陳平 趙云龍 李英杰

肺癌是死亡率最高的癌癥之一，肺癌分為非小細胞肺癌和小細胞肺癌，其中80%屬于非小細胞肺癌[1]。肺腺癌屬于非小細胞肺癌，其侵襲和轉(zhuǎn)移是一個多步驟、多基因參與的復(fù)雜過程，在這一過程中有大量的基因發(fā)生改變。盡管早期診斷技術(shù)有了很大的發(fā)展，放化療技術(shù)不斷的進步，但肺癌的5年生存率仍然很低[2]。MicroRNA（miRNA）是一類非編碼小RNA，長度大約為22個核苷酸左右，越來越多的研究證明miRNA與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展存在著密切的相關(guān)性[3]。近年研究發(fā)現(xiàn)miR-218能在多種腫瘤中表達，包括肺癌、膀胱癌、鼻咽癌等，且發(fā)揮著癌基因或者抑癌基因的作用[4-6]，但其作用機制尚未清楚。因此，本實驗研究miR-218的功能，尋找它的靶點，探究其在肺癌中的作用機制，以期為肺癌的治療提供新的靶點和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 一般資料 選擇2015年6月-2016年6月解放軍總醫(yī)院第一附屬醫(yī)院手術(shù)切除的15例肺腺癌組織及其相應(yīng)的癌旁組織標本，年齡為32歲-77歲，中位年齡為53歲。按腫瘤-淋巴結(jié)-轉(zhuǎn)移（tumor-node-metastasis, TNM）分期，I期4例，II期5例，III期6例。所有患者手術(shù)前均未接受放療、化療及內(nèi)分泌治療。所有患者均己簽署知情同意書，手術(shù)切除部分組織用于浸泡福爾馬林中用于組織切片鑒定，其余組織馬上放入液氮中存儲待用。

1.2 試劑 肺腺癌細胞系A(chǔ)549、NCI-H1299、Calu-3、NCI-H2228、NCI-H1975、HCC4006、NCI-H23、NCI-H1435均購于ATCC，DMEM培養(yǎng)液購自Gibic公司，miR-218的抑制物（Anti-miR-218）和對照組（Negative control）；Robo-siRNA及對照組干擾片段均由上海吉瑪有限公司合成。轉(zhuǎn)染試劑Lipfectmine 2000購于Invitrogen公司，兔源性的一抗Robo1、E-cadherin、N-cadherin、鼠源性的一抗GAPDH抗體購自Santa Cruz公司，二抗均購自北京中杉金橋公司；TRIzol購自Invitrogen公司，反轉(zhuǎn)錄及PCR試劑盒購自TAKARA公司。Transwell小室購自美國corning公司。miRNA RT Kit和MiRNA qPCR kit購自上海天根生化公司。

1.3 方法

1.3.1 細胞培養(yǎng) 所用的肺腺癌細胞均用DMEM培養(yǎng)液（含10%胎牛血清，100 U/mL青霉素和0.1 mg/mL鏈霉素）培養(yǎng)，置于37oC、體積為5%的CO2培養(yǎng)箱中。

1.3.2 轉(zhuǎn)染 將Anti-miR-218和negative control，miR-218模擬物及miR-218陰性對照，Robo1-SiRNA和對照Si-Con片段分別與Lip2000混勻，在室溫條件下混勻靜置20 min后，慢慢滴入培養(yǎng)液中混勻，共培養(yǎng)細胞4 h后，換成新鮮的正常培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24 h，再用于后續(xù)實驗。AntimiR-218序列為：5′-ACAUGGUUAGAUCAAGCACAA-3′，Negtive control序列為：5′-UUGUACUACACAAAAGU ACUG-3′。Robo1 siRNA序列為：Sense: 5′-CCCAAGAT TGTCGATCAAdtdt-3′，Antisense：5′-UUGAUCGACA AUCUUGGGdtdt-3′。對照序列si-NC序列為：Sense：5'-AGCGCGCTTTGTAGGATTC-Gdtdt-3'；Antisense：5'-GCAATCCTACAAAGCGCGCTdtdt-3'。miR-218模擬物（mi R-218 mimics）序列為：5′-UUGUGCUUGAUCUAACCAUGU-3'，miR-218陰性對照（miR-218 negative control,miR-218NC）序列為：5'-UCACAACCUCCUAGAAAGAG UAGA-3'。

