姚嘉旻 盧利玲

【摘要】選取現(xiàn)有保藏菌株作為實驗出發(fā)菌株，利用兩步濃縮法篩選α，ω?氧化性強、β?氧化性弱的酵母菌優(yōu)勢菌株。經(jīng)發(fā)酵罐驗證，發(fā)酵155h產(chǎn)酸約180克/升，達到了篩選產(chǎn)酸水平高、烷烴轉(zhuǎn)化率高的優(yōu)勢菌株的目的，增加二元酸項目的競爭力及應變能力。

【關鍵詞】十二碳二元酸；復合誘變；顯色篩選

本課題針對長鏈二元酸工藝的研究進展及其現(xiàn)狀，通過系列誘變篩選來挑選出烷烴轉(zhuǎn)化率高、發(fā)酵周期短、產(chǎn)酸性能更強的優(yōu)勢菌株，為發(fā)酵法生產(chǎn)長鏈二元酸高效菌株的篩選提供依據(jù)。

一、材料與方法

（一）材料

1.出發(fā)菌種：經(jīng)初步產(chǎn)酸評價后，初步確定6株保藏菌株作為誘變育種出發(fā)菌株。

2.試劑

糖蜜，尿素，酵母膏，均為工業(yè)級。

3.培養(yǎng)基

（1）篩選培養(yǎng)基：在種子培養(yǎng)基成分。（2）基礎上有所改變，如下：蔗糖碳源培養(yǎng)基、烷烴碳源培養(yǎng)基；顯色培養(yǎng)基。（3）發(fā)酵培養(yǎng)基：成分與種子培養(yǎng)基一致，烷烴量根據(jù)實際要求足量添加。

（二）方法

1.分析方法

（1）產(chǎn)酸量。搖瓶發(fā)酵、破乳抽提，用標準氫氧化鈉溶液標定二元酸產(chǎn)酸含量。（2）二元酸成分同。（3）提純長鏈二元酸產(chǎn)品，干燥后經(jīng)氣相色譜分析測定二元酸成分。

2.初篩程序

出發(fā)菌株→篩選培養(yǎng)基（初篩A）→產(chǎn)酸顯色培養(yǎng)基（初篩B）→初篩菌株→初篩產(chǎn)酸驗證。

3.復篩程序

初篩菌株→物理化學誘變→產(chǎn)酸顯色培養(yǎng)基（復篩A）→秋水仙堿產(chǎn)酸培養(yǎng)基→鉻酸鉀產(chǎn)酸培養(yǎng)基（復篩濃縮B）→復篩優(yōu)勢菌株。

二、結(jié)果與討論

（一）復篩實驗結(jié)果

1.紫外誘變

圖1分析，熱帶假絲酵母菌的紫外誘變致死率與照射時間呈正相關性；同時，紫外誘變的正突變率隨照射時間的延長呈先增長而后降低的變化趨勢，選擇紫外誘變照射時間為150秒較適宜，其對應致死率及正突變率分別為88%、40%.

2.超聲波誘變

誘變時長為12min時，對應致死率及正突變率分別為94%、45%，而誘變時長為15min時，對應致死率及正突變率分別為99%、48%，選擇誘變時間為12min更為適宜。再經(jīng)兩步濃縮法獲得誘變正突變菌株56株。

（三）產(chǎn)酸驗證

1.搖瓶產(chǎn)酸驗證

出發(fā)菌株QJ-EY09初始產(chǎn)酸水平僅為75g/L，經(jīng)復合誘變篩選流程，突變菌株最高產(chǎn)酸水平約185g/L，產(chǎn)酸水平是出發(fā)菌株的2.4倍。

2.發(fā)酵罐產(chǎn)酸驗證

選擇搖瓶產(chǎn)酸對應烷烴轉(zhuǎn)化率較高的誘變菌株，經(jīng)發(fā)酵罐放大驗證：發(fā)酵周期為140h時，發(fā)酵產(chǎn)酸水平為185g/L，達到既定篩選優(yōu)勢菌株效果。

三、討論

選取生產(chǎn)保藏菌株QJ-EY09作為誘變育種出發(fā)菌株，合理制定紫外-超聲波誘變方法，復篩出正突變菌株；利用兩步濃縮法及顯色平板篩分，獲得α，ω-氧化增強、β-氧化減弱的誘變突變株56株；經(jīng)發(fā)酵罐驗證，發(fā)酵140h產(chǎn)酸185克/升，達到了篩選產(chǎn)酸水平高、烷烴轉(zhuǎn)化率高的優(yōu)勢菌株的目的。

參考文獻

[1]焦鵬，華玉濤，李書良.熱帶假絲酵母轉(zhuǎn)化烷烴過程中P450酶活的研究[J].微生物學報，2001，41（01）：117～120.

[2]歐陽晶，榮東，郝秀珍.熱帶假絲酵母?；o酶A氧化酶的純化及性質(zhì)研究[J].微生物學報，2002，42（06）：713～719.

[3]趙興青.發(fā)酵法生產(chǎn)十三碳二元酸的試驗研究[D].沈陽：東北大學，2003.

[4]劉樹臣，李淑蘭，金平.十二碳二元酸發(fā)酵研究[J].微生物學報，2002，42（06）：748～780.

作者簡介：姚嘉旻（1981—），男，江蘇淮安人，研究方向：石油產(chǎn)品相關的發(fā)酵工程及分離工程。