朱 琳， 賀 巍， 范興愛， 楊生岳， 劉睿年， 陳 磊

解放軍第四醫(yī)院消化內(nèi)科，青海 西寧 810007

快速進(jìn)入高海拔地區(qū)對大鼠小腸Cajal間質(zhì)細(xì)胞和縫隙連接蛋白43的表達(dá)影響

朱 琳， 賀 巍， 范興愛， 楊生岳， 劉睿年， 陳 磊

解放軍第四醫(yī)院消化內(nèi)科，青海 西寧 810007

目的通過觀察快速進(jìn)入高海拔地區(qū)大鼠小腸動(dòng)力紊亂發(fā)生過程中，小腸Cajal間質(zhì)細(xì)胞(interstitial cell of Cajal, ICC)與縫隙連接蛋白43(Connexin 43,Cx43)的表達(dá)變化，探討其發(fā)病機(jī)制。方法30只SD雄性大鼠以低海拔地區(qū)(海拔400 m)為對照組，并以進(jìn)入高海拔地區(qū)(海拔4 300 m)后的時(shí)間節(jié)點(diǎn)依次分為3 d和14 d組，每組10只。測定各組大鼠小腸電活動(dòng)數(shù)據(jù)，應(yīng)用電子顯微鏡觀察ICC的微觀結(jié)構(gòu)變化，應(yīng)用雙重免疫熒光組織化學(xué)染色法觀察同區(qū)域ICC和Cx43的表達(dá)變化。結(jié)果大鼠快速進(jìn)入高海拔地區(qū)后，其小腸電波幅及波頻于3 d組下降到最低點(diǎn)(P<0.05)。使用雙重免疫熒光組織化學(xué)染色法同步標(biāo)記小腸電起搏區(qū)ICC和Cx43，所得免疫熒光強(qiáng)度同樣在高海拔地區(qū)3 d組表達(dá)下降到最低點(diǎn)(P<0.05)。結(jié)論ICC細(xì)胞縫隙連接受損及其與Cx43的表達(dá)異常導(dǎo)致ICC細(xì)胞間、ICC與消化道平滑肌(smooth muscle cell, SMC)間物質(zhì)及電信號(hào)傳遞障礙，可能是快速進(jìn)入高海拔地區(qū)胃動(dòng)力紊亂形成的重要機(jī)制之一。

高原病；高海拔；小腸動(dòng)力；Cajal間質(zhì)細(xì)胞；縫隙連接蛋白分43；大鼠

快速進(jìn)入高海拔地區(qū)胃腸動(dòng)力紊亂是最常見的急性高原反應(yīng)之一，一般經(jīng)7～10 d的高原適應(yīng)期后可逐漸緩解或消失[1]，然而有關(guān)快速進(jìn)入高海拔地區(qū)胃腸動(dòng)力紊亂的發(fā)生機(jī)制目前尚不完全清楚。小腸Cajal間質(zhì)細(xì)胞(interstitial cell of Cajal,ICC)是廣泛分布胃腸道內(nèi)的特殊間質(zhì)細(xì)胞，它不但是胃腸基本電節(jié)律(basic electric rhythm)的起始點(diǎn)[2-3]，同時(shí)又在腸神經(jīng)系統(tǒng)及平滑肌間起著傳導(dǎo)信號(hào)的作用[4]，在胃腸動(dòng)力調(diào)控中發(fā)揮重要作用?？p隙連接又稱為通訊連接(communication junction)，是細(xì)胞連接的一種方式，同樣是細(xì)胞間跨膜信號(hào)傳導(dǎo)的重要方式之一，而縫隙連結(jié)蛋白43(Connexin 43,Cx43)作為重要的連接蛋白之一，其大量存在于人、大鼠、小鼠、豬及犬的胃腸道壁中[5]，發(fā)揮信號(hào)傳導(dǎo)作用。本研究將應(yīng)用免疫熒光雙標(biāo)記的方法，通過標(biāo)記小腸ICC和Cx43，觀察其表達(dá)分布變化，以探討快速進(jìn)入高海拔地區(qū)大鼠小腸動(dòng)力紊亂的發(fā)生機(jī)制。

