董晨，張錦華，白寶清，徐蔓

(山西大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，山西 太原,030006)

檸檬苦素高效降解菌的分離篩選與鑒定

董晨，張錦華*，白寶清，徐蔓

(山西大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，山西 太原,030006)

篩選出在酸性環(huán)境下高效降解檸檬苦素的菌株，擴(kuò)展了生物法消除柑橘果汁中的苦味物質(zhì)的應(yīng)用領(lǐng)域。從新鮮醋醅中粗篩并分離出以檸檬苦素為唯一碳源的8株菌，其相應(yīng)的檸檬苦素降解率均達(dá)70%以上，其中6、7、8號(hào)菌的檸檬苦素降解率較高，分別為95.14%、98.21%和94.31%。比較3株高效降解菌的胞外蛋白、胞內(nèi)蛋白和菌液的檸檬苦素降解能力，3株菌中具有降解檸檬苦素的活性蛋白酶主要分布在細(xì)胞外，屬于胞外蛋白酶，胞內(nèi)蛋白對(duì)檸檬苦素幾乎無降解作用，其中6號(hào)菌株胞外酶的檸檬苦素降解活性最強(qiáng)，檸檬苦素降解率為45.57%。形態(tài)學(xué)觀察及分子生物學(xué)鑒定6、7、8號(hào)菌均屬于拉烏爾菌屬(Raoultellasp.)。菌株6具有高效降解檸檬苦素能力，能夠成為今后降解檸檬苦素微生物源的優(yōu)勢(shì)菌種。

檸檬苦素；降解；篩選；鑒定；酶系定位

柑橘汁生產(chǎn)過程中所出現(xiàn)的苦味問題一直備受關(guān)注[1]。柑橘類果汁中主要有柚皮苷和檸檬苦素2類產(chǎn)生苦味的物質(zhì)[2]，其中檸檬苦素是一類三萜系化合物[3]，它導(dǎo)致很多柑橘類果汁在后期的加工中產(chǎn)生強(qiáng)烈的“后苦味”[4]，并且其苦味閾值低，在水溶液中為1.0 mg/L，在果汁中約為3.4 mg/L，大約為柚皮苷的20倍[5]，是柑橘果汁中最主要的苦味物質(zhì)，極大影響了人們飲用果汁時(shí)的口感。

目前，脫除檸檬苦素等苦味物質(zhì)的方法主要有物理法和生物法。物理脫苦法主要包括吸附脫苦、膜分離脫苦、超臨界CO2脫苦、屏蔽法脫苦和添加苦味抑制劑脫苦等；生物脫苦法主要包括自然生物轉(zhuǎn)化脫苦、酶法脫苦、固定化細(xì)胞脫苦和基因工程脫苦等[6]。其中酶法脫苦具有專一性強(qiáng)、效果好、對(duì)風(fēng)味和營養(yǎng)成分無破壞、成本低等優(yōu)點(diǎn)[7]，是目前研究的主要趨勢(shì)。文獻(xiàn)報(bào)道中相關(guān)的脫苦酶主要有檸酸A-環(huán)內(nèi)酯脫氫酶、檸堿葡萄糖苷轉(zhuǎn)移酶、檸檬苦素環(huán)氧酶、檸檬苦素醇脫氫酶、反式消除酶、乙?；呀饷傅萚8]，這些酶可以將檸檬苦素轉(zhuǎn)化為無苦味的檸檬苦素糖苷和17-脫氫檸檬苦素類A-環(huán)內(nèi)酯[9]。涉及到的微生物源如不動(dòng)桿菌、球形節(jié)桿菌、球形節(jié)桿菌Ⅱ、假單胞菌和束紅球菌等也可以產(chǎn)生檸檬苦素類脫苦酶[10-11]。BARUCH[12]等從土壤中發(fā)現(xiàn)的不動(dòng)桿菌(Acinetobactersp.)可以將檸檬苦素轉(zhuǎn)化為脫氧檸檬苦素(deoxylimonin)，進(jìn)一步將其轉(zhuǎn)化為脫氧檸檬酸(deoxylimonicacid)。HASEGAWA等[13]研究表明，在球形節(jié)桿菌Ⅱ、束紅球菌中的檸檬苦素醇脫氫酶作用下，可使檸檬苦素轉(zhuǎn)化為檸檬苦素醇。但是上述這些酶最適的作用條件均為堿性，在酸性環(huán)境中的活性降低，在實(shí)際應(yīng)用中常因果汁的低pH而易失活，且生產(chǎn)成本高，因此在工業(yè)生產(chǎn)中受到很大限制[14]。