1.3.3 qRT-PCR檢測miRNA和mRNA的表達 用TRIzol提取經(jīng)轉(zhuǎn)染的A549，HCC4006細胞總RNA，分別測定RNA濃度及純度。采用上海天根生化公司的miRNA RT Kit將miRNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，按照上海天根生化公司的MiRNA qPCR kit說明進行miRNA的PCR反應(yīng)及定量分析。mRNA定量分析按照TAKARA公司反轉(zhuǎn)錄和定量PCR試劑盒說明書操作。Robo1定量PCR引物序列：Forward：5'-CCTGTGTCTACAGACAGCAACATGA-3'，Reverse：5'-GCACTGGAGGTGGTGGAAGA-3'；β-actin Forward：5'-AGCGAGCATCCCCCAAAGTT-3'；Reverse：5'-GGGCA CGAAGGCTCATCATT-3'。

1.3.4 蛋白質(zhì)印跡檢測蛋白的表達 細胞轉(zhuǎn)染培養(yǎng)24 h后，棄培養(yǎng)基，用PBS清洗細胞，加入蛋白裂解液RIPA，12,000 rpm離心15 min，吸取上清液待測。用BCA試劑盒定量蛋白濃度。在10%的SDS-PAGE凝膠中進行電泳（電壓100 V），之后在300 mA的電流下冰浴轉(zhuǎn)膜。轉(zhuǎn)膜后室溫下用5%BSA-TBST封閉PVDF膜1 h，在4oC條件下孵育一抗（1:1,000）過夜，0.1%的TBST洗3次，每次5 min。在室溫條件下與二抗共孵育1 h，0.1%的TBST洗3次，每次5 min。用化學(xué)發(fā)光法來檢測蛋白表達，試驗重復(fù)3次。

1.3.5 Transell實驗檢測細胞遷移及侵襲 轉(zhuǎn)染的細胞經(jīng)0.25%胰酶消化，用無血清DMEM培養(yǎng)基制成單細胞懸液，用細胞計數(shù)板計數(shù)。稀釋后，取400 μL（約含1×105個細胞）加入到Transwell上室中（孔徑為8 μm），在下室中加入500 μL含有15%FBS的DMEM培養(yǎng)液，細胞繼續(xù)培養(yǎng)20 h。用棉簽擦去上室的上表面細胞，PBS清洗2遍，無水甲醇固定20 min；室溫下用0.4%的結(jié)晶紫染液孵育2 h。在顯微鏡下拍照，每張膜隨機選取上、中、下各3個視野，進行統(tǒng)計分析，每組設(shè)3個重復(fù)。侵襲實驗唯一的區(qū)別在于在Transwell上室上表面涂有一層基質(zhì)膠，能夠模仿細胞外基質(zhì)。其他步驟與遷移實驗相同。

1.3.6 螢光素酶報告基因載體構(gòu)建 運用生物學(xué)信息軟件預(yù)測miR-218的靶基因，發(fā)現(xiàn)Robo1為候選靶基因之一。提取A549細胞基因組DNA，通過PCR擴增Robo1全長的3′UTR序列，擴展引物分別添加Xho I和Not I酶切位點。Xho I和Not I雙酶切PCR擴增產(chǎn)物，隨后將擴增片段連接到psiCHECK-2載體上。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)DH5α大腸桿菌，酶切鑒定正確的陽性克隆送測序。將構(gòu)建好的psiCHECK-2-ROBO1-3′UTR與Neg contrtol及Anti-miR-218（100 nmol/L）按Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑盒說明書操作進行共轉(zhuǎn)染A549；將構(gòu)建好的psiCHECK-2-ROBO1-3′UTR與miR-NC及miR-218 mimics（100 nmol/L）組嚴格按Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑盒說明書操作進行共轉(zhuǎn)染HCC4006，最后進行雙熒光素酶檢測。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 數(shù)據(jù)用SPSS 13.0軟件分析，用均數(shù)±標準差（Mean±SD）表示計量資料，組間比較采用t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MiRNA-218在肺癌組織和肺癌細胞株中的表達 通過定量PCR檢測了15例肺癌組織和15例癌旁組織內(nèi)miR-218的表達，結(jié)果顯示肺癌組織中miRNA-218的表達明顯低于癌旁組織（P＜0.05，圖1A）。對肺腺癌細胞株A549、NCI-H1299、Calu-3、NCI-H2228、NCI-H1975、HCC4006、NCI-H23、NCI-H1435中miRNA-218的檢測發(fā)現(xiàn)細胞株A549中miRNA-218的表達高于其他細胞中miRNA-218的表達，而HCC4006細胞中miRNA-218的表達最低（圖1B）。

