陳 辰，張 瑋

上海中醫(yī)藥大學附屬龍華醫(yī)院肝病科，上海 200030

血清AMA-M2抗體在ALT異常人群的檢出率和診斷PBC的價值

陳 辰，張 瑋

上海中醫(yī)藥大學附屬龍華醫(yī)院肝病科，上海 200030

目的探究基于ALT異?；颊邫z測血清抗線粒體抗體M2亞型(anti mitochondrial antibody-M2, AMA-M2)在原發(fā)性膽汁性肝硬化(primary biliary cirrhosis, PBC)的診斷價值及不同檢測方法診斷PBC的靈敏度和特異度。方法采用酶聯免疫吸附試驗(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)法或免疫印跡(Western blotting)法檢測ALT異常的7 887例患者血清中AMA-M2抗體。結果7 887例患者中診斷為PBC者共137例，男26例，女111例，男女之比為1∶4.3(P<0.05)。40～60歲患者AMA-M2陽性率明顯高于其他年齡組(P<0.05)；4 801例患者同時使用了兩種檢測方法，ELISA法診斷PBC的敏感度較高(P<0.05)；Western blotting法診斷PBC的特異度較高(P<0.05)；ELISA法檢測的M2抗體低滴度患者伴r-GT升高者占56.52%，AKP升高者占21.73%。結論ELISA法和Western blotting法都是診斷PBC的有效特異性指標，其中敏感度以ELISA法為優(yōu)，特異度以Western blotting法為優(yōu)。M2抗體低滴度陽性可能與患者存在肝內膽汁淤積相關；部分患者也可能是PBC潛在的危險人群。

M2型抗線粒體抗體；原發(fā)性膽汁性肝硬化；敏感度；特異度

抗線粒體抗體(anti-mitochondrial antibody,AMA)是原發(fā)性膽汁性肝硬化(primary biliary cirrhosis,PBC)的標志性抗體，包括M1～M9 9個亞型，其中M2為PBC特異性抗體。相關報道[1]表明，AMA-M2在PBC發(fā)病中有重要作用，其陽性率為95%。Hu等[2]認為，在診斷PBC時，AMA和AMA-M2均有較高的特異度和敏感度。Gulamhusein等[3]研究表明，80%的AMA抗體陽性患者在平均5年之后，會發(fā)展成為PBC。本研究擬對肝功異常患者分別研究采用酶聯免疫吸附試驗(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)法與免疫印跡(Western blotting)法檢測患者血清中AMA-M2抗體，并對ELISA檢測AMA-M2陽性但滴度值<100 RU/ml，不能確診為PBC患者的人群進行分析。

1 資料與方法

1.1一般資料收集上海中醫(yī)藥大學附屬龍華醫(yī)院2013年2月-2015年6月肝功能異常的患者7 887例并對其進行M2抗體篩查，分別采用ELISA 法和/或Western blotting法檢測AMA-M2抗體(見表1)，男2 707例，女5 180例，年齡(54.99±16.69)歲(24～90歲)。同時選取兩種方法檢測的患者4 801例，分別統(tǒng)計兩種檢測方法的敏感度和特異度、陽性預測值、陰性預測值、診斷符合率，比較兩種檢測方法檢測AMA-M2對PBC的診斷效率，并分析AMA-M2低滴定度患者的臨床意義。

1.2PBC診斷標準參照2015年更新的膽汁淤積性肝病診斷治療專家共識[4]以下3項中2項符合即可確診：(1)存在膽汁淤積的生化學表現，主要為AKP水平升高。(2)特異性自身抗體 AMA滴度> 1∶100(國內標準)，陽性率超過90%；AMA對于診斷PBC的特異度超過95%；M2型AMA(抗PDC-E2)；特異度ANA：抗sp100或gp210抗體。(3)組織學改變：典型改變?yōu)榉腔撔云茐男阅懝苎准靶∪~間膽管破壞。

1.3方法和試劑

1.3.1 ELISA法檢測血清AMA-M2抗體：采用ELISA法(上?？菩鹿旧a)對血清中的AMA-M2(德國歐蒙醫(yī)學診斷股份公司生產)水平進行檢測，按說明書繪制標準曲線，根據標準曲線，用四參數回歸法計算待測樣本濃度值，濃度值≥25 RU/ml為陽性。

1.3.2 Western blotting法檢測血清AMA-M2抗體：采用Western blotting法進行AMA-M2檢測，根據說明書以半定量(+)為陽性，判讀范圍為(+)、(++)、(+++)。DL1300-1601-3G抗肝抗原譜抗體IgG檢測試劑盒(Western blotting)。