本實(shí)驗(yàn)旨在從生物脫苦的角度出發(fā)，尋找能夠在柑橘汁酸性環(huán)境中高效降解檸檬苦素的微生物資源，從而為柑橘汁的脫苦應(yīng)用提供優(yōu)良的微生物菌株或相關(guān)高效酶類。

1 材料與方法

1.1材料與試劑

2種新鮮醋醅，分別取自山西太原古燈調(diào)味品廠和紫林醋廠，均取醋酸發(fā)酵旺盛時(shí)期(第7天)的醋醅；檸檬苦素標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥98%)、檸檬苦素粗品(純度≥70%)，上海金穗生物科技有限公司；琯溪蜜柚：將購于超市的琯溪蜜柚果皮、囊衣切塊，洗凈后置于60 ℃烘箱內(nèi)，烘干后粉碎并進(jìn)行脫脂，放入密封塑料袋中，置于干燥器內(nèi)保存(提取其檸檬苦素，測(cè)定其含量為0.5 mg/g)。乙腈(色譜純)，天津市彪仕奇科技有限公司；其他試劑均為分析純。

1.2儀器與設(shè)備

SW-CJ-2FD型潔凈工作臺(tái)；HRHPY-300恒溫培養(yǎng)搖床；HRSP-250H生化培養(yǎng)箱；BL-75型立式壓力蒸汽滅菌筒；JA1203N電子天平；RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀；SHZ-III型循環(huán)水真空泵；UV-2800型紫外可見分光光度計(jì)；GZX-9023MBE型電熱鼓風(fēng)干燥箱；SB25-12DTDN型超聲波清洗機(jī)；FE20 pH計(jì)；SC-3614低速離心機(jī)；HC-2518R高速冷凍離心機(jī)。

1.3培養(yǎng)基的種類

1.3.1 選擇性固體培養(yǎng)基(檸檬苦素含量20 mg/L)

MgSO45 g、K2HPO410 g、KCl 5 g、KNO33 g、NaCl 2 g、柚子皮 40 g(脫脂且干燥至恒重，檸檬苦素含量為0.5 mg/g)、酵母膏 1 g、瓊脂 20 g、蒸餾水 1 000 mL、以HCl調(diào)至pH4.0(液體培養(yǎng)基中不添加瓊脂)。

1.3.2 酶反應(yīng)體系(檸檬苦素含量20 mg/L)

MgSO45 g、K2HPO410 g、KCl 5 g、KNO33 g、NaCl 2 g、柚子皮 40 g、蒸餾水 1 000 mL、以HCl調(diào)pH至4.0。

1.3.3 牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基

牛肉膏 3 g、蛋白胨 10 g、NaCl 5 g、瓊脂 20 g、蒸餾水 1 000 mL、pH 自然(液體培養(yǎng)基中不加瓊脂)。

1.4實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 檸檬苦素降解菌的分離

在無菌操作臺(tái)下，準(zhǔn)確稱取2種醋醅各10.0 g,放入盛有100 mL無菌水的錐形瓶(250 mL)中，30 ℃、150 r/min下?lián)u床振蕩30 min后靜置，吸取0.1 mL上清液涂布接種于選擇性固體培養(yǎng)基表面，37 ℃培養(yǎng)24 h，肉眼觀察培養(yǎng)長出的不同菌落，再用平板劃線法分離進(jìn)行純化培養(yǎng)，直到獲得純菌種，4 ℃斜面保存。

1.4.2 檸檬苦素高效降解菌的篩選

種子液的制備：用接種環(huán)輕輕刮取初篩得到的菌株的菌苔，接入50 mL牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，37 ℃、150 r/min搖床培養(yǎng)12 h后，無菌水調(diào)節(jié)OD值為0.8。

將種子液按1%的接種量接種到50 mL選擇性液體培養(yǎng)基中，37 ℃、150 r/min恒溫振蕩培養(yǎng)12 h，每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。測(cè)定實(shí)驗(yàn)前后培養(yǎng)基中檸檬苦素的含量，以不接菌的液體培養(yǎng)基為空白對(duì)照，計(jì)算各個(gè)菌株的檸檬苦素降解率。

1.4.3 檸檬苦素生物轉(zhuǎn)化相關(guān)酶系的定位

通過對(duì)優(yōu)勢(shì)檸檬苦素降解菌培養(yǎng)后的各部分產(chǎn)物(胞外蛋白產(chǎn)物、胞內(nèi)蛋白、菌液)降解能力的測(cè)定比較推斷降解酶系的產(chǎn)生部位[17]。具體方法如下：