2.2 抑制miR-218對肺癌細胞株中的遷移侵襲的影響 在肺癌細胞系A(chǔ)549中轉(zhuǎn)染Anti-miR-218的實驗組及對照組（negative control），用定量PCR檢測干擾后的效果，結(jié)果顯示：細胞轉(zhuǎn)染Anti-miR-218后，miR-218的表達明顯降低，為對照組的0.27倍（P＜0.05，圖2A）。為了證實miR-218對于細胞遷移侵襲的影響，細胞轉(zhuǎn)染后進行Transwell實驗，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染Anti-miR-218組，細胞遷移數(shù)為（123.26±9.17），對照組胞遷移數(shù)為（76.62±6.81）（P＜0.05，圖2B-圖2C）；細胞侵襲數(shù)Anti-miR-218實驗組為（102.83±11.67），對照組胞侵襲數(shù)為（62.43±8.44）（P＜0.05，圖2B-圖2C）。同時，我們在HCC4006細胞中轉(zhuǎn)染miR-218的模擬物（miR-218 mimics），結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染后，miR-218表達較對照組顯著升高（P＜0.05，圖2D）；轉(zhuǎn)染組細胞遷移數(shù)為（45.58±5.22），對照組胞遷移數(shù)為（73.31±8.95）（P＜0.05，圖2E-圖2F）；轉(zhuǎn)染組細胞侵襲數(shù)為（26.84±3.67），對照組胞侵襲數(shù)為（56.53±5.46）（P＜0.05，圖2E-圖2F）。上述的遷移侵襲結(jié)果說明抑制miR-218能夠顯著增強A549細胞的遷移侵襲能力；過表達miR-218能夠顯著抑制HCC4006細胞的遷移侵襲能力。

圖1 miRNA-218在組織和細胞中的表達情況。A：qPCR檢測miR-218在肺癌組織及癌旁組織中的表達情況；B：qPCR檢測miR-218在肺癌細胞系中的表達情況。Fig 1 Expression of miRNA-218 in tissues and cells. A: qPCR analysis of miR-218 expression in lung cancer tissues and adjacent tissues; B: qPCR analysis of miR-218 expression in lung cancer cell lines.

2.3 肺癌細胞中miR-218的靶基因預(yù)測 通過Targetscan和MiRanda軟件預(yù)測miR-218的靶基因，我們發(fā)現(xiàn)miR-218能夠識別Robo1基因的3'UTR區(qū)（圖3A）。我們應(yīng)用qPCR和蛋白印跡方法，分別檢測干擾miR-218后，A549肺癌細胞中Robo1的表達情況；過表達miR-218后，HCC4006細胞中Robo1的表達情況。結(jié)果顯示Anti-miR-218組中Robo1的mRNA表達是對照組的2.87倍（圖3B，P＜0.05）；Western blot結(jié)果顯示Anti-miR-218組中Robo1的蛋白表達量明顯高于對照組（圖3C），結(jié)果提示我們抑制miR-218增加了A549細胞中Robo1的表達。在HCC4006細胞中轉(zhuǎn)染miR-218 mimics，發(fā)現(xiàn)miR-218表達顯著降低，為對照組的0.48倍（圖3D，P＜0.05）；Western blot結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染組中Robo1的蛋白表達量明顯低于對照組（圖3E）。我們進一步用雙熒光素酶報告基因?qū)嶒烌炞CmiR-218靶基因的準確性，將Anti-miR-218與psiCheck2-Robo1-3'UTR或?qū)φ召|(zhì)粒共轉(zhuǎn)染A549細胞；將miR-218 mimics與psiCheck2-Robo1-3'UTR或?qū)φ召|(zhì)粒共轉(zhuǎn)染 HCC4006細胞培養(yǎng)，培養(yǎng)48 h后，檢測熒光素表達水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在A549細胞中抑制miR-218能夠顯著增強Robo1的轉(zhuǎn)錄活性，而對照組的熒光素酶的表達不受影響（圖3F，P＜0.05）；在HCC4006細胞中過表達miR-218能夠顯著抑制Robo1的轉(zhuǎn)錄活性（圖3G，P＜0.05）。結(jié)果提示miR-218能與Robo1基因的3'UTR區(qū)有結(jié)合，影響Robo1的表達。

