羅國平，梁宇柱，閆夢茹，張存勞，孟會寧，吳環(huán)環(huán)，宋 靜

(1.西安醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院，西安 710021； 2.西安中糧工程研究設(shè)計院有限公司，西安 710082； 3.山東步長醫(yī)藥銷售有限公司，山東 菏澤 274418)

HPLC法測定牡丹籽油中游離型和結(jié)合型α-亞麻酸、亞油酸及油酸的含量

羅國平1，梁宇柱2，閆夢茹1，張存勞1，孟會寧3，吳環(huán)環(huán)1，宋 靜1

(1.西安醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院，西安 710021； 2.西安中糧工程研究設(shè)計院有限公司，西安 710082； 3.山東步長醫(yī)藥銷售有限公司，山東 菏澤 274418)

采用高效液相色譜(HPLC)法測定牡丹籽油中游離型、結(jié)合型α-亞麻酸、亞油酸及油酸的含量。檢測條件為Agilent C18高效色譜柱(3.0 mm×50 mm， 2.7 μm)，流動相乙腈-0.1%磷酸水溶液(體積比85∶15)，流速1 mL/min，檢測波長203 nm，柱溫35℃，進樣量20 μL。結(jié)果表明，該方法精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性良好。α-亞麻酸在41.4～207 μg/mL范圍內(nèi)，其峰面積與質(zhì)量濃度呈良好的線性關(guān)系；亞油酸在20.2～101 μg/mL范圍內(nèi)，其峰面積與質(zhì)量濃度呈良好的線性關(guān)系；油酸在14.9～74.6 μg/mL范圍內(nèi)，其峰面積與質(zhì)量濃度呈良好的線性關(guān)系。牡丹籽油樣品中，游離型α-亞麻酸、亞油酸和油酸的平均含量分別為4.47、1.89 mg/mL和0.92 mg/mL，結(jié)合型α-亞麻酸、亞油酸和油酸的平均含量分別為437、237 mg/mL和156 mg/mL。建立的方法具有分離效率高、選擇性好和條件溫和的優(yōu)點。

牡丹籽油；α-亞麻酸；亞油酸；油酸；高效液相色譜法

牡丹(PaeoniasuffruticosaAndr.)是毛茛科芍藥屬灌木，牡丹籽油因具有豐富的營養(yǎng)，又有醫(yī)療保健功效，被稱為植物油中的珍品[1-2]。牡丹籽油中含有α-亞麻酸、亞油酸、油酸、維生素E等多種營養(yǎng)成分[3]。牡丹籽油中α-亞麻酸、亞油酸和油酸3種不飽和脂肪酸含量高低可作為評價牡丹籽油保健作用強弱的指標之一。

據(jù)查，牡丹籽油中脂肪酸有兩種存在形式，游離型脂肪酸和結(jié)合型脂肪酸。前者的含量一般遠遠低于后者，但是牡丹籽油在儲存過程會因儲存條件不當或者儲存時間過長導(dǎo)致部分脂肪酸由結(jié)合型分解為游離型。目前，脂肪酸多采用氣相法進行定量分析，該方法存在一些不足：一是需將樣品甲酯化[4-6]，影響因素多，容易導(dǎo)致反應(yīng)不完全；二是在分析過程中由于柱溫較高，易使亞油酸和α-亞麻酸的雙鍵斷裂或產(chǎn)生雙鍵的異構(gòu)化現(xiàn)象[7]；三是未將游離型脂肪酸和結(jié)合型脂肪酸加以區(qū)分。為此，筆者采用高效液相色譜(HPLC)法[8-10]，在相同色譜條件下，分別采用兩種方法制備供試品溶液，第一種方法為取牡丹籽油加甲醇超聲溶解，離心后取上清液進樣，測定的是游離型脂肪酸的含量；第二種方法為牡丹籽油先堿水解、皂化，反應(yīng)完全后酸化，用正己烷萃取，萃取液除去正己烷，最后用甲醇溶解后進樣，測定的是游離型脂肪酸和結(jié)合型脂肪酸含量之和，減去第一種方法中測得的游離型脂肪酸含量，即可得到結(jié)合型脂肪酸的含量。該方法具有分離效率高、選擇性好、條件溫和的特點，可分別測定游離型脂肪酸和結(jié)合型脂肪酸的含量。目前，采用HPLC法測定牡丹籽油中脂肪酸含量的文獻報道較少，鮮有采用此方法分別測定牡丹籽油中游離型、結(jié)合型的α-亞麻酸、亞油酸及油酸含量的研究報道，故本文所述方法具有一定的學(xué)術(shù)和實際意義。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 原料與試劑

