陶艷紅 姚斌彬 于天源 馬馳 魯夢(mèng)倩 張林峰 呂桃桃 吳帥

·論著·

撥法對(duì)CCI模型大鼠外周血清中IL-1β以及脊髓中5-HT2A表達(dá)的影響

陶艷紅 姚斌彬 于天源 馬馳 魯夢(mèng)倩 張林峰 呂桃桃 吳帥

目的從行為學(xué)和形態(tài)學(xué)角度探索撥法對(duì)CCI模型大鼠感覺(jué)功能恢復(fù)的影響。方法采用推拿手法模擬儀定性、定量模擬手法，對(duì)CCI模型大鼠進(jìn)行干預(yù)。通過(guò)光熱耐痛閾分析大鼠行為學(xué)改善情況，ELISA法測(cè)定血清中IL-1β含量的變化，Western blot法檢測(cè)脊髓中5-HT2A受體的相對(duì)蛋白表達(dá)情況。結(jié)果撥法治療組造模后7天的光熱耐痛閾數(shù)值與模型組無(wú)差異(P>0.05)，經(jīng)過(guò)撥法治療20次后(即造模后28天)，二者之間有顯著差異(P<0.05)，且撥法組逐漸接近正常組水平。ELISA法檢測(cè)血清中IL-1β的含量：造模后7天，模型組和撥法組IL-1β含量均顯著高于正常組，經(jīng)過(guò)撥法治療20次后，撥法組IL-1β與模型組相比顯著性下降(P<0.05)。Western blot法測(cè)定脊髓中5-HT2A的相對(duì)蛋白表達(dá)含量:撥法治療20次后，撥法組脊髓中5-HT2A相對(duì)蛋白表達(dá)含量明顯上調(diào)，且已接近正常組水平(P>0.05)，高于模型組水平(P<0.05)。結(jié)論經(jīng)過(guò)撥法治療，可明顯上調(diào)CCI模型大鼠的光熱耐痛閾值，減輕其痛覺(jué)過(guò)敏狀態(tài)；下調(diào)CCI模型大鼠外周血清中促炎性細(xì)胞因子IL-1β的表達(dá)，達(dá)到“消炎鎮(zhèn)痛”的作用；上調(diào)脊髓中5-HT2A受體的表達(dá)，對(duì)中樞鎮(zhèn)痛起到一定作用。

撥法； 神經(jīng)病理性疼痛； 坐骨神經(jīng)慢性壓迫損傷模型； 白細(xì)胞介素1β； 五羥色胺2A受體

周圍神經(jīng)損傷是臨床中的常見(jiàn)病癥，其可引起神經(jīng)病理性疼痛[1](neuropathic pain， NPP)已被證實(shí)，主要以痛覺(jué)過(guò)敏、自發(fā)性疼痛、異常疼痛等感覺(jué)功能障礙為主要表現(xiàn)。由于其發(fā)病的多樣化，發(fā)病機(jī)制尚未闡明，故為科研課題中的難點(diǎn)之一。本團(tuán)隊(duì)前期實(shí)驗(yàn)研究表明，推拿干預(yù)治療是一種安全性高、非侵襲性的非藥物治療方法，其能有效改善周圍神經(jīng)損傷大鼠的行為學(xué)指標(biāo)，促進(jìn)軸漿運(yùn)輸功能的恢復(fù)，促進(jìn)軸突再生及神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的表達(dá)[2]，保護(hù)神經(jīng)元，修復(fù)神經(jīng)髓鞘[3]等，然而關(guān)于推拿干預(yù)的效應(yīng)機(jī)制尚不完全明確。本實(shí)驗(yàn)采用坐骨神經(jīng)慢性壓迫損傷(chronic constriction injury of the sciatic nerve,CCI)模型[4]大鼠，通過(guò)觀察其行為學(xué)的改變，應(yīng)用ELISA法以及Western blot法，檢測(cè)推拿干預(yù)后血清中促炎性細(xì)胞因子IL-1β[5]以及脊髓中5-HT2A受體[6-7]蛋白的表達(dá)情況，定性定量地探討撥法對(duì)周圍神經(jīng)操作功能恢復(fù)的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

