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(海南大學(xué)食品學(xué)院,海南海口 570228)

金鯧魚魚皮酶溶性膠原蛋白的提取工藝優(yōu)化及基本特性

廖偉,夏光華,王佳媚,楊晉坤,李永成,申鉉日*

(海南大學(xué)食品學(xué)院,海南?？?570228)

為提高金鯧魚加工副產(chǎn)物——魚皮的利用率,本研究在前期單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,以加酶量、液料比和提取時(shí)間三個(gè)單因素建立模型,采用響應(yīng)面法Box-Behnken設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn),優(yōu)化了胃蛋白酶法提取金鯧魚魚皮酶溶性膠原蛋白(PSC)的提取工藝,并與酸溶性膠原蛋白(ASC)進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳、傅里葉變換紅外光譜和差示掃描量熱儀等基本理化特性的對(duì)比研究。結(jié)果表明,金鯧魚魚皮膠原蛋白的最佳提取工藝為:加酶量1.5%、液料比23∶1 mL/g、酶解時(shí)間27.5 h。此條件下通過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證得出,金鯧魚魚皮膠原蛋白實(shí)際提取率為64.68%,與響應(yīng)面模型理論預(yù)測(cè)值65.17%基本一致;此外,本實(shí)驗(yàn)提取的PSC有較高熱變性溫度(30.44 ℃),與金鯧魚皮ASC有相似的電泳性質(zhì)和紅外峰型,初步鑒定為I型膠原蛋白。該實(shí)驗(yàn)為金鯧魚魚皮酶溶性膠原的提取提供了理論參考。

金鯧魚魚皮,膠原蛋白,響應(yīng)面法,提取工藝

膠原蛋白(collagen)是動(dòng)物結(jié)締組織中最常見的不溶性纖維蛋白,約占蛋白總量的33%[1],廣泛分布在動(dòng)物的皮膚、骨骼與肌腱等組織中。到目前為止,部分研究人員已從眾多原料中提取并鑒定了至少27種不同類型的膠原蛋白(Type I-XXIX),每種類型的膠原在其結(jié)構(gòu)與功能上有顯著不同[2]。其中,研究學(xué)者對(duì)Ⅰ型膠原研究較多,該型膠原蛋白現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、皮革、影像和化妝品工業(yè)中[3-4]。魚皮是生產(chǎn)膠原蛋白的重要原料,具有價(jià)格低廉、來源豐富、安全性高等優(yōu)點(diǎn),現(xiàn)已逐漸成為陸生動(dòng)物膠原蛋白的有效替代品[5]。

金鯧魚(Trachinotusovatus)學(xué)名卵形鯧鲹,體型較大,肉質(zhì)細(xì)嫩,養(yǎng)殖成活率高,一般可達(dá)90%以上,是近年來中國(guó)華南沿海地區(qū)代表性海水養(yǎng)殖品種之一[6]。然而,其魚皮較硬,加工過程中通常剝除丟棄或用作動(dòng)物飼料。隨著金鯧魚養(yǎng)殖量的不斷增大,大量副產(chǎn)物魚皮未能得到高值化利用,且關(guān)于金鯧魚魚皮膠原蛋白的提取工藝、理化特性少有研究。傳統(tǒng)提取膠原蛋白工藝包括熱水浸提,堿法、酸法等,采用這些方法提取膠原蛋白均有不同程度的缺陷,如提取的膠原蛋白不穩(wěn)定易發(fā)生降解、提取周期長(zhǎng)、提取率低等[7]。與上述幾種方法相比,酶法提取膠原蛋白具有提取率高、周期短和膠原蛋白性質(zhì)穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn),能有效增加經(jīng)濟(jì)效益[8]。研究者已通過響應(yīng)面法優(yōu)化了鮟鱇魚皮、鱈魚皮、羅非魚鱗等酶溶性膠原提取工藝,探明了除酶種類外,加酶量、提取時(shí)間、液料比、酶解溫度等因素也會(huì)對(duì)提取率造成影響,但當(dāng)酶解溫度過高時(shí),膠原蛋白易發(fā)生降解[5,9-10]。因此,本實(shí)驗(yàn)在低溫弱酸條件下,選取加酶量、提取時(shí)間、液料比三個(gè)單因素,采用響應(yīng)面模型優(yōu)化金鯧魚魚皮酶溶性膠原提取過程,并通過聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)、紅外光譜(ATR-FTIR)與差示掃描量熱儀(DSC)等技術(shù)手段對(duì)金鯧魚皮膠原的理化性質(zhì)進(jìn)行了對(duì)比分析。