1 材料與方法

1.1主要儀器及試劑RM6280B生物信號(hào)采集處理系統(tǒng)(成都儀器廠)，超低溫冰箱(-80 ℃)及超低溫切片機(jī)(美國NUAIR公司)，F(xiàn)V1000激光共聚焦顯微鏡(日本OLYMPUS公司)，TecnaiG2分析透射電鏡(美國FEI公司)，兔抗大鼠多克隆c-kit抗體(美國LifeSpan BioSciences公司)，小鼠抗大鼠單克隆抗體、驢抗兔FITC標(biāo)記單克隆抗體、驢抗小鼠Alexa fluor單克隆抗體均購自英國Abcom公司。

1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組雄性SD大鼠30只，6周齡，SPF級(jí)，許可證號(hào)：SCXK(陜)2012-003，體質(zhì)量(200±20)g，全部購自西安交通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。以低海拔地區(qū)(西安，海拔400 m)為對照組，另以大鼠起運(yùn)后3 d內(nèi)進(jìn)駐實(shí)驗(yàn)現(xiàn)場模擬快速進(jìn)入高海拔地區(qū)狀態(tài)，并以進(jìn)入高海拔地區(qū)(瑪多，海拔4 300 m)后的時(shí)間節(jié)點(diǎn)為依據(jù)，依到達(dá)實(shí)驗(yàn)地區(qū)后的時(shí)間順序，設(shè)置胃動(dòng)力障礙觀測最明顯的3 d組[6]，恢復(fù)期的14 d組，每組10只。

1.3小腸電生理活動(dòng)檢測SD大鼠術(shù)前12 h禁食，術(shù)前6 h禁水，戊巴比妥鈉腹腔注射(40 mg/kg)麻醉，通過大鼠腹部正中切開，選擇大鼠幽門后10 cm處小腸漿膜層埋置引導(dǎo)電極[7]，測量小腸電活動(dòng)變化，參數(shù)設(shè)定為“生物電，200 μV，0.02 s，100 Hz”，記錄波形并分析。

1.4實(shí)驗(yàn)標(biāo)本的采集與固定電生理測定完成后處死大鼠，剪開胸腔，經(jīng)升主動(dòng)脈插管，快速灌入生理鹽水沖去血液，于大鼠幽門后10 cm小腸處截取0.2 cm×0.1 cm大小組織，放入30 g/L戊二醛固定用于電鏡染色，后繼續(xù)經(jīng)升主動(dòng)脈先快后慢灌注冷的(4 ℃)40 g/L多聚甲醛的0.1 mol/L磷酸緩沖液(PB，pH 7.4)500 ml，注畢立即截取大鼠幽門后10～15 cm段置于200 g/L的蔗糖溶液中過夜沉淀。

1.5電鏡觀察大鼠小腸ICC微觀結(jié)構(gòu)變化取30 g/L戊二醛固定組織用0.2 mol/L蔗糖磷酸緩沖液漂洗，再用20 g/L的四氧化鋨后固定1 h，丙酮中梯度脫水，在10 g/L醋酸雙氧鈾中停滯染色1 h，再通過環(huán)氧丙烷與環(huán)氧樹脂。1 mm切片用亞甲藍(lán)染色，在光鏡下觀察，確定黏膜層、環(huán)形肌層、縱行肌層，再次經(jīng)70 nm超薄切片后用酒精醋酸雙氧鈾,再用檸檬酸鹽后染色，保留縱行肌層、環(huán)形肌層、黏膜下層、部分黏膜層，用透射電鏡觀察。

