師一民 王永強(qiáng) 安 辰 趙 暉 李君玲 齊 放 張秋霞 陳振振 樊永平 李 明 王 蕾

(1 首都醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院，中醫(yī)絡(luò)病研究北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京，100069； 2 首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京天壇醫(yī)院，北京，100050)

補(bǔ)腎益髓方及其拆方對自身免疫性腦脊髓炎小鼠腦和脊髓中BDNF/TrkB的影響

師一民1王永強(qiáng)1安 辰1趙 暉1李君玲1齊 放1張秋霞1陳振振1樊永平2李 明1王 蕾1

(1 首都醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院，中醫(yī)絡(luò)病研究北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京，100069； 2 首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京天壇醫(yī)院，北京，100050)

目的：觀察補(bǔ)腎益髓(Bu Shen Yi Sui，BSYS)方及其拆方補(bǔ)腎(Bu Shen，BS)和化痰活血(Hua Tan Huo Xue，HTHX)方對實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎(Experimental Autoimmune Encephalomyelitis，EAE)小鼠腦和脊髓中腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(Brain-derived Neurotrophic Factor，BDNF)與受體TrkB的影響。方法：將EAE造模小鼠于當(dāng)天和第7天背部皮下注射髓鞘少突膠質(zhì)細(xì)胞糖蛋白(Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein，MOG)35-55抗原，并在免疫當(dāng)天和第2天后腹腔注射百日咳毒素(Pertussis toxin，PTX)。每日對小鼠進(jìn)行不同藥物的灌胃，并于造模第20和40天分別取腦和脊髓，采用實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR(qRT-PCR)與Western Blot法檢測BDNF和TrkB的表達(dá)。結(jié)果：BSYS及其拆方BS方與HTHX方均可明顯上調(diào)EAE小鼠腦和脊髓BDNF和TrkB mRNA與蛋白的表達(dá)，與模型組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)。BSYS方作用優(yōu)于其BS與HTHX方，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論：BSYS及其拆方促進(jìn)軸突修復(fù)的作用可能與增強(qiáng)BDNF/TrkB表達(dá)有關(guān)，BSYS全方更有顯著趨勢。

補(bǔ)腎益髓方；拆方；多發(fā)性硬化；實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎；腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子/TrkB

實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎(Experimental Autoimmune Encephalomyelitis，EAE)是一種T細(xì)胞介導(dǎo)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病，由于其臨床表現(xiàn)和病理變化與人類多發(fā)性硬化癥非常相似，因此，目前常常制備動物EAE作為研究MS的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蚚1]。前期研究發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)腎益髓(Bu Shen Yi Sui，BSYS)方對MS患者及其EAE動物模型具有明顯的神經(jīng)保護(hù)作用[2]。拆方研究發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)腎益髓及其拆方補(bǔ)腎和化痰活血(HTHX)方均能降低EAE小鼠的神經(jīng)功能評分，減輕其腦和脊髓的病理炎性反應(yīng)損傷，減輕軸突損傷和促進(jìn)其神經(jīng)修復(fù)[3-5]。但其促進(jìn)損傷的軸突修復(fù)機(jī)制還不清楚。研究證實(shí)，神經(jīng)營養(yǎng)因子能夠促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞的存活、生長、分化。在眾多的神經(jīng)生長因子中，腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(Brain-derived Neurotrophic Factor，BDNF)是成年大鼠腦內(nèi)分布最為廣泛的神經(jīng)營養(yǎng)因子，主要在皮質(zhì)和海馬中合成。BDNF共有2個(gè)受體，一個(gè)是低親和力的P75受體，另一個(gè)是高親和力受體Trk，BDNF與TrkB結(jié)合后激活RAS/ERK與PI3K/AKT信號通路，進(jìn)而調(diào)節(jié)其下游分子來發(fā)揮其神經(jīng)修復(fù)作用[6-8]。TrkB受體在此信號通路中起著至關(guān)重要的作用。其為了深入探討補(bǔ)腎益髓及其拆方促進(jìn)在軸突修復(fù)的作用機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)主要采用實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR(qRT-PCR)與Western Blot法觀察補(bǔ)腎益髓及其拆方補(bǔ)腎和化痰活血方對EAE小鼠腦與脊髓中BDNF和TrkB表達(dá)的影響。