1 材料與方法

1.1材料與儀器

新鮮金鯧魚魚皮 海南祥泰漁業(yè)股份有限公司提供,冷藏狀態(tài)轉(zhuǎn)運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室,去肉洗凈在-20 ℃下冷藏以備用;羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)品 上海信裕生物科技有限公司;胃蛋白酶(活性800～2500 U/mg) Sigma公司;I型豬皮膠原蛋白 四川銘讓生物科技有限公司;其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純;實(shí)驗(yàn)室用水均為去離子水。

Stratos高速冷凍離心機(jī) 美國(guó)賽默飛公司;Eyel4冷凍干燥機(jī) 日本Tokyo Rikakikai公司;Dycz-24dn垂直電泳系統(tǒng) 北京市六一儀器廠;Tensor27傅里葉變換紅外光譜儀 德國(guó)Bruker公司;DSC131EV差示掃描熱量?jī)x 法國(guó)塞塔拉姆儀器公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 基本成分分析 水分含量測(cè)定參考GB/T 5009.3-2010[11],采用105 ℃常壓干燥法;蛋白質(zhì)含量測(cè)定參考GB/T 5009.5-2010[12],釆用凱氏定氮法;灰分含量測(cè)定參考GB/T 5009.4-2010[13],釆用高溫灼燒法;脂肪含量測(cè)定參考GB/T 5009.6-2003[14],采用索氏抽提法。

1.2.2 羥脯氨酸含量測(cè)定 羥脯氨酸是膠原所特有的氨基酸,通過測(cè)定羥脯氨酸的含量,乘以相應(yīng)的系數(shù)即可得到樣品中膠原蛋白含量[15]。繪制羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線:吸取不同濃度的羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)液1 mL加入150 mL檸檬酸緩沖液和250 mL氯胺T溶液混合均勻,經(jīng)25 ℃恒溫氧化后加入1 mL高氯酸(3.5 mol/L);10 min后加入1 mL對(duì)二甲基苯甲醛顯色試劑,在65 ℃水浴顯色,冷卻后在560 nm處測(cè)定吸光值。以羥脯氨酸質(zhì)量濃度(x)和對(duì)應(yīng)的吸光度(y)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,擬合回歸方程。

樣品中膠原蛋白含量(%)=羥脯氨酸含量(%)×11.1

式(1)

1.2.3 魚皮膠原蛋白的分離與提取 參考Duan[16]的方法略有修改,所有操作均在4 ℃下進(jìn)行。將新鮮金鯧魚皮剪成小塊,浸泡在0.1 mol/L的NaOH溶液中36 h,以除去雜蛋白和灰分;處理后的魚皮反復(fù)沖洗至中性,隨后浸泡在10%的正丁醇溶液中24 h以脫脂;將脫脂后的樣品溶于0.5 mol/L乙酸中,根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的料液比、胃蛋白酶、時(shí)間進(jìn)行浸提;浸提后用兩層紗布過濾,濾液于12000×g下低溫離心15 min以去除不溶物,收集上清液,添加NaCl鹽析至終濃度0.9 mol/L;在10000×g下低溫離心15 min,收集沉淀后溶于乙酸;收集后的樣品液依次用0.1 mol/L的乙酸和蒸餾水為外液各透析24 h,隨后在真空冷凍干燥機(jī)下冷凍干燥即為酶溶性膠原蛋白(PSC)。酸溶性膠原蛋白(ASC)采用相同的方法在不添加胃蛋白酶的情況下進(jìn)行提取,同時(shí)用作實(shí)驗(yàn)對(duì)照。