1.6雙重免疫熒光化學(xué)法標(biāo)記ICC及Cx43,并觀察、采集圖像取固定后胃體中部上1/3處0.4 cm×0.2 cm組織用超低溫切片機(jī)切片10 μm，使用0.01 mol/L PBS漂洗3次，置入含3 g/L TritonX-100的0.01 mol/L PBS中浸泡30 min(室溫)，經(jīng)0.01 mol/L PBS液漂洗，進(jìn)行免疫組織化學(xué)熒光染色(以c-kit抗體標(biāo)記ICC細(xì)胞)：分別加入兔抗大鼠多克隆c-kit抗體(1∶150)及小鼠抗大鼠單克隆Cx43抗體(1∶200)，室溫孵育24 h，經(jīng)0.01 mol/L PBS液漂洗3次后，分別加入熒光二抗，驢抗兔FITC標(biāo)記單克隆抗體(1∶400)及驢抗小鼠Alexa fluor 594單克隆抗體(1∶400)，避光室溫孵育2 h。經(jīng)0.01 mol/L PBS洗3次，800 g/L甘油封片，以上過程均需避光操作。各組切片各取10張，在FV1000激光共聚焦顯微鏡下采用20及40倍視野觀察，觀察每一張切片取6～8個(gè)視野，并將數(shù)字化圖像儲(chǔ)存。

2 結(jié)果

2.1快速進(jìn)入高海拔地區(qū)后大鼠小腸電生理變化快速進(jìn)入高海拔地區(qū)后，大鼠小腸電的波頻及波幅均受損明顯，高海拔3 d組與低海拔對照組比較顯著下降(P<0.05)，此后緩慢恢復(fù)，其中波頻恢復(fù)相對較快，高海拔14 d組時(shí)其波頻與低海拔對照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，而波幅恢復(fù)相對較慢，高海拔14 d組小腸電波幅仍明顯低于低海拔對照組(P<0.05，見表1、圖1)。

組別只數(shù)波幅(mV)波頻(Hz)低海拔對照組10579.31±15.4649.23±1.16高海拔3d組10122.91±29.64*#44.76±0.52*#高海拔14d組10222.41±42.74* 49±1.31

注：與低海拔對照組比較，*P<0.05；與高海拔14 d組比較，#P<0.05。

圖1大鼠快速進(jìn)入高海拔地區(qū)后小腸電活動(dòng)時(shí)程變化A：低海拔對照組；B：高海拔3 d組；C：高海拔14 d組

Fig1ChangesofascendingtohighaltitudeonsmallintestineelectricalactivityintheratsA：low altitude group；B：high altitude 3 days group；C：high altitude 14 days group

2.2快速進(jìn)入高海拔地區(qū)后大鼠小腸ICC的微觀結(jié)構(gòu)變化低海拔對照組ICC在電鏡下觀察可見細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，縫隙連接緊密，核周細(xì)胞質(zhì)充盈，細(xì)胞器數(shù)量較多，細(xì)胞內(nèi)部罕見空泡樣改變，無凋亡小體?？焖龠M(jìn)入高海拔地區(qū)后，高海拔3 d組ICC細(xì)胞微觀結(jié)構(gòu)受外界環(huán)境影響明顯受損，細(xì)胞縫隙連接明顯疏松；細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器數(shù)量明顯減少，線粒體可見明顯空泡樣腫脹、變性，核周細(xì)胞質(zhì)空泡樣改變明顯，甚至部分ICC基膜不完整形成空洞；可見核固縮形成，核內(nèi)可見異染色質(zhì)，凋亡小體顯著增多。高海拔14 d組ICC處于恢復(fù)期，微觀結(jié)構(gòu)變化接近于低海拔對照組，但未完全恢復(fù)至正常形態(tài)(見圖2)。

