-3/PARP信號(hào)通路抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖、侵襲。

綜上所述，鼠尾草酸聯(lián)合他莫昔芬能夠抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，且對(duì)正常乳腺細(xì)胞無(wú)明顯毒性作用，其作用機(jī)制可能與激活Caspase-3/PARP信號(hào)通路有關(guān)。但是本研究?jī)H進(jìn)行了體外細(xì)胞研究，其動(dòng)物體內(nèi)的安全性和有效性有待進(jìn)一步證實(shí)。

[1] Wojcinski S，Soliman A A，Schmidt J，et al.Sonographic features of triple-negative and non-triple-negative breast cancer[J].J Ultrasound Med，2012，31(10)：1531-1541.

[2] Vivek R，Thangam R，NipunBabu V，et al.Multifunctional HER2-antibody conjugated polymeric nanocarrier-based drug delivery system for multi-drug-resistant breast cancer therapy[J].ACS Appl Mater Interfaces，2014，6(9)：6469-6480.

[3] Barbieri S，Sonvico F，Como C，et al.Lecithin/chitosan controlled release nanopreparations of tamoxifen citrate：loading，enzyme-trigger release and cell uptake[J].J Control Release，2013，167(3)：276-283.

[4] Cho S K，Pedram A，Levin E R，et al.Acid-degradable core-shell nanoparticles for reversed tamoxifen-resistance in breast cancer by silencing manganese superoxide dismutase(MnSOD)[J].Biomaterials，2013，34(38)：10228-10237.

[5] 張慧敏，劉洋，周瑜輝，等.雙特異性磷酸酶1在乳腺癌及他莫昔芬耐藥病例中的表達(dá)變化[J].西安交通大學(xué)學(xué)報(bào)：醫(yī)學(xué)版，2016，37(5)：673-678.

[6] 于曉寧，李顥，陳學(xué)良，等.鼠尾草酸逆轉(zhuǎn)K562/A02細(xì)胞多藥耐藥的機(jī)制研究[J].中華血液學(xué)雜志，2010，31(6)：381-384.

[7] Basappa Maheswarappa N，Subbaiah V，Muthupalani M，et al.Antioxidant activity of carnosic acid and rosmarinic acid in raw and cooked ground chicken patties[J].J Sci Food Agric，2014，94(2)：273-279.

[8] 相啟森，孟旭，喬燕，等.鼠尾草酸對(duì)自由基誘導(dǎo)蛋白質(zhì)氧化損傷的保護(hù)作用[J].食品科學(xué)，2013，34(15)：281-284.

[9] 陶萍華，文曉林，王雅珍，等.鼠尾草酸延緩人胚肺二倍體成纖維2BS細(xì)胞衰老的實(shí)驗(yàn)研究[J].營(yíng)養(yǎng)學(xué)報(bào)，2014，36(3)：273-277.

[10] 曲輝，付姝麗，任立紅，等.鼠尾草酸聯(lián)合1，25-二羥基維生素D3對(duì)NB4細(xì)胞的影響[J].哈爾濱醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2011，45(5)：416-420.

[11] Kar S，Palit S，Ball W B，et al.Carnosic acid modulates Akt/IKK/NF-κB signaling by PP2A and induces intrinsic and extrinsic pathway mediated apoptosis in human prostate carcinoma PC-3 cells[J].Apoptosis，2012，17(7)：735-747.

[12] De la Roche M，Rutherford T J，Gupta D，et al.An intrinsically labile α-helix abutting the BCL9-binding site of beta-catenin is required for its inhibition by carnosic acid[J].Nat Commun，2012，3：680.

[13] 李顥，陳學(xué)良，李大慶，等.鼠尾草酸聯(lián)合三氧化二砷對(duì)HL-60細(xì)胞的影響[J].中華血液學(xué)雜志，2006，27(3)：194-196.

[14] Bobilev I，Novik V，Levi I，et al.The Nrf2 transcription factor is a positive regulator of myeloid differentiation of acute myeloid leukemia cells[J].Cancer Biol Ther，2011，11(3)：317-329.

