薛 毅 ，張 王月，呂 燕 ，吳銀良 *

（1.中國動物疫病預(yù)防控制中心，北京100125；2.寧波市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，浙江寧波 315040）

同位素稀釋液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法同時測定飼料中雌激素類藥物

薛 毅1，張 王月1，呂 燕2，吳銀良2*

（1.中國動物疫病預(yù)防控制中心，北京100125；2.寧波市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，浙江寧波 315040）

試驗(yàn)旨在建立飼料中8種雌激素類藥物的同位素稀釋液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜分析方法。樣品用乙腈提取，提取液經(jīng)氮吹后用乙酸乙酯復(fù)溶，再利用碳酸鈉溶液進(jìn)行液液萃取凈化，凈化后吹干乙酸乙酯層，用40%乙腈溶液溶解殘?jiān)?，?jīng)離心過濾膜后進(jìn)行液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜分析。采用Acquity HSS T3色譜柱分離，用水-乙腈作為流動相進(jìn)行梯度洗脫，電噴霧負(fù)離子模式電離，多反應(yīng)監(jiān)測模式檢測，同位素稀釋內(nèi)標(biāo)法定量。結(jié)果表明：8種雌激素類藥物在1.0～200 μg/L范圍內(nèi)線性良好，相關(guān)系數(shù)均在0.9910～0.9992；在1.0～50.0 μg/kg添加水平范圍內(nèi)，平均添加回收率在97.5%～106%。本方法中8種雌激素類藥物在飼料中的檢測限為0.15～0.30 μg/kg，定量限為0.50～1.0 μg/kg。該方法能滿足飼料中8種雌激素類藥物含量分析的要求。

雌激素類藥物；飼料；同位素稀釋；液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法

雌激素是一類有廣泛生物活性的類固醇化合物，在畜牧業(yè)生產(chǎn)中主要被用來促進(jìn)母牛同期排卵以提高發(fā)情動物的數(shù)量和受胎率。然而，雌激素類藥物在畜牧業(yè)生產(chǎn)上濫用和違規(guī)使用會引起動物性食品中雌激素殘留，從而導(dǎo)致一系列的人體健康問題，如兒童性早熟、癌癥、男性生殖障礙等[1-2]。因此，我國已頒布相關(guān)文件，明確禁止己烯雌酚、己烷雌酚等激素類藥物在動物生產(chǎn)中使用。

對于雌激素類藥物殘留確證分析方法，目前主要有氣相色譜-質(zhì)譜法[3-7]和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[8-17]，分析對象以生物樣品、動物源性的食品居多[4-17]，飼料樣品相對較少[3,8]。由于雌激素類藥物揮發(fā)性低，用氣相色譜-質(zhì)譜法分析時需要衍生化，導(dǎo)致前處理步驟多操作繁瑣，同時定性時相對液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法（LC-MS/MS）易干擾，因此近年來，LC-MS/MS分析技術(shù)逐漸成為雌激素類藥物檢測技術(shù)研究的熱點(diǎn)。本研究通過前處理?xiàng)l件的優(yōu)化，建立飼料中8種雌激素類藥物的準(zhǔn)確、靈敏和快速的LC-MS/MS分析方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器 超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀（美國Waters公司）；Sigma離心機(jī)（北京博勵行儀器有限公司）；Milli-Q超純水儀（美國Millipore公司）。

1.1.2 標(biāo)準(zhǔn)品 雌三醇（96.5%）、雌酮（98.0%）、炔雌醇（98.0%）、17α-雌二醇（98.0%）、17β-雌二醇（96.0%）、已烯雌酚（98.0%）、已烷雌酚（98.0%）、已二烯雌酚（97.0%）、雌三醇-D3（98.1%）、雌酮-D2（95.0%）、炔雌醇-D4（97.0%）、已烯雌酚-D8（98.9%）、已烷雌酚-D4（98.0%）和已二烯雌酚-D6（98.6%）購于加拿大Toronto Research Chemicals（TRC）公司。17α-雌二醇-D2（98.0%）和17β-雌二醇-D2（98.0%）購于加拿大CDN公司。

1.1.3 標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液配制 分別準(zhǔn)確稱取雌三醇、雌酮、炔雌醇、17α-雌二醇、17β-雌二醇、已烯雌酚、已烷雌酚、已二烯雌酚、雌三醇-D3、雌酮 -D2、炔雌醇 -D4、17α-雌二醇 -D2、17β-雌二醇-D2、已烯雌酚-D8、已烷雌酚-D4和已二烯雌酚-D6適量于100 mL棕色容量瓶中，用乙腈定容至刻度，配制各標(biāo)準(zhǔn)品的100 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備液-18℃保存，有效期6個月。