將優(yōu)勢(shì)檸檬苦素降解菌株在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上培養(yǎng)活化24 h(37 ℃)，按照1.4.2中種子液的制備的步驟，分別制備其種子液，并按8%的接種量接入裝有50 mL選擇性液體培養(yǎng)基(檸檬苦素最終濃度為20 mg/L)的三角瓶(250 mL)中，37 ℃，150 r/min搖床培養(yǎng)12 h。

培養(yǎng)后的含菌體培養(yǎng)物分成A、B兩等份，制備下列培養(yǎng)產(chǎn)物：

①活菌對(duì)照：含菌體培養(yǎng)物A?？瞻讓?duì)照為在培養(yǎng)相同時(shí)間、未接菌的含等量檸檬苦素的培養(yǎng)液。

②胞外蛋白產(chǎn)物：含菌體培養(yǎng)物B經(jīng)3 500 r/min離心10 min除去菌體。取上清液加入硫酸銨至飽和度為80%，4 ℃靜置過夜，12 000 r/min離心10 min分離沉淀蛋白，收集沉淀物，用pH 4.0的檸檬酸緩沖液沖洗兩次后，溶解并定容至5 mL即為制得的胞外蛋白產(chǎn)物，采用考馬斯亮藍(lán)測(cè)定其蛋白含量[18]。

③胞內(nèi)蛋白：?、谥须x心所得菌體，用pH 4.6的檸檬酸緩沖液沖洗2次后，經(jīng)冰浴研磨破碎細(xì)胞，6 000 r/min離心10 min除去細(xì)胞碎片，取上清液用pH 4.0的檸檬酸緩沖液定容至5 mL，即為胞內(nèi)蛋白溶液，采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定其蛋白含量[18]。

分別吸取上述制備好的菌體培養(yǎng)物A、胞外蛋白溶液和胞內(nèi)蛋白溶液4 mL，加入50 mL含20 mg/L檸檬苦素的酶反應(yīng)液中，酶作用的空白對(duì)照為相同的液體培養(yǎng)基中加入4 mL無菌水代替粗酶液。然后將上述體系在37 ℃，150 r/min搖床反應(yīng)30 min。

培養(yǎng)結(jié)束后，用DMAB法[15]測(cè)定菌液A、酶作用培養(yǎng)液中檸檬苦素殘留量，并以相應(yīng)的空白對(duì)照為基準(zhǔn)，計(jì)算檸檬苦素降解率。對(duì)比不同組分和菌培養(yǎng)物對(duì)照A的檸檬苦素降解率，判斷各組分的降解活性，確定降解酶系的產(chǎn)生部位。

1.4.4 檸檬苦素高效降解菌的分類鑒定

1.4.4.1 形態(tài)學(xué)特征

將純化后的菌株接種于牛肉膏蛋白胨固體平板培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)12 h后觀察其菌落生長情況和形態(tài)，參照文獻(xiàn)進(jìn)行革蘭氏染色[10]。挑取單個(gè)菌落制成玻片，置于光學(xué)顯微鏡下觀察各菌株的顯微形態(tài)。

1.4.4.2 分子生物學(xué)鑒定

根據(jù)CTAB法[20]提取以上3株菌的總基因組DNA，采用細(xì)菌菌株的通用引物：7F：5’-CAGAGTTTGATCC-TGGCT-3’、5’-AGGAGGTGATCCAGCCGCA-3’；27F：5’-GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’、1541R、5’-AGAAAGGAGGTGATCCAGCC-3’進(jìn)行擴(kuò)增。

PCR反應(yīng)體系：Template(基因組 DNA 20～50 ng/μL)0.5 μL，10×Buffer(with Mg2+)2.5 μL，dNTP(各2.5 mmol/L)2 μL，F(xiàn)(10 μmol/L)各0.5 μL，R(10 μmol/L)各0.5 μL，加雙氧水至25 μL。

PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性45 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃修復(fù)延伸10 min；最后4 ℃終止反應(yīng)。擴(kuò)增產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳回收，純化后的產(chǎn)物測(cè)序后獲得的16S rDNA序列，登錄http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi網(wǎng)站，用Blast程序進(jìn)行序列比對(duì)分析，選取與之相似性高的10株菌的16S rDNA序列，進(jìn)行Clustal X比對(duì)，MEGA軟件分析，采用Neighbor-Joining構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，Bootstrap 1 000次進(jìn)行穩(wěn)定性驗(yàn)證。