1材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物 70只SPF級C57BL/6雌性小鼠(體重15～17 g)購于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司[許可證號為SCXK(京)2012-0001]。動物飼養(yǎng)于首都醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心(許可證號SYXK(京)2010-0020)的獨(dú)立通氣籠內(nèi)，溫度18～22 ℃，相對濕度40% ～60%，自由飲水和飲食。所有實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目均通過首都醫(yī)科大學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)藥物補(bǔ)腎益髓及其拆方補(bǔ)腎和化痰活血方均有北京亞東生物制藥有限公司制備。補(bǔ)腎益髓方由生地黃、熟地黃、浙貝母、水蛭、全蝎、益母草等組成；補(bǔ)腎方由生地黃、熟地黃等組成；化痰活血方由浙貝母、水蛭、全蝎、益母草等組成。醋酸潑尼松片(Prednisone Acetate，PA)由天津力生制藥有限公司生產(chǎn)，梓醇(Catapol，CA)由杭州康木科技有限公司提供。

1.1.3 主要試劑髓鞘少突膠質(zhì)細(xì)胞糖蛋白(Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein，MOG)35-55由北京旭和源生物科技有限公司合成；滅活結(jié)核分支桿菌(Mycobacterium Tuberculosis，TB，貨號231141)由美國BD公司提供。完全弗氏佐劑(Complete Freund′s Adjuvant，CFA，貨號F5881)、百日咳毒素(Pertussis Toxin，PTX，貨號P7208)均由美國Sigma公司提供；PCR引物由大連TaKaRa公司合成，RNA prep pure動物組織總RNA提取試劑盒(離心柱型)(DP431)，TIANScript cDNA第一鏈合成試劑盒(KR104)，RealMasterMix(SYBR Green)試劑盒(FP204)，2×Taq PCR MasterMix(KT201-01)，50bp DNA Ladder(MD108)，MarkⅢ(MD103)，GeneGreen核酸染料(RT210)，均購自天根生化科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 將小鼠隨機(jī)分為7組：正常(NC)、模型(MO)、PA組、CA組、BS組、HTHX組及BSYS組。每組10只。EAE造模小鼠于造模當(dāng)天與造模后第7天背部皮下注射0.2 mL抗原，包括MOG35-55(50 μg)、CFA(100 μL)和TB(0.3 mg)，當(dāng)天和第2天后腹腔注射500 ng的PTX。NC小鼠注射相同劑量的生理鹽水。

1.2.2 給藥方法 BSYS方組小鼠給予BSYS混懸液(3.02 g生藥/kg體重)灌胃；BS方組給予BS混懸液(1.44 g生藥/kg體重)；HTHX方組給予HTHX混懸液(1.57 g生藥/kg體重)；PA組小鼠給予PA混懸液(5 mg/kg體重)；CA組給予CA(40 mg/kg體重)；NC和MO組均給予等體積的蒸餾水灌胃。1次/d，共計(jì)40 d。

1.2.3 標(biāo)本采集 于造模第20天(急性期)和第40天(緩解期)，小鼠10%水合氯醛(190 mg/kg)腹腔注射麻醉后，取其腦及脊髓，快速放入液氮后移至-80 ℃冷凍保存。

1.2.4 qRT-PCR檢測小鼠腦及脊髓中BDNF、TrkB mRNA的表達(dá) 按照動物組織總RNA提取試劑盒說明書提取小鼠腦組織與脊髓組織RNA，然后根據(jù)RT-PCR kit的說明反轉(zhuǎn)錄為cDNA。引物序列見表1。擴(kuò)增條件為95 ℃ 5 min變性，95 ℃ 10 s，52 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共40個(gè)循環(huán)。以基因β-tubulin為內(nèi)參對照，2-△△Ct(Ct代表循環(huán)閥值)表示BDNF和TrkB mRNA相對表達(dá)量。