2.3快速進(jìn)入高海拔地區(qū)后大鼠小腸c-kit及Cx43的表達(dá)變化低海拔對照組ICC主要分布于消化道平滑肌的肌間(ICC-MY)及深層肌層 (ICC-DMP)。在高海拔3 d組，雖其分布未見明顯變化，但c-kit表達(dá)量明顯下降，其免疫熒光值與低海拔對照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。Cx43的表達(dá)變化與ICC表達(dá)改變同步，可見其分布于ICC細(xì)胞的胞體及突起上，及環(huán)、縱肌內(nèi)相鄰肌細(xì)胞的包膜上，以及肌間神經(jīng)叢區(qū)域，高海拔3 d組表達(dá)量與低海拔對照組相比同樣明顯下降，高海拔14 d組Cx43的表達(dá)變化與ICC表達(dá)顯示緩慢恢復(fù)，但與低海拔對照組仍有一定距離,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見表2，圖3)。

圖2快速進(jìn)入高海拔地區(qū)后對大鼠小腸ICC細(xì)胞微觀結(jié)構(gòu)的影響A：低海拔對照組(6 000×)；B：高海拔3 d組(20 500×)；C：高海拔14 d組(20 500×)

Fig2EffectsofascendingtohighaltitudeonultrastructureofICCintherats’smallintestineA：low altitude group(6 000×)；B：high altitude 3 days group(20 500×)；C：high altitude 14 days group(20 500×)

組別c-kitCx43c-kit/Cx43低海拔對照組47.32±6.8351.33±3.8360.83±4.32高海拔3d組30.084±2.83*# 35.96±3.35*# 44.61±4.12*#高海拔14d組36.67±3.08* 41.08±3.45* 53.58±4.60*

注：與低海拔對照組比較，*P<0.05；與高海拔14 d組比較，#P<0.05。

3 討論

消化道平滑肌的蠕動(dòng)特性與心臟節(jié)律類似，具有自發(fā)性、節(jié)律性的特點(diǎn)，它由慢波，即基本電節(jié)律控制。作為胃腸動(dòng)力基本功能單位的重要組成部分，ICC是慢波的起搏者和傳播者[8]，引起并調(diào)節(jié)胃腸平滑肌的自發(fā)性、節(jié)律性的機(jī)械活動(dòng)，在此過程中ICC居于核心地位，發(fā)揮關(guān)鍵性作用，已有研究[9-11]證實(shí),大量胃腸道疾病與ICC細(xì)胞的功能異常密切相關(guān)。Cx43連接蛋白作為一種主要的縫隙連接蛋白，與機(jī)體多種病理、生理過程密切相關(guān)，其表達(dá)下降或缺失與多種疾病相關(guān)，如：心律失常、胃癌的腹膜轉(zhuǎn)移、功能性消化不良等[12-14]。有研究表明，ICC與胃腸道神經(jīng)元之間、與消化道平滑肌之間及ICC細(xì)胞之間存在大量由緊密并置的質(zhì)膜形成的縫隙連接，腸神經(jīng)系統(tǒng)的信號(hào)可以通過腸神經(jīng)系統(tǒng)-ICC-消化道平滑肌形成的網(wǎng)絡(luò)體系之間的Cx43，將信號(hào)由腸神經(jīng)通過ICC傳遞到平滑肌，進(jìn)而調(diào)節(jié)胃腸道平滑肌運(yùn)動(dòng)[15]。

