唐雪梅，彭小寧

（湖南師范大學(xué)醫(yī)學(xué)院，長沙 410013）

MiR-148a-3p靶基因的預(yù)測與驗證

唐雪梅，彭小寧

（湖南師范大學(xué)醫(yī)學(xué)院，長沙 410013）

目的：預(yù)測和驗證miR-148a-3p的靶基因。方法：利用生物信息學(xué)方法預(yù)測miR-148a-3p的靶基因；在神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87/U251中建立miR-148a過表達(dá)及抑制表達(dá)穩(wěn)定細(xì)胞系。利用qPCR實(shí)驗驗證miR-148a-3p與靶基因的靶向關(guān)系；利用Western Blot實(shí)驗檢測靶蛋白表達(dá)水平。結(jié)果：生物信息學(xué)方法預(yù)測結(jié)果顯示dynein light chain LC8-type 2（DYNLL2）為miR-148a-3p靶基因之一；qPCR實(shí)驗結(jié)果顯示DYNLL2在神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞HA1800與神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87/U251中的表達(dá)有差異，在神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞miR-148a過表達(dá)及抑制表達(dá)的細(xì)胞中表達(dá)有差異；Western Blot實(shí)驗結(jié)果顯示DYNLL2的蛋白表達(dá)水平在神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞HA1800與膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87/U251中有差異。結(jié)論：miR-148a-3p與DYNLL2有確切的靶向關(guān)系，DYNLL2在神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞與膠質(zhì)瘤細(xì)胞中均有表達(dá)，與正常膠質(zhì)細(xì)胞相比，DYNLL2在神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)，包括基因水平和蛋白水平，miR-148a-3p能夠負(fù)向調(diào)控DYNLL2的表達(dá)。

微小RNA；miR-148a-3p；DYNLL2

微小RNA（microRNA，miRNA）是一類長度為18～24個核苷酸的內(nèi)源性非編碼小分子單鏈RNA。通過完全或不完全互補(bǔ)結(jié)合靶mRNA3’UTR，在轉(zhuǎn)錄后水平上對靶基因表達(dá)水平進(jìn)行調(diào)控。有研究表明多種miRNAs參與調(diào)控神經(jīng)膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展，其中包括高表達(dá)的mir-148a［1］。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，在神經(jīng)膠質(zhì)母瘤組織及細(xì)胞中miR-148a-3p的表達(dá)水平明顯高于正常神經(jīng)膠質(zhì)組織及細(xì)胞，mir-148a在神經(jīng)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中作為負(fù)性風(fēng)險因子存在，高表達(dá)的mir-148a促進(jìn)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的惡性化進(jìn)程的演變，且與膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者生存率呈負(fù)向相關(guān)性。尋找mir-148a-3p的靶基因能夠深入揭示mir-148a-3p在神經(jīng)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤發(fā)病中的調(diào)控機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 人正常的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞HA1800，人腦膠質(zhì)細(xì)胞瘤細(xì)胞系U87、U251來源于廣州吉妮歐生物科技公司，DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、0.25%胰酶、DMSO來自美國HyCone公司，氯仿、異丙醇、無水乙醇、二甲苯、TRIzol試劑來自南京化學(xué)試劑有限公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒來自美國Thermo Fisher公司，實(shí)時PCR熒光檢測試劑盒來自南京諾唯贊生物公司，DYNLL2引物、GAPDH引物來自上海生工生物工程有限公司，鼠抗人DYNLL2單克隆抗體來自Abnov公司，鼠抗人GAPDH1單克隆抗體、HRP標(biāo)記羊抗鼠二抗均為南京諾唯贊生物公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 miR-148a-3p靶基因的預(yù)測 利用miRanda、TargetScan、miRBase三個專業(yè)數(shù)據(jù)庫對miR-148a-3p的靶基因進(jìn)行預(yù)測。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng) HA1800細(xì)胞培養(yǎng)條件：含10%胎牛血清的低糖DMEM培養(yǎng)基，環(huán)境溫度控制在37℃，二氧化碳濃度控制在5%，U87、U251細(xì)胞培養(yǎng)條件：含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基，環(huán)境溫度控制在37℃，二氧化碳濃度控制在5%。