2.4 miR-218通過Robo1調(diào)控肺癌細胞的侵襲能力 為了驗證miRNA-218是否通過Robo1來調(diào)控細胞的侵襲能力，我們在A549細胞中將侵襲實驗分為4個組，分別為：Negative control+Robo1的Si-NC組為第1組，Anti-miRNA-218+Robo1的Si-NC組為第2組，Negative control+Si-Robo1組為第3組，Anti-miRNA-218+Si-Robo1組為第4組。每組分別共轉(zhuǎn)染A549細胞，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后。再用Transwell小室按照細胞侵襲實驗步驟進行操作。結(jié)果顯示第2組與第1組比較，穿越Matrigel膠的細胞數(shù)明顯增多，分別為[ (102.82±11.67), (66.43±8.45) ]（圖4A-圖4B，P＜0.05）；第3組細胞數(shù)為（44.36±7.02）與第1組比較明顯減少（圖4A-圖4B，P＜0.05）；第4組細胞數(shù)為（58.62±9.15），與第1組比較沒有統(tǒng)計學(xué)意義。在HCC4006中將侵襲實驗也分為4組，分別為miR-NC+Si-NC組為A組，miRNA-218+Si-NC組為B組，miR-NC+Si-Robo1組為C組，miR-218+Si-Robo1組為D組。結(jié)果顯示A組穿越Matrigel膠的細胞數(shù)（86.53±11.58），B組穿越Matrigel膠的細胞數(shù)（47.87±9.05），C組細胞數(shù)為（51.56±7.89），D組細胞數(shù)為（78.55±8.94）。B組及C組分別與A組比較差異顯著，有統(tǒng)計學(xué)意義（圖4C-圖4D，P＜0.05）；D組與A組比較沒有顯著差異。提示miR-218是通過調(diào)控Robo1的表達來影響細胞的侵襲。

圖2 MiR-218影響肺癌細胞的遷移侵襲能力。A：qPCR檢測在A549細胞中干擾miR-218后，miR-218的表達；B：干擾miR-218后，細胞的遷移侵襲實驗（20×）；C：干擾miR-218后，A549細胞遷移侵襲數(shù)量的統(tǒng)計分析；D：qPCR檢測在HCC4006細胞中轉(zhuǎn)染miR-218 mimics后，miR-218的表達情況；E：轉(zhuǎn)染miR-218 mimics后，HCC4006細胞的遷移侵襲實驗（20×）；F：轉(zhuǎn)染miR-218 mimics后，HCC4006細胞的遷移侵襲數(shù)量的統(tǒng)計分析。Fig 2 MiR-218 affect the migration and invasion of lung cancer cells. A: qPCR analysis of miRNA-218 expression in A549 cell after transfected with Anti-miR-218; B: Transwell assay analysis of A549 cell after transfected with Anti-miR-218 (20×); C: Statistical analysis the migrated and invaded A549 cells after transfected with Anti-miR-218; D: qPCR analysis of miRNA-218 expression in HCC4006 cell after transfected with miR-218 mimics;E: Transwell assay analysis of HCC4006 cell after transfected with miR-218 mimics (20×); F: Statistical analysis the migrated and invaded HCC4006 cells after transfected with miR-218 mimics.

圖3 MiR-218靶基因的預(yù)測及驗證。A：miR-218與Robo1的3'UTR結(jié)合示意圖；B：干擾miR-218后，Robo1的mRNA變化情況；C：干擾miR-218后，Robo1蛋白的表達變化；D：qPCR檢測在HCC4006細胞中轉(zhuǎn)染miR-218 mimics后，Robo1的mRNA表達；E：在HCC4006細胞中轉(zhuǎn)染miR-218 mimics后，Robo1的蛋白表達；F、G：雙熒光素酶檢測miR-218對Robo1轉(zhuǎn)錄活性的影響，其中F：干擾miR-218；G：過表達miR-218。Fig 3 Predicting and verifying the target genes of miR-218. A: Schematic diagram for binding of miR-218 in 3’UTR of Robo1; B: qPCR analysis of Robo1 expression after Anti-miR-218 transfection; C: The protein level of Robo1 after Anti-miR-218 transfection; D: qPCR analysis of Robo1 expression in HCC4006 cell after transfected with miR-218 mimics; E: The protein level of Robo1 in HCC4006 cell after transfected with miR-218 mimics; F, G: Luciferase reporter assay analysis of the transcription activity of Robo1 in cells transfected with Anti-miR-218 (F) or over-expressed with miR-218 (G).