1.2.5 Western Blot檢測小鼠腦及脊髓中BDNF和TrkB蛋白的表達(dá) 取小鼠腦與脊髓組織，按1∶7的比例加入蛋白裂解液，勻漿后，置于冰上30 min，4 ℃離心20 min后，取上清液。建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，每孔加上清液100 μL，將96孔板置于37 ℃，反應(yīng)120 min后，嚴(yán)格按照試劑盒說明書步驟進(jìn)行檢測。用酶標(biāo)儀測定450 nm處吸光值，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算樣本濃度，根據(jù)樣本蛋白濃度，稀釋使其終濃度為3 μg/μL。取樣本7 μL(含21 μg蛋白)蛋白樣品進(jìn)行10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳，電轉(zhuǎn)50 min，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，分別加入BDNF(1∶10 000)/TrkB(1∶20 000)/β-tubulin(1∶100 000)的單克隆抗體，4 ℃過夜后，TBST洗膜4次，每次10 min，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗(1∶20 000，抗兔/小鼠)，室溫孵育1 h，洗膜4次，每次5 min后，于暗室進(jìn)行膠片曝光、顯影和定影。通過Image J圖像分析系統(tǒng)測定各蛋白條帶的灰度值，以目的蛋白條帶的灰度值與內(nèi)參β-tubulin條帶灰度值的比值表示各蛋白的相對表達(dá)水平。

表1 引物序列

2結(jié)果

2.1.1 BSYS及其拆方BS和HTHX方對EAE小鼠腦與脊髓中BDNF mRNA表達(dá)的影響 QRT-PCR結(jié)果顯示，在造模的第20天和第40天，MO組小鼠腦和脊髓的BDNF mRNA表達(dá)較NC組明顯下降(P<0.01)。與MO組比較，各觀察組均能顯著升高BDNF mRNA表達(dá)，尤其PA和BSYS方組差異更為明顯(P<0.01)，但治療各組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表2。

表2 7組小鼠腦和脊髓中BDNF mRNA的變化

注：與NC組比較，**P<0.01；與MO組比較，△P<0.05，△△P<0.01

2.1.2 BSYS及其拆方BS和HTHX方對EAE小鼠腦與脊髓中TrkB mRNA表達(dá)的影響 qRT-PCR結(jié)果顯示，在造模第20天和第40天時(shí)，和NC組比較，MO組小鼠腦和脊髓的TrkB mRNA表達(dá)明顯下降(P<0.01)。與MO組比較，各觀察組均能顯著升高TrkB mRNA表達(dá)，尤其PA和BSYS方組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。而治療各組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

表3 7組小鼠腦和脊髓中TrkB mRNA的變化

注：與NC組比較，**P<0.01；與MO組比較，△P<0.05，△△P<0.01

2.1.3 BSYS及其拆方BS和HTHX方對EAE小鼠腦與脊髓中BDNF蛋白表達(dá)的影響 WB結(jié)果顯示，第20天和第40天，MO組小鼠腦和脊髓的BDNF蛋白表達(dá)較NC組明顯下降(P<0.01)。與MO組比較，各觀察組均能顯著升高BDNF蛋白表達(dá)，尤其PA和BSYS方組更為明顯(P<0.01)，但治療各組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖1-2，表4。

表4 7組小鼠腦和脊髓中BDNF蛋白的變化

注：與NC組比較，**P<0.01；與MO組比較，△P<0.05，△△P<0.01

圖1 各組小鼠腦中BDNF蛋白的表達(dá)

圖2 7組小鼠脊髓中BDNF蛋白的表達(dá)