[15] Tai J，Cheung S，Wu M，et al.Antiproliferation effect of Rosemary(Rosmarinus officinalis)on human ovarian cancer cellsinvitro[J].Phytomedicine，2012，19(5)：436-443.

[16] 曲輝，康凱，任立紅，等.鼠尾草酸對(duì)NB4細(xì)胞生長(zhǎng)及凋亡、分化作用的體外研究[J].中國(guó)血液流變學(xué)雜志，2011，21(3)：393-396.

[17] Einbond L S，Wu H A，Kashiwazaki R，et al.Carnosic acid inhibits the growth of ER-negative human breast cancer cells and synergizes with curcumin[J].Fitoterapia，2012，83(7)：1160-1168.

[18] Ito M，Kajino K，Abe M，et al.NP-1250，an ABCG2 inhibitor，induces apoptotic cell death in mitoxantrone-resistant breast carcinoma MCF7 cells via a caspase-independent pathway[J].Oncol Rep，2013，29(4)：1492-500.

[19] Zhou Y，Bi Y，Yang C，et al.Magnolol induces apoptosis in MCF-7 human breast cancer cells through G2/M phase arrest and caspase-independent pathway[J].Pharmazie，2013，68(9)：755-762.

[20] Kamal A，Tamboli J R，Ramaiah M J，et al.Quinazolino linked 4β-amidopodophyllotoxin conjugates regulate angiogenic pathway and control breast cancer cell proliferation[J].Bioorg Med Chem，2013，21(21)：6414-6426.

(2017-03-29 收稿)

Carnosic Acid Cooperates with Tamoxifen to Induce Apoptosis of Breast Cancer Cells through Caspase-3 Signaling Pathway

He Wenyu，Yuan Changjing△

Department of Oncology,Integrated Traditional Chinese and Western Medicine，The Central Hospital of Wuhan,Tongji Medical College,Huazhong University of Science and Technology，Wuhan 430014，China

Objective To explore the effect of carnosic acid combined with tamoxifen on breast cancer cells and the mechanism.Methods Breast cancer cell lines MCF-7，T47D were divided into 4 groups：PBS was given to control group，carnosic acid(CA)was added to CA group，tamoxifen(TAM)was added to TAM group，and CA+TAM group was treated with carnosic acid and tamoxifen.The proliferation ability was measured by MTT assay，the colony formation capacity was measured by colony formation assay，the invasion ability was measured by Transwell chamber assay，the migration ability was measured by wound-healing assay，the expression of Caspase-8，Caspase-3 and PARP protein were measured by Western blotting.Results CA，TAM and CA+TAM suppressed breast cancer cell proliferation with a dose-dependent manner.Compared with CA group and TAM group，the proliferation inhibitory rate of CA+TAM group was significantly increased(P<0.05).In MCF-7 and T47D cell lines，compared to control group，the rate of colony fromation，number of invasive cells and cell migration rate of CA，TAM，CA+TAM groups were significantly decreased(allP<0.05).These indexes mentioned above in CA+TAM group were significantly lower than those in CA group and TAM group(allP<0.05)，but there were no significant differences between CA group and TAM group (allP>0.05).In two breast cancer cell strains，the expression of cleaved Caspase-8 protein between control，CA，TAM and CA+TAM groups was not significantly different(P>0.05).Compared to control group，the expression levels of cleaved caspase-3，cleaved PARP protein in CA，TAM and CA+TAM groups were significantly increased(P<0.05)，and these protein levels were significantly higher in CA+TAM group than in CA and TAM group(allP<0.05).But there were no significant differences between CA group and TAM group(allP>0.05).Conclusion Carnosic acid combined with tamoxifen can suppress the proliferation，invasion and migration of breast cancer cells，and its mechanism may be related to the activation of Caspase-3/PARP signaling pathway.

carnosic acid； breast cancer； tamoxifen； invasion； migration； proliferation； signaling pahway

R737.9

10.3870/j.issn.1672-0741.2017.04.007

賀文煜，女，1986年生，住院醫(yī)師，碩士研究生，E-mail:hewenyu86@163.com

△通訊作者，Correspongding author,E-mail:13607169125@139.com