2 結果

2.17887例患者AMA-M2檢測情況

2.1.1 7 887例患者檢測AMA-M2陽性結果分析：7 887例患者中，5 740例采用ELISA法檢測AMA-M2，6 948例患者采用Western blotting檢測。4 801例患者同時采用兩種方法檢測，其中ELISA法檢測M2≥800 者106例，Western blotting檢測強陽性者99例；ELISA法檢測100≤M2<800者 31例，Western blotting法檢測陽性者26例；ELISA法檢測<100 者6例，Western blotting法檢測弱陽性者3例。

表1137例PBC患者不同年齡和性別之間陽性率分析

Tab1Theanalysisofthepositiverateof137PBCpatientsbetweendifferentagesandgender

年齡組(歲)樣本量男AMA-M2陽性陽性率(%)樣本量女AMA-M2陽性陽性率(%)樣本量總體AMA-M2陽性陽性率(%)18～3055600.00315110024110.1831～40905116.67198583.3370760.6641～50169549.765503790.241145412.4251～601221611.544844688.46737524.2661～702093317.656601482.351433170.8171～80872342.86241457.1463171.49>80545969.23259430.77286131.29總計78872618.98270711181.0251801371.74

圖1137例PBC患者的年齡與M2抗體滴度關系

Fig1TherelationshipbetweenagesandthetiterofM2antibodyinPBCpatients

2.1.2 確診的PBC患者一般情況分析：在137例確診的PBC患者中，兩種方法同時為陽性者128例，ELISA法檢測M2陽性(>100)而Western blotting法檢測法陰性且確診的6例，另gp210(+)確診的患者2例，sp100(+)確診的患者1例，其年齡和性別分層如下。

由表1可知，137例PBC患者男女陽性率之比為1∶4.3，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。40～60歲患者AMA-M2陽性率明顯高于其他年齡組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；男性患者>80歲者PBC發(fā)病率呈上升趨勢，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。不同年齡段的PBC患者與M2抗體的滴度存在一定的相關性。其中40～60歲患者M2抗體滴度高于其他組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，見圖1)。

2.1.3 137例PBC患者疾病合并情況分析：7 887例患者，隱源性肝炎1 523例，其中PBC 99例(6.50%)；脂肪肝809例中PBC 4例；慢性乙型病毒性肝炎3 152例中PBC 11例；丙型病毒性肝炎132例中PBC 1例；肝炎后肝硬化788例中PBC 3例；肝惡性腫瘤894例中PBC 3例；其他自身免疫性疾病589例，合并PBC者包括干燥綜合征4例，類風濕性關節(jié)炎3例，潰瘍性結腸炎3例，硬皮病1例，系統(tǒng)性紅斑狼瘡3例，甲狀腺疾病2例。

2.1.4 ELISA低滴度分析：ELISA法檢測0

2.2兩種方法檢測AMA-M2靈敏度和特異度分析ELISA法診斷PBC的敏感度較Western blotting法高，差異有統(tǒng)計意義(P<0.05)；Western blotting法診斷PBC的特異度較ELISA法高，差異有統(tǒng)計意義(P<0.05，見表2)。

表2兩種方法檢測AMA-M2靈敏度和特異度分析(%)

Tab2ThecomparisonoftwomethodsofdetectingthesensitivityandspecificityofAMA-M2(%)

方法敏感度特異度陽性預測值陰性預測值診斷符合率ELISA法99.2790.2066.6799.8491.70Westernblotting法75.18*97.55*85.8395.2193.86

注：與ELISA法比較，*P<0.05。

3 討論

1965 年Walker等[5]首次采用間接免疫熒光法，發(fā)現PBC患者血清中存在一種物質，經鼠肝線粒體預處理后可阻斷這種間接免疫熒光反應，證實該物是AMA。有研究[6]顯示，PBC患者血清中存在的抗AMA-M2靶抗原抗人丙酮酸脫氫酶復合體E2亞基(pyruvate dehydrogenase complex E2, PDC-E2)的IgG抗體與 PBC的疾病進展有很強相關性。在臨床工作中，臨床癥狀及血清生化以膽汁淤積表現為主，IgM、IgG水平升高，ANA和(或)SMA陽性、AMA陰性患者，仍需考慮PBC的可能。且特異性抗體(sp100和gp210)有助于該病的診斷[7-8]。本研究中，除使用AMA-M2確診外，另有2例患者gp210(+)、1例患者sp100(+)而確診。

大多數學者認為，高滴度(>1∶100或強陽性)的AMA-M2是PBC的血清學指標之一，在患者出現癥狀前幾年甚至幾十年就可以檢測到AMA的存在[9]，高滴度的AMA-M2診斷PBC的敏感度和特異度均達到90%以上。而低滴度(<1∶100或弱陽性)AMA-M2診斷PBC的敏感度、特異度均較低。