膠原蛋白提取率(%)=提取液中膠原蛋白含量(g)/樣品中膠原蛋白的含量(g)×100

式(2)

1.2.4 單因素實(shí)驗(yàn) 根據(jù)前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果和相關(guān)文獻(xiàn)[9,17-18],選取膠原蛋白溶解過程中的三個(gè)關(guān)鍵因素(加酶量、液料比和提取時(shí)間)。設(shè)定加酶量1.5%、液料比20∶1、提取時(shí)間24 h,進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn),考察加酶量0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%;液料比10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1 mL/g;提取時(shí)間12、18、24、30、36 h對(duì)金鯧魚魚皮酶溶性膠原提取率的影響。

1.2.5 響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn) 在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上,采用響應(yīng)面Box-Behnken設(shè)計(jì)三因素三水平的實(shí)驗(yàn)方案。實(shí)驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)見表1。

表1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)因素及水平表Table 1 Factors and levels used in orthogonal array design

1.2.6 聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分析 先配制膠原蛋白水溶液(2.5,w/v),隨后與試樣處理液均勻混合(1∶1,v/v),沸水浴5～10 min制樣,冷卻以備用。根據(jù)LaemmLi[19]的方法,采用不連續(xù)的三羥甲基氨基甲烷-甘氨酸電泳系統(tǒng),在7.5%的分離膠和4%的濃縮膠,80 V穩(wěn)流電壓的條件下進(jìn)行。市售Ⅰ型豬皮膠原蛋白作為對(duì)照

1.2.7 傅里葉變換紅外光譜(ATR-FTIR)分析 取適量膠原樣品,與KBr粉末在干燥燈下充分研磨,壓片。隨后將片狀樣品置于樣品室內(nèi)測(cè)定。光譜掃描范圍為4000～500 cm-1,分辨率2 cm-1,掃描次數(shù)為4次。

1.2.8 差示掃描量熱(DSC)分析 參考楊玲等[20]法,膠原樣品溶于水中(1∶40,w/v),靜置24 h

表2 金鯧魚魚皮基本成分(濕重)Table 2 General composition of the skin of Golden pompano(wet weight)

以混勻。隨后稱取樣品溶液9～15 mg于鋁鍋中,加蓋密封,置于樣品槽中待測(cè)定。設(shè)置掃描溫度為15～50 ℃,掃描速度為2 ℃/min。

1.3數(shù)據(jù)處理

每個(gè)樣品實(shí)驗(yàn)復(fù)3次,數(shù)據(jù)通過SPSS 17.0分析處理,用x±s表示。

2 結(jié)果與分析

2.1金鯧魚魚皮成分分析

表2列出了金鯧魚魚皮的基本化學(xué)成分,數(shù)據(jù)顯示其含水量為65.14%;干物質(zhì)含量為34.56%,其中干物質(zhì)主要為蛋白質(zhì),約占總質(zhì)量的23.48%,高于已經(jīng)報(bào)道的經(jīng)濟(jì)養(yǎng)殖魚草魚(16.56%)和美國(guó)紅魚(19.46%)[21-22],因此金鯧魚魚皮可視作是較好的蛋白質(zhì)來源。此外,金鯧魚魚皮中含有8.02%的脂肪和1.36%的灰分,說明魚皮膠原的提取也需要經(jīng)歷脫脂和脫灰等過程。

2.2標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

根據(jù)測(cè)定的數(shù)值,得到羥脯氨酸回歸方程y=0.094x+0.0087,R2=0.9973(圖1)。通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得到金鯧魚皮的羥脯氨酸含量為1.78%,乘以換算系數(shù)11.1[15],得出膠原蛋白含量為19.57%±1.37%,占魚皮粗蛋白含量的83.33%,進(jìn)一步說明金鯧魚魚皮富含膠原蛋白。