牡丹籽油，自制；α-亞麻酸(批號21967)、亞油酸(批號B21421)和油酸(批號B21592)對照品，購自上海源葉生物科技有限公司；乙腈為色譜純；磷酸為分析純；水為超純水；其他試劑均為分析純。

1.1.2 儀器與設(shè)備

1260型高效液相色譜儀，安捷倫；UV-2012型紫外可見分光光度計，尤尼柯(上海)儀器有限公司；KQ-5200E型超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；ALC-210.4型精密電子天平，賽多利斯。

1.2 試驗方法

1.2.1 溶液的配制

1.2.1.1 油酸、亞油酸和α-亞麻酸混合對照品溶液的制備

分別取α-亞麻酸對照品約100 mg、亞油酸對照品約50 mg、油酸對照品約37 mg，精密稱定，置50 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，搖勻后精密吸取混合液1 mL，置于10 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，即得混合對照品溶液(α-亞麻酸質(zhì)量濃度為207 μg/mL，亞油酸質(zhì)量濃度為101 μg/mL，油酸質(zhì)量濃度為74.6 μg/mL)。

1.2.1.2 供試品溶液的配制

供試品溶液1：精密移取牡丹籽油125 μL，置25 mL容量瓶中，加甲醇23 mL，超聲30 min，充分溶解，放冷后用甲醇定容至刻度，搖勻，即得。

供試品溶液2：精密移取牡丹籽油125 μL，置25 mL三口燒瓶中，加0.5 mol/L氫氧化鉀-甲醇溶液4 mL，在60℃水浴中皂化20 min，待油珠溶解，放冷，轉(zhuǎn)移至25 mL的分液漏斗中，加0.5 mol/L鹽酸5 mL，加正己烷萃取3次，每次5 mL，合并萃取液，除去正己烷，殘留物用甲醇溶解，轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，精密量取1 mL，置25 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，即得。

以甲醇作為空白對照溶液。

1.2.2 色譜條件

Agilent C18高效色譜柱(3.0 mm×50 mm，2.7 μm)，流動相乙腈-0.1%磷酸水溶液(體積比 85∶15)，流速1 mL/min，柱溫35℃，檢測波長203 nm，進樣量20 μL。

1.2.3 方法學(xué)考察

1.2.3.1 專屬性試驗

分別取上述混合對照品溶液、供試品溶液和空白對照溶液注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖。

1.2.3.2 線性關(guān)系考察

精密量取1.2.1.1混合對照品溶液2.0、 4.0、6.0、8.0、10.0 mL，分別置于10 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，制備成α-亞麻酸質(zhì)量濃度分別為41.4、82.8、124、166、207 μg/mL，亞油酸質(zhì)量濃度分別為20.2、40.4、60.6、80.8、101 μg/mL和油酸質(zhì)量濃度分別為14.9、29.8、44.8、59.7、74.6 μg/mL的系列混合對照品溶液。精密吸取上述溶液20 μL注入高效液相色譜儀，記錄峰面積。以對照品質(zhì)量濃度為橫坐標(x)，峰面積為縱坐標(y)，分別繪制標準曲線，進行線性回歸。