3 討論

肺癌是世界上最常見的惡性腫瘤之一。隨著現(xiàn)代化在我國進程的快速發(fā)展，肺癌的發(fā)病率呈持續(xù)升高的態(tài)勢。盡管目前臨床上對腫瘤診治水平有了很大的進步，但針對肺癌的有效治療效果不顯著[7]。由于肺癌的發(fā)生發(fā)展機制目前并不清楚，患者生存預(yù)后較差。因此，深入研究肺癌發(fā)生發(fā)展的分子機制十分必要。

MiRNA參與到腫瘤的發(fā)生發(fā)展已被證實[8]。其中，miR-218不僅在多種組織中（如脂肪、皮膚等）發(fā)揮著重要的作用[9-11]。在人類多種惡性腫瘤中miR-218能夠影響腫瘤細胞的增殖和凋亡，起著抑癌基因的作用[4-6]。本研究通過qPCR證明了miR-218在肺癌患者組織中是低表達的。已有的研究[12,13]發(fā)現(xiàn)在人類多種腫瘤中miR-218均為低表達，并推測miR-218起著抑癌基因的作用。在肺癌中，有研究[4]認為miR-218低表達的是由于其甲基化作用的結(jié)果，并且miR-218是影響NSCLC生存和無復(fù)發(fā)預(yù)后的獨立因素。本研究在miR-218高表達的A549細胞中抑制miR-218的表達發(fā)現(xiàn)細胞的轉(zhuǎn)移侵襲功能增強，這與以前的研究[14,15]結(jié)論相似。

MiR-218靶基因眾多，包括Ecop、PAXILLIN、Robo1等，意味著miR-218有多種的調(diào)控通路。有研究已證實miRNA-218能通過調(diào)控Robo1參與多種癌癥細胞侵襲和轉(zhuǎn)移[6,16]。在結(jié)直腸癌細胞中，miR-218可通過下調(diào)Bmi1的表達抑制細胞的增殖，促進細胞凋亡[17]。Wu等[4]研究發(fā)現(xiàn)miR-218通過靶向調(diào)控Paxillin基因表達來影響口腔鱗癌患者的生存及預(yù)后。miR-218可直接結(jié)合于ECOP的mRNA 3'-UTR，抑制ECOP基因表達，從而達到抑制膠質(zhì)瘤細胞增殖的結(jié)果[18]?？梢妋iR-218可參與多種調(diào)控腫瘤轉(zhuǎn)移的機制中，但在肺癌中的調(diào)控機制尚不明確。

Robo1是軸突導(dǎo)向性受體，近來研究發(fā)現(xiàn)Robo1參與調(diào)控腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移[12,19,20]。我們用軟件預(yù)測確實顯示Robo1為miR-218靶基因之一，因此我們推測miR-218-Robo1通路可能也參與調(diào)控肺癌的侵襲和轉(zhuǎn)移。我們通過外源性miR-218的抑制物瞬時干擾A549細胞中miR-218的表達，顯著抑制了Robo1的表達。然后通過雙熒光素酶報告基因?qū)嶒炦M一步驗證miR-218能夠調(diào)控Robo1的轉(zhuǎn)錄活性，這些結(jié)果都明在肺癌細胞A549中Robo1是miR-218下游的靶基因之一。用miR-218抑制劑和Robo1的SiRNA同時轉(zhuǎn)染細胞，發(fā)現(xiàn)抑制了miR-218增強細胞侵襲的能力，進一步證明了miR-218通過抑制Robo1的表達從而調(diào)控腫瘤細胞的遷移侵襲功能。在乳腺癌、胃癌和鼻咽癌等癌癥中，同樣存在miR-218-Robo1通路，且參與了調(diào)控腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移[6,17,21]。

圖4 MiR-218通過調(diào)控Robo1影響肺癌細胞的侵襲能力。A：Anti-miR-218和Si-Robo1及其對照組后，A549細胞侵襲能力的改變（20×）；B：侵襲細胞的統(tǒng)計結(jié)果；C：轉(zhuǎn)染miR-218 mimics和Si-Robo1及其對照組后，HCC4006細胞侵襲能力的改變（20×）；D：HCC4006細胞侵襲能力統(tǒng)計結(jié)果分析。Fig 4 MiR-218 can influence the invasion ability of lung cancer cells by regulating Robo1 expression. A: Comparing the invasion ability of A549 cell transfect with Anti-miR-218 or Si-Robo1 to their control (20×); B: Statistical analysis of invaded cells in A549; C: Comparing the invasion ability of HCC4006 cell transfect with Anti-miR-218 or Si-Robo1 to their control (20×); D: Statistical analysis of invaded cells in HCC4006.

綜上所述，Robo1基因是miR-218的靶基因之一，miR-218能夠通過調(diào)控Robo1基因的表達影響肺癌細胞的遷移侵襲，提示miR-218可通過調(diào)控下游靶基因來影響肺癌的發(fā)生發(fā)展。因此，miR-218可作為肺癌分子治療中潛在的靶點，為臨床治療提供一個新思路及理論基礎(chǔ)。