圖1 羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of L-hydroxyproline

2.3單因素實(shí)驗(yàn)

2.3.1 加酶量對(duì)膠原蛋白提取率的影響 加酶量對(duì)金鯧魚魚皮膠原蛋白提取率的影響如圖2所示,在加酶量0.5%～1.0%之間,膠原蛋白提取率隨著加酶量的增加而顯著增加(p<0.05),但當(dāng)加酶量達(dá)到1.5%后開始下降,這與王珮等[5]的研究報(bào)道相似,這可能由于底物的量是一定的,酶與底物結(jié)合已達(dá)到飽和,而過量的酶會(huì)導(dǎo)致膠原蛋白降解,因此選擇加酶量1.5%作為較優(yōu)水平。

圖2 加酶量對(duì)金鯧魚魚皮膠原蛋白提取率的影響Fig.2 Effect of enzyme concentration oncollagen yield from skin of Golden pompano

2.3.2 液料比對(duì)膠原蛋白提取率的影響 液料比對(duì)金鯧魚魚皮膠原蛋白提取率的影響如圖3所示,膠原蛋白提取率隨液料比的增大先呈增加趨勢(shì),至20∶1 mL/g處達(dá)到最大后呈減小趨勢(shì)。結(jié)果表明:當(dāng)液料比較低時(shí)(<15∶1 mL/g),金鯧魚皮不能完全溶解,所以提取率低,而當(dāng)液料比較高時(shí)可能造成蛋白分離純化過程中損失增大,所以提取率也低;而在20∶1 mL/g處魚皮可完全溶解且提取率達(dá)到最大,因此選擇20∶1 mL/g作為較優(yōu)水平。

圖3 液料比對(duì)金鯧魚魚皮膠原蛋白提取率的影響Fig.3 Effect of water/solid ratioon collagen yield from skin of Golden pompano

2.3.3 提取時(shí)間對(duì)膠原蛋白提取率的影響 提取時(shí)間對(duì)金鯧魚魚皮膠原蛋白提取率的影響如圖4所示,在提取時(shí)間12～24 h,膠原蛋白提取率隨時(shí)間的延長(zhǎng)而顯著提高(p<0.05),但當(dāng)提取時(shí)間超過24 h后,提取率再無顯著變化(p>0.05),考慮到提取成本、結(jié)合工業(yè)生產(chǎn)實(shí)際需要,選擇24 h為較優(yōu)水平。

圖4 提取時(shí)間對(duì)金鯧魚魚皮膠原蛋白提取率的影響Fig.4 Effect of extraction timeon collagen yield from skin of Golden pompano

2.4響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)

響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案和實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表3所示。

表3 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果Table 3 Experimental design and results of response surface

2.4.1 方差分析 對(duì)響應(yīng)面結(jié)果進(jìn)行多元回歸分析,得到回歸模型方差分析結(jié)果如表4所示。從結(jié)果可知,加酶量、液料比和提取時(shí)間的一次項(xiàng)、二次項(xiàng)影響顯著,交互項(xiàng)影響不明顯,說明各因素對(duì)金鯧魚魚皮膠原蛋白提取率不是簡(jiǎn)單的線性影響。響應(yīng)面回歸方程如下:Y=60.62+5.16A+12.15B+6C-3.18AB-1.66AC-0.76BC-7.92A2-10.85B2-6.58C2,R2=9.72,整體模型的Prob>F值小于0.05,并且失擬項(xiàng)不顯著,因此該回歸方程顯著,說明該響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)方案設(shè)計(jì)可靠。

表4 回歸模型方差分析結(jié)果Table 4 The results of variance analysis for the regression model