我們對低滴度患者的肝功能進行統(tǒng)計，發(fā)現r-GT升高者占總例數的56.52%，AKP升高者占21.73%，反映低滴度的M2陽性與膽汁淤積有相關性，此部分患者可能是PBC潛在的危險人群，建議定期復查，有助于PBC的早期診斷和治療[7]。

據報道，PBC在世界不同地區(qū)的流行率不同，呈北高南低趨勢。過去的10年里，在紐卡斯爾(英國),美國北方地區(qū)、加拿大和中國南方等地區(qū)，PBC年發(fā)病率從31/100萬增長到492/100萬[10-11]。該病以女性發(fā)病為主，男女比例為1∶8[12]。本次研究也證實了上述觀點，7 887例ALT 異?；颊咧须[源性肝炎占1 523例，其中診斷PBC患者共計99例，PBC在隱源性肝炎中的發(fā)病率6.50%。與我們之前的研究基本相符[13]。值得注意的是，男性病例的比例在增加，且年齡>80歲者PBC的發(fā)病率有所上升，與我們推測雄激素可能介導PBC的發(fā)病有關，由于此次研究PBC男性患者較少，有待擴大樣本量進一步研究。同時我們發(fā)現在其他肝病的患者中雖然PBC的合并發(fā)病率不高，但對疾病進展有影響必須引起臨床重視，慢性肝病、肝硬化長期GGT、AKP異常有必要做M2抗體檢測，以利早期發(fā)現合并PBC的可能，早期治療以穩(wěn)定患者病情，控制疾病進展。

AMA-M2的主要檢測方法有：IIF法、ELISA法、Western blotting法，不同方法的敏感性和特異性不同。IIF法是檢測AMA-M2的經典檢測方法，其結果判斷主要依賴于檢驗人員的熟悉程度，尤其當AMA滴度較低時容易造成漏診。Villalta等[14]采用ELISA法檢測PBC患者血清M2型抗線粒體抗體水平，其靈敏度高于IIF法。Lleo等[15]研發(fā)出新的ELISA，將MIT3混合物及純化的PDC組合作為靶抗原，檢測AMA的敏感性達到93.6%，遠高于常規(guī)的檢測方法。提示ELISA法檢測AMA-M2不同水平對其診斷PBC進一步量化有重要意義。ELISA法廣泛使用，AMA滴度是否與疾病的嚴重程度相關，是否AMA陽性者生化正常最終會發(fā)展為PBC仍有爭議[8]。

本研究中，ELISA法與Western blotting法檢測AMA-M2抗體陽性結果比較，差異有統(tǒng)計學意義。另外，ELISA法較Western blotting法敏感度較高，Western blotting法較 ELISA 法特異度高。然而體外診斷試劑根據不同的應用需要，在檢測靈敏度、特異度檢測性能會有所差異。設計用途為篩查型的檢測試劑盒產品設計會選擇適當檢測特異度而提高檢測靈敏度，設計用途為確認型的檢測試劑盒產品則會選擇適當檢測靈敏度而提高檢測特異度。不同設計應用途徑的產品在檢測性能上也會有所差異，這也是導致檢測結果不一致的因素之一。應當以臨床PBC診斷或輔助診斷金標準作為參考對試劑的靈敏度與特異度進行科學評價。而不同方法檢測AMA-M2水平的敏感度、特異度有待進一步擴大樣本量進行研究。隨著研究的不斷深入，方法的不斷改進，更多抗體或針對靶抗原特異性表達的檢測手段應用到臨床實踐工作中，這對于PBC發(fā)病機制的了解，以及臨床診斷有很強的現實意義。

[1] Alfano AM, Romito A, Marchese C, et al. Diagnostic accuracy of two tests for determination of anti-m2 in the diagnosis of primary biliary cirrhosis: Is it possible to predict the course of the disease? [J]. Immunol Res, 2016, 65(1): 299-306.

[2] Hu S, Zhao F, Wang Q, et al. The accuracy of the anti-mitochondrial antibody and the M2 subtype test for diagnosis of primary biliary cirrhosis: a meta-analysis [J]. Clin Chem Lab Med, 2014, 52(11): 1533-1542.

[3] Gulamhusein AF, Juran BD, Atkinson EJ, et al. Low incidence of primary biliary cirrhosis (PBC) in the first-degree relatives of PBC probands after 8 years of follow-up [J]. Liver Int, 2016, 36(9): 1378-1382.