1.4.5 檸檬苦素降解率的測(cè)定

1.4.5.1 檸檬苦素標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制[15]

對(duì)二甲氨基苯甲醛(DMAB)指示劑的配制：將高氯酸240 mL、冰醋酸300 mL混合作為貯備酸液用，將1.119 g DMAB溶解于30 mL貯備酸液即得DMAB指示劑，現(xiàn)配現(xiàn)用。

精確稱取5.0 mg檸檬苦素標(biāo)準(zhǔn)品，用乙腈(色譜純)溶解并定容至25 mL，作為標(biāo)準(zhǔn)溶液備用。準(zhǔn)確吸取0，0.25，0.5，0.75，1，1.25，1.5，2.0 mL標(biāo)準(zhǔn)溶液于試管中，分別加乙腈(色譜純)至2.0 mL，再分別快速加入3 mL DMAB指示劑和3 mL酸母液，室溫放置30 min后，于470 nm處測(cè)定吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)，檸檬苦素標(biāo)準(zhǔn)液的質(zhì)量濃度(μg/mL)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并求得回歸方程為y=0.001 9x+0.053 4，R2=0.999 4，檸檬苦素質(zhì)量濃度在0～0.25 g/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

1.4.5.2 檸檬苦素降解率的測(cè)定[15]

[16]，將1.4.2中經(jīng)過接種培養(yǎng)后的反應(yīng)體系沸水浴15 min后，于4 000 r/min離心5 min，去掉上清液，加入濃度為85%的丙酮，料液比為1∶47，超聲提取32 min，提取2次，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干后用乙腈定容至10 mL，從中吸取2 mL樣液，分別快速加入3 mL DMAB指示劑和3 mL酸母液，室溫放置30 min后，以未接入菌種、含有脫脂且干燥至恒重的柚皮粉的選擇性液體培養(yǎng)基做參比，在470 nm處測(cè)定吸光度，并按公式(1)計(jì)算檸檬苦素降解率：

(1)

式中：m1為對(duì)照中的檸檬苦素含量；m2為降解后樣品中殘余檸檬苦素含量。

2 結(jié)果及討論

2.1檸檬苦素降解菌的分離篩選

在選擇性固體培養(yǎng)基中，檸檬苦素是唯一的碳源，通過挑取不同形態(tài)的菌落，并進(jìn)行涂板，劃線純化培養(yǎng)，最終純化出8株菌，分別編號(hào)為1、2、3、4、5、6、7、8。測(cè)定以上8株菌的檸檬苦素降解率，結(jié)果如圖1所示。圖1表明，從醋醅中純化出的8株菌對(duì)檸檬苦素均具有一定的降解能力，相應(yīng)的降解率均達(dá)到70%以上，其中降解率在70%～80%之間的有4株(1、2、3、4號(hào)菌)，在90%以上的有3株(6、7、8號(hào)菌)，檸檬苦素降解率分別為95.14%、98.21%、94.31%，表現(xiàn)出較強(qiáng)的降解優(yōu)勢(shì)，為本研究的優(yōu)勢(shì)檸檬苦素高效降解菌，用于后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。

圖1 不同菌株檸檬苦素的降解能力(以檸檬苦素降解率表示)Fig.1 Limonin degradation ability of different strains (Showed with limonin degradation rates)

2.2檸檬苦素降解酶系的定位

圖2 菌株6、7和8培養(yǎng)物不同組分的蛋白質(zhì)量濃度Fig.2 The protein concentration of different part of the culture of the strain 6, 7 and 8

圖2為3株菌(6、7、8號(hào)菌)胞內(nèi)胞外粗蛋白的質(zhì)量濃度，由圖中可以看出，菌株6、7和8的胞外粗提液中蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度分別為(0.313 2±0.018 25)g/L、(0.192 7±0.013 88)g/L、0.1968±0.012 66 g/L，遠(yuǎn)高于3種菌株的胞內(nèi)蛋白質(zhì)量濃度，可能是因?yàn)閷?shí)驗(yàn)條件下的冰浴研磨未能將菌體完全破碎，胞內(nèi)蛋白未完全溶出，但可以推測(cè)培養(yǎng)后菌體的大多數(shù)蛋白主要分泌到細(xì)胞外。