注:p<0.01,差異極顯著;p<0.05,差異顯著。

2.4.2 響應(yīng)面分析 由圖5a可知,提取時(shí)間固定不變,隨著A(加酶量)的增加,膠原蛋白提取率呈先增后減的趨勢(shì),這說明過量的酶可能會(huì)使膠原蛋白發(fā)生降解。從等高線分析,當(dāng)加酶量較低時(shí)等高線較密,說明在開始階段加酶量對(duì)提取率影響顯著。圖5b可知,加酶量固定不變,隨著B(料液比)的增加,提取率呈先增后減的趨勢(shì),另外從等高線密度可知,料液比對(duì)提取率的影響逐漸遞減。由圖5c可知,液料比固定不變,隨著C(提取時(shí)間)的不斷增加,膠原蛋白提取率呈先增后趨平穩(wěn)的趨勢(shì),這可能是因?yàn)橐宜釋?duì)膠原蛋白的溶解已達(dá)到飽和。綜上所述,實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的三個(gè)單因素兩兩交互作用均有最大值,表明該響應(yīng)面優(yōu)化方案合理,能較好地反映三個(gè)因素對(duì)金鯧魚魚皮膠原蛋白提取率的影響。

圖5 各兩因素交互作用對(duì)金鯧魚魚皮膠原蛋白提取率影響的響應(yīng)面圖Fig.5 Response surface showing the effects of various operatingparameters on collagen yield from skin of Golden pompano

2.4.3 提取工藝確定分析 求解回歸方程,得到酶法提取金鯧魚皮膠原蛋白的最佳工藝條件為:加酶量1.53%、液料比23.15∶1 mL/g、提取時(shí)間27.60 h。在此條件下金鯧魚膠原蛋白提取率可達(dá)65.17%?？紤]工業(yè)利用的方便,將最優(yōu)條件修改為加酶量1.5%、液料比23∶1 mL/g、提取時(shí)間27.5 h。在此條件下驗(yàn)證膠原蛋白實(shí)際提取率為64.68%,與理論值的誤差為0.49%,證明該響應(yīng)面模型合理可靠。并且,酶法提取膠原蛋白過程中所用的試劑均價(jià)格低廉,且胃蛋白酶使用量低,從成本角度考慮此方法可實(shí)現(xiàn)金鯧魚魚皮的高價(jià)值化利用。

2.5基本特性研究

2.5.1 SDS-PAGE電泳分析 圖6為金鯧魚魚皮PSC與ASC電泳圖,與市售I型豬皮膠原蛋白作對(duì)照。

從圖6中觀察,金鯧魚魚皮PSC和ASC均有兩條α鏈(α1和α2)、一條β鏈,其中α1鏈條帶色度接近于α2鏈的兩倍,這與大鯢皮和鱘魚魚皮膠原電泳結(jié)果相似[7,20]。通過對(duì)比標(biāo)準(zhǔn)品計(jì)算可得,金鯧魚魚皮PSC和ASCα1鏈分子量約為118 kDa和120 kDa,α2鏈分子量約為115 kDa和116 kDa,與對(duì)照組I型豬皮膠原無明顯差異。此外,魚皮PSC的分子量相比ASC稍低,這可能是胃蛋白對(duì)PSC端肽區(qū)域進(jìn)行了部分切割所導(dǎo)致的[23]。綜上,此實(shí)驗(yàn)分離提取的金鯧魚魚皮PSC初步鑒定為I型膠原,并且膠原的主要結(jié)構(gòu)未受到胃蛋白酶的影響。

圖6 金鯧魚魚皮PSC和ASC電泳圖Fig.6 SDS-PAGE of PSCand ASC from skin of Golden pompano注:1.Markers;2.金鯧魚魚皮PSC;3.金鯧魚魚皮ASC;4.豬皮PSC。