1.2.3.3 精密度試驗

取1.2.1.1混合對照品溶液連續(xù)進樣6次，每次進樣20 μL，測定峰面積，分別計算油酸、亞油酸和α-亞麻酸峰面積的RSD。

1.2.3.4 重復(fù)性試驗

取牡丹籽油6份，照1.2.1.2供試品溶液2方法分別制備供試品溶液，進樣測定峰面積，分別計算油酸、亞油酸和α-亞麻酸的平均含量和RSD。

1.2.3.5 穩(wěn)定性試驗

取同一份 1.2.1.2供試品溶液2方法制備的供試品溶液，分別于0、2、4、8、12 h進行檢測，分別計算油酸、亞油酸和α-亞麻酸峰面積的RSD。

1.2.3.6 加樣回收試驗

精密量取已知α-亞麻酸、亞油酸、油酸含量的牡丹籽油6份，其中3份按1.2.1.2供試品溶液1方法制備，另外3份按1.2.1.2供試品溶液2方法制備，分別精密加入與供試品溶液中3種脂肪酸含量80%、100%和120%的對照品，按本方法測定，分別計算加樣回收率和RSD。

1.2.4 牡丹籽油中α-亞麻酸、亞油酸和油酸的含量測定

精密量取3份牡丹籽油，分別按照1.2.1.2方法制備供試品溶液，精密吸取20 μL注入高效液相色譜儀，按本方法測定，記錄峰面積，分別計算3種脂肪酸(游離型和結(jié)合型)的含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 檢測波長的確定

雖然油酸、亞油酸、α-亞麻酸的分子結(jié)構(gòu)中僅含有非共軛雙鍵，但是在采用HPLC法測定脂肪酸含量時，很多文獻還是選擇了紫外檢測器。在檢測波長選擇方面，有文獻選擇210 nm[11]，也有選擇205 nm[12]，還有選擇203 nm[13]；除此以外，還有文獻報道采用制備脂肪酸衍生物后，在檢測波長為242 nm處進行測定[14]。綜合考慮并經(jīng)預(yù)試驗，本文選擇檢測波長為203 nm。

2.2 方法學(xué)考察

2.2.1 專屬性試驗(見圖1)

從圖1可看出，供試品1和供試品2色譜圖與混合對照品色譜圖中3個待測組分對應(yīng)的色譜峰的保留時間相同，色譜峰分離度好，且空白樣品無干擾，說明本法專屬性好。

2.2.2 線性關(guān)系考察

α-亞麻酸回歸方程為y=22.217x+191.53，r=0.998 1，結(jié)果表明α-亞麻酸在41.4～207 μg/mL范圍內(nèi)，其峰面積與質(zhì)量濃度線性關(guān)系良好。亞油酸回歸方程為y=19.88x+42.821，r=0.998 6，結(jié)果表明亞油酸在20.2～101 μg/mL范圍內(nèi)，其峰面積與質(zhì)量濃度線性關(guān)系良好。油酸回歸方程為y=6.698 2x+20.998，r=0.999 3，結(jié)果表明油酸在14.9～74.6 μg/mL范圍內(nèi)，其峰面積與質(zhì)量濃度線性關(guān)系良好。

2.2.3 精密度試驗

α-亞麻酸、亞油酸和油酸峰面積的RSD分別為1.62%、1.25%和1.33%，說明檢測儀器的精密度良好。

2.2.4 重復(fù)性試驗

α-亞麻酸、亞油酸和油酸的平均含量分別為441、239 mg/mL和157 mg/mL，RSD分別為2.32%、1.68%和2.58%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.2.5 穩(wěn)定性試驗

α-亞麻酸、亞油酸和油酸峰面積的RSD分別為2.01%、1.76%和1.36%，表明供試品溶液中這3種成分在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.6 加樣回收試驗(見表1)

表1 加樣回收試驗結(jié)果

從表1可看出，游離型α-亞麻酸、亞油酸和油酸的平均加樣回收率分別為95.57%、103.07%和102.00%，RSD分別為2.18%、7.06%和4.02%；結(jié)合型α-亞麻酸、亞油酸和油酸的平均加樣回收率分別為94.87%、97.07%和94.40%，RSD分別為4.13%、1.87%和2.52%。

2.3 牡丹籽油中α-亞麻酸、亞油酸和油酸的含量(見表2)