圖3為3株菌培養(yǎng)不同組分的檸檬苦素降解能力，3株菌的胞內(nèi)粗蛋白對(duì)檸檬苦素幾乎無降解作用，這與胞內(nèi)蛋白質(zhì)量濃度較低有關(guān)(圖2)，也可能在胞內(nèi)粗蛋白的提取過程中部分酶活損失。含菌體培養(yǎng)液、胞外粗酶液加入到檸檬苦素的酶反應(yīng)體系中均表現(xiàn)出較好的檸檬苦素降解能力，推測(cè)出具有降解或轉(zhuǎn)化檸檬苦素的微生物源酶系主要分布在胞外，即在培養(yǎng)液中，酶反應(yīng)體系中胞外酶的降解作用略低于菌液的，推測(cè)可能是由于菌液中包含的微生物細(xì)胞含有完整的各種酶系，多種酶的參與對(duì)檸檬苦素的轉(zhuǎn)化和利用效率更高，所以相應(yīng)的菌液作用對(duì)檸檬苦素的降解或轉(zhuǎn)化能力較高；其中菌株6胞外粗酶液對(duì)檸檬苦素的降解率顯著高于菌株7、8的，降解率達(dá)到45.57%(圖3)。

圖3 菌株6、7和8培養(yǎng)物不同組分的檸檬苦素降解能力Fig.3 Limonin degradation ability of different part of the culture of the strain 6, 7 and 8

由上述可知，3株菌中具有降解檸檬苦素的酶系主要存在于細(xì)胞外，其中菌株6號(hào)的降解酶活性最強(qiáng)最強(qiáng)，后期對(duì)酶進(jìn)行純化并優(yōu)化作用條件后， 其檸檬苦素降解能力有望進(jìn)一步提高。

2.3優(yōu)勢(shì)檸檬苦素降解菌的分類鑒定

2.3.1 菌落形態(tài)特征觀察

對(duì)3株高效降解菌進(jìn)行菌落形態(tài)及顯微特征的觀察，對(duì)應(yīng)的菌落特征和顯微特征結(jié)果見表1，3株菌屬于細(xì)菌，電子顯微鏡下觀察革蘭氏染色后個(gè)體形態(tài)圖如圖4所示，其中6、8號(hào)菌為革蘭氏陰性菌G-，7號(hào)菌為革蘭氏陽性菌G+，顯微下3種菌均呈球狀，8號(hào)菌的細(xì)胞個(gè)體較6、7號(hào)小。

2.3.2 分子生物學(xué)鑒定

菌株6、7、8經(jīng)過DNA提取、PCR擴(kuò)增，結(jié)果見圖5，得到3條分別約為1 481 bp、1 477 bp、1 490 bp的擴(kuò)增產(chǎn)物，將上述擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序后得到的結(jié)果提交到GenBank，采用BLAST程序進(jìn)行同源性比對(duì)，獲取登錄號(hào)分別為KY445838、KY445839、KY445840，結(jié)果顯示6、7、8三株菌與解鳥氨酸拉烏爾菌(Raoultellaornithinolytica)的基因序列同源性分別達(dá)到100%、100%和99%。

表1 菌株的菌落形態(tài)及顯微特征

圖4 菌株6、7、8號(hào)革蘭氏染色觀察Fig.4 Gram staining of strain 6, 7 and 8

菌株6、7、8的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；M-Marker圖5 菌株6、7、8的16S rDNA PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.5 Electrophoresis of PCR amplification products of bacterial 16S rDNA from 6, 7 and 8

選取與6、7、8三種菌相似度較高(>99%)的10株菌株的16S rDNA基因序列分別進(jìn)行Clustal X比對(duì)后構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹如圖6、7、8所示，菌株6、7、8均與Raoultellaornithinolytica親緣關(guān)系較近。

根據(jù)以上形態(tài)學(xué)特征、顯微鏡觀察以及16S rDNA序列分析結(jié)果，將分離得到的6、7、8號(hào)菌分別鑒定為拉烏爾菌屬(Raoultellasp.)。

圖6 菌株6的16S rDNA系統(tǒng)發(fā)育樹(節(jié)間數(shù)字代表bootstrap支持值(50%以下未顯示))Fig.6 Phylogenetic tree of strain 6 based on 16S rDNA sequence (The numbers in each node represents bootstrap support value, and the numbers lower than 50 were not shown.)

圖7 菌株7的16S rDNA系統(tǒng)發(fā)育樹(節(jié)間數(shù)字代表bootstrap支持值(50%以下未顯示))Fig.7 Phylogenetic tree of strain 7 based on 16S rDNA sequence(The numbers in each node represents bootstrap support value, and the numbers lower than 50 were not shown.)