圖7 金鯧魚魚皮PSC和ASC紅外光譜圖Fig.7 IR spectra of PSC and ASCfrom skin of Golden pompano

金鯧魚皮PSC和ASC酰胺I帶吸收峰出現(xiàn)在1650.4和1651.2 cm-1,是由C=O伸縮振動(dòng)引起,酰胺Ⅰ帶與膠原蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)密切相關(guān),是因?yàn)镃=O不受肽鏈側(cè)基的影響,只取決于肽鏈的構(gòu)型[26]。PSC和ASC酰胺Ⅱ帶吸收峰出現(xiàn)在1547.4和1548.3 cm-1,是由N-H彎曲和C-N伸縮振動(dòng)引起。研究報(bào)道α鏈上的N-H與氫鍵締合會(huì)使酰胺II帶吸收峰向波數(shù)降低的方向偏移[27],這說明PSC中相鄰α鏈之間存在更多的氫鍵。酰胺III峰通常比較微弱,其與N-H彎曲,C-N拉伸和來自酰胺鍵的N-H彎曲振動(dòng)有關(guān)[28]。本實(shí)驗(yàn)中,魚皮PSC和ASC的酰胺III帶吸收峰都出現(xiàn)在1238.0 cm-1處。

以上結(jié)果表明,本實(shí)驗(yàn)酶法提取的金鯧魚皮膠原(PSC)與傳統(tǒng)酸法提取的膠原(ASC)均較好的保持了三股螺旋結(jié)構(gòu),且結(jié)構(gòu)基本相似。

2.5.3 DSC分析結(jié)果 熱穩(wěn)定性一直是I型膠原在工業(yè)應(yīng)用中最有價(jià)值的指標(biāo)之一,DSC為評(píng)價(jià)膠原蛋白熱穩(wěn)定性提供了可靠的信息,結(jié)果如圖8所示。

圖8 金鯧魚魚皮PSC和ASC的熱變性曲線Fig.8 Thermal denaturation curves of PSCand ASC from scales and skin of Golden pompano

金鯧魚魚皮PSC和ASC的變性溫度分別為30.44 ℃和31.12 ℃,熱焓值分別為0.72和0.91 J/g,說明金鯧魚魚皮PSC熱穩(wěn)定性稍低于ASC,這可能與胃蛋白酶作用于PSC端肽有關(guān)[29]。金鯧魚魚皮PSC和ASC變性溫度高于大鯢皮PSC(26.5 ℃)和ASC(23.5 ℃)、鯉魚魚皮PSC(28.1 ℃)[7,30],低于哺乳動(dòng)物豬皮PSC(38.0 ℃)和牛皮ASC(43.8 ℃)[31-32]。較高的變性溫度說明金鯧魚魚皮PSC的主要螺旋結(jié)構(gòu)保持完整,也為其工業(yè)利用提供了有力依據(jù)。

3 結(jié)論

采用響應(yīng)面法優(yōu)化金鯧魚魚皮酶溶性膠原蛋白的提取工藝,最優(yōu)提取條件為加酶量1.5%、液料比23 mL/g、提取時(shí)間27.5 h。按照上述條件驗(yàn)證,實(shí)驗(yàn)結(jié)果(64.68%)和響應(yīng)面理論值(65.17%)基本一致,說明本實(shí)驗(yàn)方案合理可靠。同時(shí),通過SDS-PAGE電泳和紅外光譜分析實(shí)驗(yàn),金鯧魚魚皮PSC初步鑒定為Ⅰ型膠原,較好的保持了其三股螺旋結(jié)構(gòu),且與傳統(tǒng)酸法提取的ASC有相似的電泳性質(zhì)和紅外峰型。

[1]Zhang M,Liu W,Li G. Isolation and characterisation of collagens from the skin of largefin longbarbel catfish(Mystus macropterus)[J]. Food Chemistry,2009,115(3):826-831.

[2]Mohammadi R,Mohammadifar M A,Mortazavian A M,et al. Extraction optimization of pepsin-soluble collagen from eggshell membrane by response surface methodology(RSM)[J]. Food Chemistry,2016,190(1):86-93.

[3]Singh P,Benjakul S,Maqsood S,et al. Isolation and characterisation of collagen extracted from the skin of striped catfish(Pangasianodon hypophthalmus)[J]. Food Chemistry,2011,124(1):97-105.

[4]Liu D,Liang L,Regenstein J M,et al. Extraction and characterisation of pepsin-solubilised collagen from fins,scales,skins,bones and swim bladders of bighead carp(Hypophthalmichthys nobilis)[J]. Food Chemistry,2012,133(4):1441-1448.