選取清潔級(jí)SD大鼠(由北京思貝福實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科技有限公司提供)，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(北京)2011-0004，體重(160±10)g，雄性，48只。購(gòu)入后，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。之后采用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)法，利用隨機(jī)數(shù)字表將48只SD大鼠隨機(jī)分為4組，即正常組12只、假手術(shù)組12只、模型組12只、撥法組12只。

1.2 造模方法

1.2.1 器械 手術(shù)剪、止血鉗、鑷子、小號(hào)持針器、棉簽、燒杯、托盤(pán)、5 mL注射器、一次性塑膠手套、口罩、醫(yī)用縫合針及非吸收性外科縫線(上海醫(yī)用縫合針廠)、薇喬抗菌縫線4～0[8]。

1.2.2 藥品 水合氯醛(天津市福晨化學(xué)試劑廠)、碘伏消毒液(北京四環(huán)衛(wèi)生藥械廠有限公司出品)、甲醛溶液(廣東汕頭市西隴化工廠)、0.9%氯化鈉注射液。

1.2.3 造模 假手術(shù)組：分離暴露左側(cè)坐骨神經(jīng)中段、不結(jié)扎，逐層消毒后行常規(guī)縫合。模型組、撥法治療組：按照Bennett和Xie的方法，建立CCI動(dòng)物模型。(1)10%水合氯醛300～350 mg/kg腹腔注射麻醉大鼠；(2)大鼠右側(cè)俯臥位置于鼠板上，以右側(cè)股骨中點(diǎn)為中心，2 cm為直徑，備皮、消毒；(3)從左側(cè)大腿中部股骨外緣與股骨平行的方向切開(kāi)皮膚；(4)肌間隙鈍性分離肌間筋膜；(5)暴露坐骨神經(jīng)主干；(6)在坐骨神經(jīng)分叉前游離6 mm左右，(7)用4～0鉻制羊腸線間隔1 mm環(huán)繞結(jié)扎4道，松緊程度以引起小腿肌肉輕微顫動(dòng)且不影響神經(jīng)外膜血運(yùn)為宜。(8)術(shù)畢，生理鹽水沖洗，逐層消毒，縫合皮膚。(9)術(shù)后將大鼠置于保溫毯上，等待蘇醒，禁食禁水24小時(shí)。

1.3 治療方法

正常組： 常規(guī)喂養(yǎng)。假手術(shù)組： 行假手術(shù)，常規(guī)喂養(yǎng)。模型組：慢性坐骨神經(jīng)壓窄性損傷造模，不做任何處理，常規(guī)喂養(yǎng)。撥法治療組： (1)治療方法： 于造模后第7天開(kāi)始治療。每天用按摩推拿手法模擬儀(專利號(hào)：200710187403.1)定性模擬撥法，依次刺激大鼠患側(cè)殷門(mén)、承山、陽(yáng)陵泉穴。每穴各刺激3分鐘，每只總計(jì)9分鐘。按摩頭為光滑的接觸面，直徑10 mm。(2)治療次數(shù)： 每天1次，共20次。

1.4 指標(biāo)檢測(cè)

1.4.1 行為學(xué)檢測(cè) 光熱耐痛閾檢測(cè)：評(píng)價(jià)大鼠溫度覺(jué)和痛覺(jué)恢復(fù)情況。測(cè)試過(guò)程需保持安靜，室溫20～25℃。測(cè)試前將大鼠置于檢測(cè)盒內(nèi)，待其適應(yīng)環(huán)境后，用輻射燈光源照射其足跖中后1/3處，按下開(kāi)始按鈕，待大鼠抬腳時(shí)計(jì)時(shí)自動(dòng)停止，記錄此時(shí)時(shí)間，作為大鼠熱痛縮腿反應(yīng)潛伏期。為防止大鼠組織熱灼傷，設(shè)定光源自動(dòng)切斷時(shí)間為20秒。每側(cè)下肢測(cè)定2次，取其平均值。

1.4.2 形態(tài)學(xué)坐骨神經(jīng)HE染色 將展片40℃恒溫烤箱中烤片12小時(shí)，烤干備用；使用二甲苯脫蠟；梯度乙醇水化；水洗3分鐘；蘇木精染液染色3分鐘，以染核；再水洗3分鐘；鹽酸乙醇分色3～5秒。帶粉紅色后立即取出；水洗30秒；在碳酸鋰飽和液中提插10下，細(xì)胞核變?yōu)樗{(lán)色后水洗1分鐘；伊紅染液染色1分鐘后水沖洗；梯度乙醇脫水；二甲苯透明；中性樹(shù)膠封片。