1.1.4 主要試劑 乙腈（色譜純）購于美國Fisher公司；乙酸乙酯（分析純）和碳酸鈉（分析純）購于上?；瘜W(xué)試劑公司；超純水。

1.2 方法

1.2.1 液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜條件 色譜柱：UPLC Acquity HSS T3 柱子（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）；流速：0.40 mL/min；進(jìn)樣量：10 μL；柱溫：35℃；流動相：A相 ：水，B：乙腈；洗脫采用梯度洗脫，程序詳見表1；ESI負(fù)離子模式；毛細(xì)管電壓：2.5 kV；源溫：150℃；去溶劑氣溫度：500℃；脫溶劑流速：1 000 L/h；主要監(jiān)測離子對詳見表2。

表1 梯度條件

1.2.2 樣品前處理方法 稱?。?±0.05）g樣品于50 mL聚四氟乙烯離心管中，準(zhǔn)確加入50 μL 500 μg/L的同位素標(biāo)記混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，混合15 s后加入25 mL乙腈，在振蕩器上振蕩提取30 min，以4 000 r/min離心2 min，收集乙腈提取液于50 mL離心管中，氮吹至近干后加入10 mL乙酸乙酯溶解殘?jiān)ｌo置1 min后移取上述乙酸乙酯溶解液至已加有2 mL 5%碳酸鈉溶液的50 mL塑料離心管中，渦旋混合1 min，以5 000 r/min離心3 min，棄去下層水相，再加入2 mL 5%碳酸鈉溶液，重復(fù)渦旋離心步驟后將乙酸乙酯層移入另一50 mL尖底塑料離心管中，在40℃水浴中用氮?dú)獯蹈桑尤?.0 mL 40%的乙腈溶液，渦旋混合0.5 min，過0.2 μm濾膜后待上機(jī)。

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線制備 吸取適量的各雌激素標(biāo)準(zhǔn)溶液用水/乙腈（20:80，V/V）混合溶液進(jìn)行稀釋，配制含內(nèi)標(biāo)濃度均為12.5 μg/L的1.0、2.0、5.0、20、50、100 μg/L的系列雌激素標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，進(jìn)行LC-MS/MS分析，每一濃度進(jìn)樣3次，以目標(biāo)物的濃度為橫坐標(biāo)，目標(biāo)物的定量離子對峰面積與內(nèi)標(biāo)離子對峰面積比值為縱坐標(biāo)，繪制各雌激素標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.4 添加回收率試驗(yàn) 分別在各個空白樣品中添加100 μL的標(biāo)準(zhǔn)溶液（濃度分別為0.05 μg/L、0.25 mg/L、2.5 mg/L）后樣品渦動0.5 min，混勻，靜置待揮發(fā)至干后，按照樣品前處理的1.2.2方法進(jìn)行處理后進(jìn)LC-MS/MS分析。添加的濃度為1.0、5.0、50 μg/kg。

表2 8種雌激素類藥物及內(nèi)標(biāo)物質(zhì)譜條件

2 結(jié)果和分析

2.1 儀器條件的優(yōu)化 對于雌激素類藥物的LCMS/MS分析，由于該類藥物分子結(jié)構(gòu)中含有酚羥基，通常采用ESI-作為電離模式[8-14]。因此，本研究利用雌激素標(biāo)準(zhǔn)溶液在全掃描負(fù)離子電離模式下，優(yōu)化毛細(xì)管電壓、錐孔電壓、裂解溫度、脫溶劑氣流速等參數(shù)，得到各雌激素類藥物最強(qiáng)的分子離子峰。然后在優(yōu)化的質(zhì)譜條件下，對選定的母離子進(jìn)行子離子掃描，優(yōu)化碰撞能量等參數(shù)，最終經(jīng)實(shí)際空白樣品測試，選擇表1中既無干擾、靈敏度又高的子離子作為相應(yīng)藥物的定性離子和定量離子。由于17α-雌二醇和17β-雌二醇是一對同分異構(gòu)體，本研究利用Acquity UPLC HSS T3和BEH C18色譜柱考察流動相為乙腈-水時，在同樣梯度條件下的分離情況，結(jié)果當(dāng)采用Acquity UPLC HSS T3柱時分離效果相對較好。