2.1.4 BSYS及其拆方BS和HTHX方對EAE小鼠腦與脊髓中TrkB蛋白表達(dá)的影響 WB結(jié)果顯示，第20天和第40天，MO組小鼠腦和脊髓的TrkB蛋白表達(dá)較NC組明顯下降(P<0.01)。與MO組比較，各觀察組均能顯著升高TrkB蛋白表達(dá)，尤其PA和BSYS方組更為明顯(P<0.01)，但治療各組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖3-4，表5。

圖3 7組小鼠腦中TrkB蛋白的表達(dá)變化

圖4 7組小鼠脊髓中TrkB蛋白的表達(dá)

組別只數(shù)腦第20天第40天脊髓第20天第40天NC4193±072199±034192±029197±010MO4040±014??056±004??042±004??057±010??PA4174±030△△183±021△△177±012△△182±008△△CA4090±014△105±007△090±009△102±011△BS4144±016△△165±021△△140±025△△160±012△△HTHX4092±056△108±006△091±005△103±009△BSYS4173±033△△189±023△△177±024△△185±020△△

注：與NC組比較，**P<0.01；與MO組比較，△P<0.05，△△P<0.01

3討論

BDNF是1982年由德國生物學(xué)家Barde及其同事首次從豬腦中純化并發(fā)現(xiàn)具有防止神經(jīng)元死亡功能的一種蛋白質(zhì)，是目前研究最為廣泛的神經(jīng)營養(yǎng)因子之一。內(nèi)嗅皮層是位于顳葉、鄰近海馬的區(qū)域，內(nèi)嗅皮層和海馬通過纖維投射和神經(jīng)元換元，形成內(nèi)嗅皮層-海馬環(huán)路[9-10]。內(nèi)嗅皮層是BDNF產(chǎn)生的主要部位，并能夠轉(zhuǎn)運(yùn)到海馬[11]。Marchetti和Marie[12]認(rèn)為BDNF和TrkB的減少會降低突觸可塑性和損傷神經(jīng)元，是皮層和海馬損傷的主要原因。有研究結(jié)果顯示BDNF與其受體TrkB共同作用可增加突觸可塑性，促進(jìn)軸突及樹突生長，增加突觸末端密度[13-14]，并激活下游的PI3K/AKT通路發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用[15-16]。

本課題組的前期研究發(fā)現(xiàn)，EAE小鼠存在軸突損傷狀態(tài)，主要表現(xiàn)在神經(jīng)細(xì)胞骨架蛋白β-tubulin、NF200及MAP-2顯著下降，而β-APP，P-Tau及CSPGs則顯著上升，說明神經(jīng)軸突損傷后神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸物質(zhì)、塑性等方面發(fā)生障礙。經(jīng)過BSYS及其拆方BS與HTHX方治療后，上述指標(biāo)得到了明顯改善[3-5]，說明BSYS及其BS與HTHX方對EAE小鼠軸突損傷修復(fù)作用。但其作用機(jī)制不清楚。近年來研究發(fā)現(xiàn)，軸突修復(fù)再生過程中存在著多種影響因素，神經(jīng)營養(yǎng)因子類物質(zhì)的缺乏是導(dǎo)致再生困難的主要因素之一。BDNF與其TrkB受體參與了神經(jīng)保護(hù)作用[8]。MS和EAE小鼠腦BDNF表達(dá)顯著降低，基因敲除BDNF缺失后制備EAE小鼠模型，其神經(jīng)損傷癥狀加重[17]。本實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)，EAE小鼠的神經(jīng)營養(yǎng)因子BDNF及其受體TrkB的基因和蛋白表達(dá)無論在急性期還是在緩解期均明顯降低。但在MS患者脫髓鞘區(qū)域BDNF表達(dá)增高，推測是起到神經(jīng)保護(hù)和自我修復(fù)作用[18]。外源性BDNF可以延長其潛伏期，降低神經(jīng)功能評分[19]。而經(jīng)過BSYS及其拆方BS與HTHX方治療后，BDNF/TrkB的表達(dá)明顯增加。結(jié)合前期發(fā)現(xiàn)的BSYS及其拆方BS與HTHX方能夠促進(jìn)軸突再生修復(fù)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，推測BSYS及其拆方促進(jìn)軸突修復(fù)的作用機(jī)制可能與增加神經(jīng)營養(yǎng)因子及其受體的表達(dá)有關(guān)，并且BSYS全方較拆方的作用更有顯著趨勢。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，BDNF-TrkB活化后激活其下游信號的PI3K/AKT通路，并參與了軸突損傷后的神經(jīng)修復(fù)。研究MS患者大腦白質(zhì)的基因表達(dá)發(fā)現(xiàn)PI3K/AKT信號通路有助于腦內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定與神經(jīng)保護(hù)作用[20]。上述研究為BSYS方治療MS的機(jī)制提供的部分客觀依據(jù)，深入的作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