1.4.3 ELISA法檢測(cè) 采集大鼠腹主動(dòng)脈血5 mL，室溫靜置約1～2小時(shí)后，用離心機(jī)以3000 r/min離心15分鐘，即可分離出血清，移液槍取出血清，-20℃封存待用。采用ELISA試劑盒測(cè)定血清中IL-1β 濃度。

1.4.4 Western blot法檢測(cè) 取大鼠L3～L5腰膨大脊髓背角，稱量50～100 mg組織放在玻璃勻漿器中，加入500～l000 μL RIPA裂解液，裂解液中加PMSF(1 mM)，在冰上進(jìn)行勻漿，直至勻漿充分無(wú)塊狀；提取蛋白，棄去沉淀，-80℃保存?zhèn)溆?。進(jìn)行蛋白質(zhì)電泳、轉(zhuǎn)膜封閉劑雜交，曝光鑒定，進(jìn)行掃描膠片，用Quantity One圖像分析軟件分析目標(biāo)條帶的光密度值。

以上每項(xiàng)指標(biāo)檢測(cè)均每組隨機(jī)選取6只大鼠進(jìn)行。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，率的比較用卡方檢驗(yàn)，均數(shù)比較用方差分析，組間兩兩比較方差齊時(shí)用Bonferroni檢驗(yàn)，方差不齊時(shí)用Tamhane’s T2檢驗(yàn)，P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠患肢光熱耐痛閾的變化情況

各組大鼠光熱耐痛閾結(jié)果(見(jiàn)表1)：造模后7天的撥法組、模型組與正常組相比，閾值明顯下調(diào)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，說(shuō)明坐骨神經(jīng)慢性壓迫性損傷后，大鼠出現(xiàn)熱痛覺(jué)過(guò)敏現(xiàn)象，對(duì)感覺(jué)功能造成一定影響。假手術(shù)組與正常組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，說(shuō)明只切開(kāi)肌肉，未結(jié)扎坐骨神經(jīng)的大鼠一周左右的時(shí)間即可逐漸恢復(fù)。撥法治療20次(28天)后，撥法組的光熱耐痛閾值雖然仍低于正常組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，但其與模型組的光熱耐痛閾值相比，已有顯著性升高(P<0.05)，說(shuō)明撥法可以減輕CCI模型大鼠的痛覺(jué)過(guò)敏狀態(tài)。

表1 各組大鼠光熱耐痛閾比較秒)

注： 與正常組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05。

2.2 光鏡觀察HE染色結(jié)果

造模后7天：正常組、假手術(shù)組可見(jiàn)完好無(wú)損的髓鞘及軸索；模型組軸索崩解。

撥法治療20次：正常組、假手術(shù)組可見(jiàn)結(jié)構(gòu)完整的神經(jīng)纖維髓鞘及軸索；模型組軸索崩解，髓鞘破碎；撥法組鏡下可見(jiàn)有序排列的神經(jīng)纖維以及清晰完整的軸索。見(jiàn)圖1。

圖1 各組大鼠勢(shì)撥法治療20次后坐骨神經(jīng)形態(tài)觀察(×400)

2.3 血清IL-1β的含量

CCI模型大鼠血清IL-1β的含量比較結(jié)果(見(jiàn)表2)：造模后7天的撥法組、模型組與正常組相比，血清中IL-1β表達(dá)上升，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；假手術(shù)組與正常組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。撥法治療20次后，撥法組大鼠血清中IL-1β雖與正常組有一定差距(P<0.05)，但與模型組相比已有顯著性下降(P<0.05)。

表2 各組大鼠血清IL-1β的含量比較

注： 與正常組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05。

2.4 脊髓中5-HT2A的蛋白相對(duì)表達(dá)情況

CCI模型大鼠脊髓中5-HT2A蛋白相對(duì)表達(dá)量結(jié)果(見(jiàn)表3、圖2)：造模后7天，撥法組與模型組相比，CCI模型大鼠脊髓中5-HT2A受體蛋白的表達(dá)量無(wú)差異(P>0.05)；二者與正常組相比，蛋白表達(dá)明顯下降(P<0.05)。撥法治療20次后，撥法組大鼠脊髓中5-HT2A受體蛋白表達(dá)含量與正常組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，但撥法組與模型組相比，5-HT2A蛋白表達(dá)含量已明顯上調(diào)(P<0.05)。