2.2 前處理?xiàng)l件的選擇和優(yōu)化 雌激素屬于疏水性有機(jī)化合物，易溶于大多數(shù)有機(jī)溶劑，目前常用的提取溶劑主要有乙酸乙酯[11]、乙腈[9]和叔丁基甲醚[8]?？紤]到飼料通常蛋白含量比較高且乙腈具有去蛋白作用，本試驗(yàn)采用不同體積乙腈（15、20、25、30、40 mL）按照1.2.2中的方法對豬配合飼料中8種雌激素類藥物進(jìn)行提取效果研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)8種雌激素類藥物的提取回收率從15 mL的72.1%～86.5%增長到25 mL的90.6%～98.1%，而后趨于穩(wěn)定，因此本試驗(yàn)選擇乙腈體積為25 mL。

對于飼料及動物性食品中雌激素類藥物分析前處理凈化方法主要有液液萃取法、固相萃取法和QuEChERS方法。其中液液萃取法主要利用雌激素類藥物結(jié)構(gòu)中含有酚羥基，可在弱堿性條件下用有機(jī)溶劑萃取待測物，從而達(dá)到凈化的目的；因此本試驗(yàn)在乙腈提取液吹干用乙酸乙酯溶解后采用碳酸鈉溶液對其進(jìn)行凈化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)飼料樣品中8種雌激素類藥物出峰時間無雜質(zhì)峰干擾，且凈化步驟所需時間只有10 min左右，比常規(guī)固相萃取方法（通常需要1 h左右）要節(jié)約時間80%以上。

2.3 線性試驗(yàn)和基質(zhì)效應(yīng) 用流動相配制1.2.3中的濃度系列標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行LC-MS/MS分析，以標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)，定量離子對峰面積和內(nèi)標(biāo)離子對峰面積的比值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。從表3中可知，8種雌激素類藥物在1.0～200 μg/L范圍內(nèi)線性相關(guān)系數(shù)均大于0.990，線性關(guān)系良好。同時利用空白樣品配制基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行進(jìn)樣分析，分別對系列標(biāo)準(zhǔn)溶液和基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液以標(biāo)樣濃度為橫坐標(biāo)，定量離子對峰面積為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸分析，計(jì)算基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線和溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率比值，得到基質(zhì)效應(yīng)的強(qiáng)弱。在本研究中，豬配合飼料、雞配合飼料對8種雌激素類藥物均產(chǎn)生了不同程度的基質(zhì)抑制效應(yīng)（比值介于0.23～0.64）。

表3 8種雌激素類藥物標(biāo)準(zhǔn)曲線及相關(guān)系數(shù)

2.4 方法的靈敏度、回收率和精密度 對豬和雞的空白飼料樣品中添加適量標(biāo)準(zhǔn)溶液各進(jìn)行3次添加回收試驗(yàn)，每次每個濃度點(diǎn)進(jìn)行5個樣品的重復(fù)。從表4中可見，2種配合飼料中8種雌激素在1～50 μg/kg添加濃度范圍內(nèi)的平均添加回收率為97.5%～106%，批間RSD在4.3%～7.9%。同時以3倍信噪比（S/N）對應(yīng)的樣品中雌激素濃度作為檢出限（LOD），10倍信噪比（S/N）對應(yīng)的樣品中雌激素濃度作為定量限（LOQ），得到各雌激素的檢出限和定量限。由表4可見，本方法的檢測限和定量限范圍分別為0.15～0.30 μg/kg和0.50～1.0 μg/kg。豬配合飼料空白樣品和添加樣品詳見圖1，其中b6中17α-雌二醇出峰時間在后，17β-雌二醇出峰時間在前。

2.5 方法應(yīng)用 利用該方法測定了20個豬配合飼料和15個雞配合飼料樣品，8種雌激素類藥物均未檢出。

3 討 論

復(fù)雜的前處理步驟是飼料和動物性食品中建立高靈敏度、高分析通量分析方法的關(guān)鍵制約因子。林小莉等[3]建立的飼料中雌激素類藥物分析方法前處理中包括了有機(jī)溶劑提取-氫氧化鈉溶液液液萃取凈化-固相萃取凈化和衍生化，整個前處理不僅繁瑣耗時，單個樣品前處理時間在3 h以上；而且會導(dǎo)致方法重復(fù)性較差，方法的批間RSD為6.7%～22.7%。本研究所建立的前處理步驟相對非常簡單，僅包括乙腈提取-碳酸鈉溶液液液萃取凈化2步，其中液液萃取凈化步驟所需時間只有10 min左右，不僅遠(yuǎn)快于林小莉等建[3]立的凈化方法，也比目前很多LC-MS/MS方法中建立的常規(guī)固相萃取方法[9,13-14,16-17]（通常需要1 h左右）要節(jié)約80%以上的時間，基本和目前QuEChERS凈化步驟[4,15]所需時間相當(dāng)。