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(2016-11-10收稿 責(zé)任編輯：楊覺雄)

EffectsofBushenyisuiFormulaandItsDecomposedFormulasonExpressionsofBDNF/TrkBinBrainandSpinalCordofMicewithExperimentalAutoimmuneEncephalomyelitis

Shi Yimin1,Wang Yongqiang1,An Chen1,Zhao Hui1,Li Junling1,Qi Fang1,Zhang Qiuxia1, Chen Zhenzhen1,Fan Yongping2,Li Ming1,Wang Lei1

(1CapitalMedicalUniversity,Beijing100069,China; 2BeijingTiantanHospitalAffiliatedCapitalMedicalUniversity,Beijing100050,China)

Objective:To observe effects of Bushenyisui (BSYS) formula and its decomposed formulas,Bu Shen (BS) and Hua Tan Huo Xue (HTHX),on the expressions of brain-derived neurotrophic factor (BDNF) and TrkB in the brain and spinal cord of mice with experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE).Methods:The EAE mice were injected subcutaneously with the myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG)35-55in the back on the 1st day and the 7th,and were injected intraperitoneally with pertussis toxin (PTX).All the mice were administered intragastrically with the different medicine or distilled water once a day.The brain and spinal cord of mice were removed for the examination on day 20th and 40th.The expressions of BDNF and TrkB mRNA and proteins were detected by real time fluorescent quantitative (qRT-PCR) and Western Blot analysis.Results:The expressions of BDNF and TrkB in the brain and spinal cord of EAE mice were significantly up-regulated by BSYS and its decomposed BS and HTHX,compared with the EAE mice (P<0.05).The effective trend of BSYS on the above indexes was better than that of the decomposed BS and HTHX formulas,but there was no statistical significance (P>0.05).Conclusion:The effect of BSYS and its decomposed formulas,BS and HTHX,on promoting axonal repair might be related to enhance the expression of BDNF/TrkB,and that of BSYS was more significant.

Bu Shen Yi Sui and its decomposed formulas; Multiple sclerosis; Experimental autoimmune encephalomyelitis; BDNF/TrkB

R228;R242

：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2017.09.041

國家自然基金項(xiàng)目(81273742，81573898)；北京市教委重點(diǎn)項(xiàng)目(KZ201310025023)；北京市屬高等學(xué)校高層次人才引進(jìn)與培養(yǎng)計(jì)劃-長城學(xué)者項(xiàng)目(CIT&TCD20140329)

師一民(1990.06—)，男，在讀碩士，首都醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院，主要從事中醫(yī)藥防治腦病的基礎(chǔ)研究

李明(1963.11—)，女，博士，教授，研究方向:方劑配伍規(guī)律及功效機(jī)制研究,E-mail：13611386113@163.com；王蕾(1967.10—)，女，博士，教授，研究方向:中醫(yī)藥防治腦病的功效及機(jī)制研究,Tel：(010)83911626，E-mail：tmwangl@ccmu.edu.cn