表3 各組大鼠脊髓中5-HT2A蛋白相對(duì)表達(dá)量的比較

注： 與正常組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05。

圖2 各組大鼠脊髓中5-HT2A蛋白Western Blot條帶分析結(jié)果圖

3 討論

隨著推拿臨床醫(yī)技的發(fā)展，推拿所治療的疾病范圍逐漸拓寬，但臨床中以頸椎病、腰椎間盤(pán)突出等傷科類疾病較為多見(jiàn)，這些疾病的發(fā)展或多或少都會(huì)累及周圍神經(jīng)的損傷。而周圍神經(jīng)損傷臨床癥狀主要表現(xiàn)為感覺(jué)功能與運(yùn)動(dòng)功能障礙，周圍神經(jīng)損傷患者常因病灶局部或四肢遠(yuǎn)端的疼痛、麻木、無(wú)力等主訴就診，運(yùn)用推拿治療，可針對(duì)病變部位及受累部位，進(jìn)行“局部-整體”的結(jié)合治療，能夠緩解、治療患者的疼痛，取得滿意的療效。同時(shí)因其痛苦小、療效好、無(wú)不良反應(yīng)，已逐漸受到患者的認(rèn)可，成為臨床上傷科類疾病非手術(shù)療法中最為常用的治療手段。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為疼痛多由經(jīng)絡(luò)循行受阻、氣血瘀滯所致，即不通則痛。撥法是運(yùn)用較廣的外治法之一，對(duì)于緩解肌肉的痙攣?zhàn)饔眯詮?qiáng)，傷科疾病中應(yīng)用十分廣泛，當(dāng)作用于神經(jīng)干處，可以通過(guò)撥動(dòng)神經(jīng)干及周圍肌肉韌帶，達(dá)到治療遠(yuǎn)端肢體的麻木或疼痛癥狀[9]的作用。本次研究為推拿解決感覺(jué)功能障礙的機(jī)理研究，因此選用撥法，相對(duì)其他手法，能更加直接、有效地作用于治療部位，針對(duì)性更強(qiáng)。

有相關(guān)研究表明，外周感受區(qū)的NPP常伴有炎癥反應(yīng){10}，在相應(yīng)的損傷部位可檢測(cè)到炎性介質(zhì)；另有研究證實(shí)抗炎癥藥物能夠減輕慢性NPP[11]，認(rèn)為炎癥因子在周圍神經(jīng)系統(tǒng)損傷引起的神經(jīng)病理性痛中具有重要作用。近年來(lái)國(guó)內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)，IL-1β是促炎性細(xì)胞中的代表性因子[12]，其作用與疼痛關(guān)系密切，尤其影響慢性疼痛的發(fā)生與發(fā)展過(guò)程。外周刺激可降低血清中IL-1β的含量，從而起到消除炎癥的作用。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示，經(jīng)過(guò)撥法治療20次后，撥法組的IL-1β與模型組相比有顯著性下降，說(shuō)明撥法干預(yù)可以下調(diào)促炎性細(xì)胞因子IL-1β的表達(dá)，進(jìn)而起到“消炎鎮(zhèn)痛”的作用。

5-HT是生物體內(nèi)廣泛分布的單胺類神經(jīng)遞質(zhì)，與多種疾病的發(fā)生密切相關(guān)，如疼痛、焦慮、抑郁、偏頭痛、高血壓、嘔吐等，其中5-HT與疼痛的關(guān)系備受關(guān)注。5-HT受體可分為7種亞型，即5-HT1-7受體，其中5-HT2受體又可分為5-HT2A受體、5-HT2B受體和5-HT2C受體(5-HT2A受體參與疼痛的產(chǎn)生或調(diào)控已被證實(shí))。大量疼痛模型的實(shí)驗(yàn)也表明5-HT2A受體是傷害性信息向中樞傳遞的重要神經(jīng)遞質(zhì)[13]，在大鼠的脊髓中，外周刺激如電針、火針等，可使5-HT2A受體的表達(dá)增加，產(chǎn)生突觸后抑制作用，繼而產(chǎn)生鎮(zhèn)痛作用[14]。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示，撥法治療20次后，撥法組脊髓中5-HT2A相對(duì)蛋白表達(dá)含量明顯上調(diào)，且已接近正常組水平(P>0.05)，高于模型組水平(P<0.05)，說(shuō)明作為外周刺激的一種方式，撥法可刺激5-HT2A受體在脊髓中的表達(dá)，從而起到中樞鎮(zhèn)痛作用。