通過本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，快速進(jìn)入高海拔地區(qū)后，伴隨大鼠小腸電活動(dòng)明顯受損，特別是其波幅衰減尤為顯著，ICC的微觀結(jié)構(gòu)出現(xiàn)明顯損傷，尤其是縫隙連接明顯稀疏、松散，提示ICC細(xì)胞間及其與平滑肌細(xì)胞之間的跨膜信號(hào)傳導(dǎo)基礎(chǔ)受到損傷。雙重免疫熒光組織化學(xué)染色結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，ICC細(xì)胞的表達(dá)也同樣于高海拔3 d組明顯降低，表明其正常生理功能同樣受損。Cx43表達(dá)變化則與ICC表達(dá)改變同步，在高海拔3 d組明顯降低，激光共聚焦顯微鏡下可見其表達(dá)于ICC細(xì)胞的胞體及突起上的部分降低明顯，可能妨礙細(xì)胞之間物質(zhì)信號(hào)的傳遞，尤其是ICC細(xì)胞之間及其與平滑肌之間的信號(hào)傳遞，進(jìn)而引起小腸蠕動(dòng)功能異常?？梢娍焖龠M(jìn)入高海拔地區(qū)后不但作為胃腸電起始者及傳播者的ICC細(xì)胞本身發(fā)生損傷性改變，作為信號(hào)傳播通道的Cx43也發(fā)生功能性變化，即胃腸電生理信號(hào)的起始、傳播的中轉(zhuǎn)站及傳播通道均發(fā)生損傷性改變，導(dǎo)致正常的電生理信號(hào)無法順利產(chǎn)生并傳遞至消化道平滑肌，導(dǎo)致小腸動(dòng)力紊亂的發(fā)生，可能是快速進(jìn)入高海拔地區(qū)胃腸動(dòng)力紊亂形成的重要機(jī)制之一。

圖3大鼠快速進(jìn)入高海拔地區(qū)后對小腸c-kit及Cx43表達(dá)A：低海拔對照組(40×)；B：高海拔3 d組(40×)；C：高海拔14 d組(20×)

Fig3Expressionsofc-kitandCx43inrats’smallintestinebyascendingtohighaltitudeA：low altitude group(40×)；B：high altitude 3 days group(40×)；C：high altitude 14 days group(20×)

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(責(zé)任編輯：馬 軍)

Effects of expressions of interstitial cell of Cajal and Connexin43in small intestine of rats after ascending to high altitude

ZHU Lin, HE Wei, FAN Xing’ai, YANG Shengyue, LIU Ruinian, CHEN Lei

Department of Gastroenterology, the Fourth Hospital of PLA, Xi’ning 810007, China

ObjectiveTo investigate the role of interstitial cell of Cajal (ICC) and the gap junction Connexin 43 (Cx43) in small intestine dynamic disorders in high altitude exposed rats.MethodsThirty SD male rats were divided into 3 groups, each group contained 10 rats. Control group was located in low altitude (Xi’an, 400 m). On the basis of duration time after entering high altitude (4 300 m), rats were divided into 3 days group and 14 days group. The rats’ small intestine electrical activity was measured in different groups. Electron microscope was applied to observe the physiological ultrastructure of ICC, and the immunofluorescence staining was applied to observe the expressions of ICC and Cx43 in small intestine.ResultsThe amplitude and frequency of small intestine electrical activity of rats were the lowest in high altitude 3 days group (P<0.05). The gap junctions and organelles of ICC were reduced, and apoptotic bodies were observed in 3 days group by electron microscope. The expressions of ICC and Cx43 were also observed to be the lowest in high altitude 3 days group (P<0.05).ConclusionThe absence of ICC and Cx43 expressions, and the destruction of the gap junction may induce the dysfunctions of intercellular substance exchange and communication transmission among ICC, ICC and smooth muscle cell, which may partly be responsible for the pathogenesis of small intestine dynamic disorders in high altitude exposed rats.

Mountain sickness; High altitude; Small intestine motility; Interstitial cell of Cajal; Connexin 43; Rat

10.3969/j.issn.1006-5709.2017.09.021

R574.5

：A

：1006-5709(2017)09-1048-04

：2016-11-14

青海省(應(yīng)用)基礎(chǔ)研究項(xiàng)目(2013-Z-760)

朱琳，主治醫(yī)師，碩士，研究方向：功能性胃腸病。E-mail: 298567115@qq.com

賀巍，副主任醫(yī)師，碩士，研究方向：功能性胃腸病。E-mail: hewei.1971@163.com