[5]王珮,蘇秀榕,張永飛,等.鮟鱇魚皮膠原蛋白酶提取最優(yōu)工藝研究與結(jié)構(gòu)表征[J].食品科學(xué),2013,34(7):217-222.

[6]劉賢敏,劉晉,劉康,等. 2010年華南地區(qū)金鯧魚養(yǎng)殖報(bào)告[J].當(dāng)代水產(chǎn),2011(2):27-28.

[7]顧賽麒,李莉,王錫昌,等.人工養(yǎng)殖大鯢皮膠原蛋白的性質(zhì)研究[J].食品科學(xué),2014,35(9):74-79.

[8]Chen S J,Chen H,Xie Q N,et al. Rapid isolation of high purity pepsin-soluble type I collagen from scales of red drum fish(Sciaenops ocellatus)[J]. Food Hydrocolloid,2016,52(4):68-77.

[9]馬儷,王曉丹,程賀,等.響應(yīng)面法優(yōu)化酶法提取鱈魚皮中膠原蛋白條件[J].中國(guó)釀造,2010,29(9):83-85.

[10]嚴(yán)子軍,紀(jì)潔清,劉永.響應(yīng)面優(yōu)化酶溶性羅非魚鱗膠原蛋白的提取工藝[J].廣東農(nóng)業(yè)科學(xué),2013,40(18):86-88.

[11]GB 5009.3-2010食品中水分的測(cè)定[S].北京:中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社,2010.

[12]GB/T 5009.5-2010食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定[S].北京:中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社,2010.

[13]GB 5009.4-2010食品中灰分的測(cè)定[S].北京:中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社,2010.

[14]GB/T 5009.6-2003食品中脂肪的測(cè)定[S].北京:中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社,2003.

[15]Nagai T,Araki Y,Suzuki N. Collagen of the skin of ocellate puffer fish(Takifugu rubripes)[J]. Food Chemistry,2002,78(2):173-177.

[16]Duan R,Zhang J J,Du X Q,et al. Properties of collagen from skin,scale and bone of carp(Cyprinus carpio)[J]. Food Chemistry,2009,112(3):702-706.

[17]Feng W,Zhao T,Zhou Y,et al. Optimization of enzyme-assisted extraction and characterization of collagen from Chinese sturgeon(Acipenser sturio Linnaeus)skin[J]. Pharmacognosy Magazine,2013,9(1):32-37.

[18]任國(guó)艷,詹永獻(xiàn),郭金英,等.響應(yīng)面優(yōu)化草魚魚鰾酶溶膠原蛋白的提取工藝[J].食品科學(xué),2012(22):154-157.

[19]Laemmli U K. Cleavage of Structural Proteins during the Assembly of the Head of Bacteriophage T4[J]. Nature,1970,227(5259):680-685.

[20]楊玲,趙燕,魯亮,等.鱘魚魚皮膠原蛋白的提取及其理化性能分析[J].食品科學(xué),2013,34(23):41-46.

[21]程漢良,蔣飛,彭永興,等. 野生與養(yǎng)殖草魚肌肉營(yíng)養(yǎng)成分比較分析[J].食品科學(xué),2013,34(13):266-270.

[22]劉世祿,王波,張錫烈,等.美國(guó)紅魚的營(yíng)養(yǎng)成分分析與評(píng)價(jià)[J].漁業(yè)科學(xué)進(jìn)展,2002,23(2):25-32.

[23]Nalinanon S,Benjakul S,Kishimura H. Collagens from the skin of arabesque greenling(Pleurogrammus azonus)solubilized with the aid of acetic acid and pepsin from albacore tuna(Thunnus alalunga)stomach[J]. Journal of the Science of Food and Agriculture,2010,90(9):1492-1500.

[24]Yan M,Li B,Zhao X,et al. Characterization of acid-soluble collagen from the skin of walleye pollock(Theragra chalcogramma)[J]. Food Chemistry,2008,107(4):1581-1586.