本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果揭示，經(jīng)過(guò)撥法治療，可明顯減輕CCI模型大鼠的痛敏狀態(tài)，修復(fù)受損的軸突；下調(diào)血清中促炎性細(xì)胞因子IL-1β的表達(dá)，達(dá)到“消炎鎮(zhèn)痛”的作用；上調(diào)脊髓中5-HT2A受體的表達(dá)，對(duì)中樞鎮(zhèn)痛起到一定作用。雖然撥法通過(guò)CCI模型大鼠探究NPP相關(guān)疾病的治療過(guò)程取得了一定成果，但仍需進(jìn)一步全面深入地研究，以期更加清晰地闡明其作用機(jī)制，開(kāi)拓更廣泛的應(yīng)用前景。

[9] 于天源，林彩霞，付國(guó)兵，等.按摩推拿學(xué)[M].3版.北京：中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué)出版社，2012.

(本文編輯： 董歷華)

EffectofBo’famethodontheexpressionofIL-1βinperipheralserumand5-HT2AinspinalcordofCCImodelrats

TAOYanhong，YAOBinbin，YUTianyuan，etal.

SchoolofAcupunctureMoxibustionandTuina,BeijingUniversityofChineseMedicine，Beijing100029，China

Correspondingauthor:YUTianyuan,E-mail:yutianyuan@sina.com

ObjectiveExplore the effects of Bo’fa method on the recovery of sensory function of the CCI model rats from the behavior and morphology.MethodsThe CCI model rats were intervened qualitatively and quantitatively by the massage simulation instrument. The variation of rats’ behavior was analyzed through the solar-thermal pain threshold. The changes of the IL-1β in the serum were measured by ELISA. And we detected the relative protein expression of 5-HT2Areceptor in the spinal cord by Western blot.ResultsThere was no significant difference in the results of solar-thermal pain threshold between the Bo’fa method group and the model group at the 7thday after modeling (P>0.05). After twenty times of Bo’fa method treatment, the difference between the two groups became statistically significant (P<0.05), and the results were at or near the normal group level. At the 7thday after modeling, the levels of IL-1β in serum measured by ELISA in the model group and the Bo’fa method group were significantly higher than those in the normal group. After 20 times of Bo’fa method treatment, the levels of IL-1β in the Bo’fa method group declined significantly compared with those in the model group(P<0.05). The relative protein expression of 5-HT2Ain the spinal cord was measured by the method of Western blot. The results of this experiment indicated that, after 20 times of Bo’fa method treatment, the relative protein expression of 5-HT2Ain the spinal cord in the Bo’fa method group increased significantly higher than that in the model group (P<0.05), and became close to that in the normal group (P>0.05).ConclusionBo’fa method treatment can increase obviously the values of solar-thermal pain threshold of CCI model rats, ease the recovery of sensory function, decrease the expression of pro-inflammatory cytokine IL-1β in peripheral serum of the CCI model rats to eliminate the inflammation of NPP. Moreover, Bo’fa method can increase the expression of 5-HT2Areceptor in the spinal cord, playing an important role in the analgesia of central nerves.

Bo’fa method； Neuropathic pain； CCI model； IL-1β； 5-HT2A

國(guó)家自然科學(xué)基金青年基金(81403497)；國(guó)家自然科學(xué)基金(81373759)

100029 北京中醫(yī)藥大學(xué)針灸推拿學(xué)院[陶艷紅(碩士研究生)、姚斌彬、于天源、馬馳(碩士研究生)、魯夢(mèng)倩、張林峰(碩士研究生)、呂桃桃(碩士研究生)、吳帥(碩士研究生)]

陶艷紅(1991- )，女，2014級(jí)在讀碩士研究生。研究方向：推拿治療周圍神經(jīng)損傷的機(jī)理研究。E-mail：635421798@qq.com

于天源(1965- )，博士，教授，博士生導(dǎo)師。研究方向：推拿治療周圍神經(jīng)損傷的機(jī)理研究。E-mail：yutianyuan@sina.com

R244

A

10.3969/j.issn.1674-1749.2017.08.001

2016-11-23)