[4] 膽汁淤積性肝病診斷治療專家共識2015年更新專家委員會. 膽汁淤積性肝病診斷治療專家共識: 2015年更新[J]. 臨床肝膽病雜志(電子版), 2015, 31(10): 1563-1574.

[5] Walker JG, Doniach D, Roitt IM, et al. Serological tests in diagnosis of primary biliary cirrhosis [J]. Lancet, 1965, 285 (7393): 1016.

[6] Nakanuma Y, Sasaki M, Harada K. Autophagy and senescence in fibrosing cholangiopathies [J]. J Hepatol, 2015, 62(4): 934-945.

[7] Bogdanos DP, Komorowski L. Disease-specific autoantibodies in primary biliary cirrhosis [J]. Clin Chim Acta, 2011, 412(7-8): 502-512.

[8] Bowlus CL, Gershwin ME. The diagnosis of primary biliary cirrhosis [J]. Autoimmun Rev, 2014, 13(4-5): 441-444.

[9] Invemizzi P, Selmi C, Gershwin ME. Update on primary biliary cirrhosis [J]. Dig Liver Dis， 2010, 42(6): 401-408．

[10] Delgado JS, Vodonos A, Delgado B, et al. Primary biliary cirrhosis in Southern Israel: a 20 year follow up study [J]. Eur J Intern Med, 2012, 23(8): 193-198.

[11] Liu H, Liu Y, Wang L, et al. Prevalence of primary biliary cirrhosis in adults referring hospital for annual health check-up in Southern China [J]. BMC Gastroenterol, 2010, 10(1): 100-105.

[12] Koulentaki M, Mantaka A, Sifaki-Pistolla D, et al. Geoepidemiology and space-time analysis of primary biliary cirrhosis in Crete, Greece [J]. Liver Int, 2014, 34(7): 200-207.

[13] 張瑋, 王磊, 王奕, 等. 1 039例隱源性肝炎患者AMA-M2抗體的篩查[J]. 實用肝臟病雜志, 2012, 15(3): 238-240. Zhang W, Wang L, Wang Y, et al. Measurement of anti-mitochondria M2 antibodies in 1039 patients with cryptogenic hepatitis [J]. J Clin Hepatol, 2012, 15(3): 238-240.

[14] Villalta D, Sorrentino MC, Girolami E, et al. Autoantibody profiling of patients with primary biliary cirrhosis using a multiplexed line-blot assay [J]. Clin Chim Acta, 2015, 438: 135-138.

[15] Lleo A, Invernizzi P, Gao B, et al. Definition of human autoimmunity-autoantibodies versus autoimmune disease [J]. Autoimmun Rev, 2010, 9(5): 259-266.

(責任編輯：王全楚)

The positive incidence and diagnostic significance of AMA-M2in PBC of abnomal ALT

CHEN Chen, ZHANG Wei

Department of Hepatology, Longhua Hospital, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, Shanghai 200030, China

ObjectiveTo investigate the diagnostic significance of anti-mitochondrial antibodies-M2 (AMA-M2) for primary biliary cirrhosis (PBC) in physical examine, based on abnormal ALT.MethodsAMA-M2 of 7 887 patients with abnormal ALT was determined by enzyme-lined immunosorbent assay (ELISA) and Western blotting．ResultsOne hundred and thirty seven patients (26 males and 111 females) were diagnosed as PBC in the screening of 7 887 patients, the sex ratio was 1∶4.3 (P<0.05). AMA-M2 from 40 to 60 years old patients were significantly higher than other groups (P<0.05). Four thousand eight hundred and one patients used two kinds of detection methods at the same time. The sensitivity of diagnosis of PBC with ELISA was higher than Western blotting (P<0.05); the specificity of diagnosis PBC with Western blotting higher than ELISA (P<0.05); in the M2 low degree patients， γ- GT increased accounted for 56.52% and AKP increased accounted for 21.73% by ELISA.ConclusionELISA and Western blotting both are effective specific indicators in the diagnosis of PBC. ELISA has the better sensitivity but Western blotting has the better specificity. Patients with M2 low degree may have the symptoms of intrahepatic cholestasis, and some patients may be at-risk of PBC.

M2 anti-mitochondrial antibodies; Primary biliary cirrhosis; Sensitivity; Specificity

10.3969/j.issn.1006-5709.2017.09.015

R575.2

：A

：1006-5709(2017)09-1022-04

：2016-10-08

國家自然科學基金面上項目(81373860)

陳辰，在讀碩士研究生，研究方向：中西醫(yī)結合肝病。 E-mail: 15221362775@163.com

張瑋，教授，主任醫(yī)師，研究方向：中西醫(yī)結合肝病。 E-mail: 18918104444@189.cn