[25]Doyle B B,Bendit E G,Blout E R. Infrared spectroscopy of collagen and collagen-like polypeptides[J]. Biopolymers,1975,14(5):937-957.

[26]Muyonga J H,Cgb C,Duodu K G. Fourier transform infrared(FTIR)spectroscopic study of acid soluble collagen and gelatin from skins and bones of young and adult Nile perch(Lates niloticus)[J]. Food Chemistry,2004,86(3):325-332.

[27]Jackson M,Choo L P I,Watson P H,et al. Beware of connective tissue proteins:Assignment and implications of collagen absorptions in infrared spectra of human tissues[J]. Biochimica Et Biophysica Acta,1995,1270(1):1-6.

[28]Yousefi M,Ariffin F,Huda N. An alternative source of type I collagen based on by-product with higher thermal stability[J]. Food Hydrocolloid,2017,63(3):72-82.

[29]Chuaychan S,Benjakul S,Kishimura H. Characteristics of acid-and pepsin-soluble collagens from scale of seabass(Lates calcarifer)[J]. LWT-Food Science and Technology,2015,63(1):71-76.

[30]張俊杰,段蕊,劉佳梅,等.鯉魚魚皮和魚骨酶溶性膠原蛋白性質(zhì)異同的分析[J].食品科學(xué),2008,29(12):128-131.

[31]沈菊泉,湯俊,沈亞領(lǐng),等.酸法制備牛皮膠原蛋白及其結(jié)構(gòu)性質(zhì)研究[J].食品工業(yè),2009(4):43-46.

[32]張玲,芮漢明,張立彥.酶法提取豬皮膠原及產(chǎn)物性質(zhì)分析[J].食品科學(xué),2013,34(19):123-127.

Optimizationofextractionprocessandbasicpropertiesforpepsin-solublecollagenfromGoldenpompanoskin

LIAOWei,XIAGuang-hua,WANGJia-mei,YANGJin-kun,LIYong-cheng,SHENXuan-ri*

(College of Food Science and Technology,Hainan University,Haikou 570228,China)

To improve the utilization rate of fish skin in processing by-product ofGoldenpompano,this paper used the response surface Box-Behnken method to optimize the extraction process of pepsin-soluble collagen(PSC)from the skin ofGoldenpompano. Based on the previous single factor experiment,the model was established by three factors(enzyme concentration,liquid-to-solid ratio and extraction time). In addition,the basic properties of PSC were characterized and compared with acid-soluble collagen(ASC)by Sodium Dodecyl Sulfate Poly Acrylamide Gel Electrophoresis(SDS-PAGE),Attenuated Total Reflectance Fourier Transform Infrared spectroscopy(ATR-FTIR)and Differential Scanning Calorimeter(DSC). The results showed that the optimum extraction conditions were 1.5% enzyme concentration,23∶1 mL/g liquid-to-solid ratio,and 27.5 h extraction time. Under this condition,the actual yield of collagen ofGoldenpompanoskin was 64.68%,which was close to the predicted value(65.17%). Moreover,the PSC obtained in this experiment had higher denaturation temperature(30.44 ℃)and preliminarily identified as type I collagen,which was similar to the electrophoretic and infrared peaks of ASC. The technical reference for the extraction of PSC fromGoldenpompanoskin was given in this research.

Goldenpompanoskin;collagen;response surface methodology;extraction process

TS254.9

A

1002-0306(2017)19-0142-06

10.13386/j.issn1002-0306.2017.19.027

2017-03-29

廖偉(1993-)，男，碩士研究生，研究方向：農(nóng)產(chǎn)品加工及貯藏，E-mail:wei_food@163.com。

*通訊作者:申鉉日(1968-)，男，博士，教授，研究方向：食品科學(xué)和水產(chǎn)品精深加工等領(lǐng)域，E-mail:shenxuanri2009@163.com。

海南省自然基金(317038)；海南省重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃(ZDYF2017104)；海南大學(xué)科研啟動(dòng)基金資助項(xiàng)目(kyqd1662)。