圖8 菌株8的16S rDNA系統(tǒng)發(fā)育樹(節(jié)間數(shù)字代表bootstrap支持值(50%以下未顯示))Fig.8 Phylogenetic tree of Strain 8 based on 16S rDNA sequence (The numbers in each node represents boo tstrap support value, and the numbers lower than 50 were not shown.)

3 結(jié)論

本研究從新鮮醋醅中篩選分離得到以檸檬苦素為唯一碳源的8株菌， 經(jīng)過復(fù)篩，其中6、7、8號(hào)菌對(duì)檸檬苦素的降解率達(dá)到95.14%、98.21%和94.31%，為優(yōu)勢(shì)檸檬苦素降解菌。通過比較以上3株優(yōu)勢(shì)高效降解菌發(fā)酵各部分產(chǎn)物(胞外蛋白產(chǎn)物、胞內(nèi)蛋白、菌液)的降解能力，結(jié)果表明3株菌中具有降解檸檬苦素的活性蛋白主要存在于細(xì)胞外，屬于胞外酶，胞內(nèi)蛋白對(duì)檸檬苦素幾乎無降解作用，其中菌株6號(hào)的酶活性最強(qiáng)，胞外粗酶的檸檬苦素降解率為45.57%，后期將對(duì)降解酶的作用條件進(jìn)行優(yōu)化，可進(jìn)一步提高其降解作用。綜合3種菌的形態(tài)學(xué)觀察及16S rDNA序列分析結(jié)果，鑒定菌株6、7、8均屬于拉烏爾菌屬(Raoultellasp.)。

本研究從醋醅中篩選到的檸檬苦素降解菌經(jīng)鑒定為拉烏爾菌屬(Raoultellasp.)，表現(xiàn)出自然界中檸檬苦素降解菌的存在地域多樣性和種類多樣性，而且粗篩得到8株細(xì)菌對(duì)檸檬苦素的降解率均較高，達(dá)到70%以上，其中菌株6、7、8對(duì)檸檬苦素的降解率達(dá)到90%以上，優(yōu)于上述文獻(xiàn)報(bào)道中的細(xì)菌的降解率，此數(shù)值雖與胡陽[11]等篩選得到一株具較高綜合脫苦酶活力的曲霉菌的降解率相近，但本實(shí)驗(yàn)從酸性環(huán)境下篩選得到的菌株更適宜應(yīng)用于低pH的柑橘果汁加工中，推測(cè)其含有的檸檬苦素降解酶系在酸性條件下也具有更好的活性和穩(wěn)定性，在柑橘果汁的生物脫苦中具有很好的應(yīng)用前景，后續(xù)將優(yōu)化菌株(粗酶)降解條件以提高檸檬苦素降解率，并對(duì)其具有降解檸檬苦素能力的酶進(jìn)行純化使之更加適應(yīng)工業(yè)生產(chǎn)。

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Screeningandidentificationofstrainswithhighlimonin-degradingefficiency

DONG Chen,ZHANG Jin-hua, BAI Bao-qin, XU Man

(College of Life Science, Shanxi University, Taiyuan 030006, China)

To screen the limonin-degrading strains with the high efficiency in the acidic environment, the study extended the application area of the bioanalysis to eliminate bitter substances in citrus juice. Eight limonin-degrading strains using limonin as the sole carbon source were isolated from fresh fermented grains of vinegar, and their corresponding limonin degradation rates were all above 70% in the cultured system. Among them, strains 6, 7, 8 exhibited higher degradation rates than others of 95.14%, 98.21%, 94.31% respectively. Comparing the limonin degradation ability of extracellular protein, intracellular protein, and bacterial fluid in three strains 6, 7, 8, the results indicated that enzymes having limonin degradation ability were located at extracellular position of these three strains. There was almost no limonin degradation for intracellular protein of three strains, and extracellular enzymes of strain 6 had the strongest limonin degradation ability with the limonin degradation rate of 45.57%. Based on morphological observations and molecular biology identifications, strains 6, 7, 8 were identified asRaoultellasp.. The strain 6 exhibiting the highest limonin-degrading capacity could be used as an excellent species for the degradation of limonin in the future.

limonin； degradation； screening； identification； enzyme localization

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.014507

碩士研究生(張錦華為通訊作者,E-mail:ever840605@sxu.edu.cn)。

山西大學(xué)引進(jìn)人才建設(shè)項(xiàng)目(113533801003)

2017-04-11，改回日期：2017-05-04