表4 8種雌激素類藥物在豬、雞配合飼料中的靈敏度、回收率和精密度

圖 1 豬配合飼料空白樣品(a1-7)和添加樣品(b1-7, 1.0μg/kg)MRM色譜圖

液質(zhì)聯(lián)用中采用同位素內(nèi)標(biāo)物定量不僅能最大限度減少樣品損失造成的分析誤差，而且能夠克服基質(zhì)效應(yīng)造成的定量誤差。本方法對于8種雌激類藥物均采用一一對應(yīng)的8種同位素內(nèi)標(biāo)物進(jìn)行定量，不僅明顯好于未采用內(nèi)標(biāo)法定量的LCMS/MS方法，如張艷等[13]建立的液質(zhì)方法的平均回收率為75.3 %～120.0%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為3.4%～19.6%；而且也明顯好于雖采用內(nèi)標(biāo)法定量，但僅用1個內(nèi)標(biāo)物來對多種雌激素定量液質(zhì)聯(lián)用分析方法，如王和興等[18]采用17-β-雌二醇-D3對9種雌激素類藥物定量建立的LC-QTOF-MS方法的平均回收率為61%～137%，RSD 為1.0%～22.6%（其中17-β-雌二醇的平均回收率為102%～110%，RSD為1.2%～10%）。

4 小 結(jié)

通過優(yōu)化前處理和儀器條件，本研究建立了準(zhǔn)確度好、靈敏度高和分析速度快的飼料中8種雌激素類藥物L(fēng)C-MS/MS同步分析方法；同時通過樣品添加和實(shí)際樣品分析，該分析方法適用于飼料中雌激素類藥物的定性定量分析。

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Simultaneous Determination of Estrogen Drugs in Feeds by Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry with Isotope Dilution

XUE Yi1, ZHANG Yue1, LV Yan2, WU Yin-Liang2*

(1. The Center for Animal Disease Control and Prevention, Beijing 100125, China;2. The Ningbo Academy of Agricultural Sciences, Zhejiang Ningbo 315040, China)

A method was developed for determining eight estrogen drugs in feeds using liquid chromatography tandem mass spectrometry with isotope dilution. Samples were extracted with acetonitrile and centrifuged. The extract was dried under nitrogen and the residue was redissolved with ethyl acetate. Then, the samples were cleaned up by sodium carbonate solution with a liquid-liquid extraction method. After clean-up, the samples were analyzed by LC-MS/MS on an Acquity HSS T3 column with a mixture of water and acetonitrile as mobile phase under gradient elution conditions. The analytes were determined by negative electrospray ionization with multiple reaction monitoring (MRM). Internal standard method was used to quantify the analytes. There is a good linear correlation between the peak areas and concentration of eight estrogen drugs in the range of 1.0 μg/L to 200 μg/L. The eight estrogen drugs were measured in fortified feeds at 1.0～50 μg/kg levels. Average recoveries were in the range of 97.5%～106%. The limit of detection (LOD) and limit of quantification (LOQ) was 0.15～0.30 μg/kg and 0.50～1.0 μg/kg, respectively. The method is demonstrated to be suitable for the determination of the eight estrogen drugs in feeds.

Estrogen drugs; Feed; Isotope dilution; Liquid chromatography tandem mass spectrometry

O657.63

A

10.19556/j.0258-7033.2017-10-101

2017-07-10；

2017-08-18

寧波市農(nóng)業(yè)科技攻關(guān)項(xiàng)目（2013C11003、2015C50067)作者簡介：薛毅（1972-），男，碩士，獸醫(yī)師，研究方向?yàn)楂F藥安全性評估，E-mail：xingmuyikang@163.com

* 通訊作者：吳銀良（1975-），男，博士，教授級高工，研究方向?yàn)檗r(nóng)產(chǎn)品中農(nóng)獸藥殘留分析研究，E-mail：wupaddyfield@sina.com