表2 牡丹籽油中α-亞麻酸、亞油酸和油酸的含量 mg/mL

從表2可看出，牡丹籽油中，游離型α-亞麻酸、亞油酸、油酸的平均含量分別為4.47、1.89、0.92 mg/mL，結(jié)合型α-亞麻酸、亞油酸、油酸的平均含量分別為437、237、156 mg/mL。樣品中3種脂肪酸結(jié)合型的含量遠遠大于游離型的含量(基本都相差100倍左右)，說明自制的牡丹籽油中脂肪酸主要以結(jié)合型存在。

3 結(jié) 論

本文采用高效液相色譜法測定牡丹籽油中游離型和結(jié)合型α-亞麻酸、亞油酸及油酸的含量，色譜柱為Agilent C18高效色譜柱(3.0 mm×50 mm，2.7 μm )，流動相為乙腈-0.1%磷酸水溶液(體積比85∶15)，流速1 mL/min，檢測波長203 nm，柱溫35℃，進樣量20 μL。該方法具有分離效率高、選擇性好、條件溫和的特點，而且能分別測定游離型脂肪酸和結(jié)合型脂肪酸的含量，解決了現(xiàn)有技術(shù)中存在的一些不足，如樣品前處理煩瑣、反應(yīng)不完全，柱溫高導(dǎo)致脂肪酸雙鍵異構(gòu)化等，特別是為測定牡丹籽油在儲存過程中3種功能性不飽和脂肪酸由結(jié)合型轉(zhuǎn)變?yōu)橛坞x型的含量變化提供了一個新方法。

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Determinationofcontentsoffreeandconjugatedα-linolenicacid,linoleicacidandoleicacidinPaeoniasuffruticosaAndr.seedoilbyHPLC

LUO Guoping1，LIANG Yuzhu2，YAN Mengru1，ZHANG Cunlao1， MENG Huining3，WU Huanhuan1，SONG Jing1

(1.College of Pharmacy, Xi’an Medical University, Xi’an 710021, China; 2. Xi’an COFCO Engineering Research & Design Institute Co., Ltd., Xi’an 710082, China; 3. Shandong Buchang Medicine Co., Ltd., Heze 274418, Shandong, China)

The contents of free and conjugatedα-linolenic acid, linoleic acid and oleic acid inPaeoniasuffruticosaAndr. seed oil were determined by HPLC. The detection conditions were as follows: Agilent C18 column (3.0 mm×50 mm, 2.7 μm), mobile phase acetonitrile-0.1% phosphoric acid solution (volume ratio 85∶15), flow rate 1 mL/min, detection wavelength 203 nm, column temperature 35℃ and injection volume 20 μL. The results showed that the method had good precision, repeatability and stability. Good linear relationships ofα-linolenic acid, linoleic acid and oleic acid were achieved in the mass concentration ranges of 41.4-207 μg/mL, 20.2-101 μg/mL and 14.9-74.6 μg/mL, respectively. The average contents of freeα-linolenic acid, linoleic acid and oleic acid were 4.47，1.89 mg/mL and 0.92 mg/mL respectively, and the average contents of conjugatedα-linolenic acid, linoleic acid and oleic acid were 437，237 mg/mL and 156 mg/mL respectively inPaeoniasuffruticosaAndr.seed oil. The methods had the advantages of high separation efficiency, good selectivity and mild conditions.

PaeoniasuffruticosaAndr. seed oil;α-linolenic acid; linoleic acid; oleic acid; HPLC

2016-12-14；

：2017-04-17

2016年陜西省教育廳專項科研計劃項目(16JK1650)；陜西省2014年省級大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃項目(1644)；西安醫(yī)學(xué)院2015年大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃項目(2015DXS1-18)

羅國平(1979)，男，副教授，碩士，主要從事藥物新制劑、新劑型和新技術(shù)的教學(xué)和科研工作(E-mail)36163297@qq.com。

TS227;Q547

：A

1003-7969(2017)08-0140-05

檢測分析