1.2.3 實(shí)時熒光定量PCR實(shí)驗

1.2.3.1 細(xì)胞總RNA的提取 將生長狀態(tài)良好的細(xì)胞培養(yǎng)至鋪滿培養(yǎng)瓶底部時，用PBS洗滌2次，按每25cm2瓶底面積加入1mlTRIzol試劑，室溫保存10min后反復(fù)吹打培養(yǎng)瓶底部，讓細(xì)胞充分裂解。將細(xì)胞溶解液轉(zhuǎn)移至RNA-free1.5ml離心管中，按0.2ml/1mlTRIzol的比例加入氯仿，劇烈震蕩15s，充分混勻液體，室溫放置3～5min，在4℃、12000rpm環(huán)境下離心20min，去上層透明水相移至新RNA-free1.5ml離心管中，加入500μl異丙醇沉淀RNA，室溫靜置10min，在4℃、12000rpm環(huán)境下離心5min，棄去上層液體，室溫干燥3～5min，用適量RNA-free水溶解RNA。取1μlRNA在1%瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳，紫外燈下分析RNA有無發(fā)生降解。用分光光度計測定A260和A280的值，計算RNA濃度、A260/A280比值。

1.2.3.2 miRNA逆轉(zhuǎn)錄生成cDNA 取A260/A280比值≥1.8的RNA5μg，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)體系如下：得到cDNA，進(jìn)行PCR實(shí)驗。

組分 體積總RNA 5μg Bulge-loop miRNA RT 引物 1μl ddH2O to 12μl 12μl 65℃ 5min

組分 體積5×Reaction Buffer 4μl RNase Inhibitor 1μl反轉(zhuǎn)錄酶 1μl 10mM dNTP Mixture 2μl混勻，微離心 42℃ 60min 70℃ 5min

1.2.3.3 熒光定量PCR 將逆轉(zhuǎn)錄的cDNA進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)體系如下：

組分 體積c D N A 2 μ l D Y N L L 2/G A P D H正向引物 0.8 μ l D Y N L L 2/G A P D H通用引物 0.8 μ l 2×S Y B R G r e e n M i x 1 0 μ l d d H 2 O t o 2 0 μ l 2 0 μ l反應(yīng)程序：循環(huán) 步驟 溫度 時間1× 預(yù)變性 9 5℃ 5 m i n變性 9 5℃ 1 0 s 4 0× 退火/延伸 6 0℃ 3 0 s 9 5℃ 1 5 s 1× 溶解曲線 6 0℃ 6 0 s 9 5℃ 1 5 s

每個樣品設(shè)置3個平行反應(yīng)管，以GAPDH作為內(nèi)參，重復(fù)試驗3次。

在Bio-Rad CFX96Real-time PCR儀上完成PCR反應(yīng)，根據(jù)計算DYNLL2與內(nèi)參GAPDH的Cq值，計算DYNLL的△Cq值，再通過與對照組的DYNLL2的△Cq值相比較，計算出△△Cq值，求得DYNLL2在模板中的相對表達(dá)量。計算公式如下：

△△Cq=（Cqdynll2-CqGAPDH）神經(jīng)膠質(zhì)瘤-（Cqdynll2-CqGAPDH）神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞

1.2.4 Western Blot檢測DYNLL2的蛋白表達(dá)水平

1.2.4.1 蛋白樣品的制備 將實(shí)驗所需的人神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞系，神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系用PBS洗滌2次，棄去PBS后用0.25%的胰酶消化5min，使細(xì)胞從培養(yǎng)瓶底部脫落，將懸液轉(zhuǎn)移至1.5ml的EP管中，4℃、12000rpm離心5min，除去上清液體，再次用PBS洗滌2次，4℃、12000rpm離心5min，棄上清，加入適量的細(xì)胞裂解液（裂解液：PMSF=100：1），在-80℃與室溫環(huán)境中交替反復(fù)凍融3次，置于4℃、12000rpm離心15min，取上清并移至新的EP管中。

1.2.4.2 蛋白定量（BCA法蛋白定量） 用碧云天公司BCA蛋白定量試劑盒，根據(jù)說明書準(zhǔn)備樣品，取4.4ml蛋白標(biāo)準(zhǔn)配制液加入到120mgBSA中，配成濃度為25ug/μl的蛋白標(biāo)準(zhǔn)品。0.98ml稀釋液加 0.02ml25ug/μl蛋白標(biāo)準(zhǔn)品配成0.5ug/μl的蛋白標(biāo)準(zhǔn)品。按照A液：B液=50：1的比例配制BCA工作液，在96孔板中加入200μl/孔的BCA工作液，然后在前8個孔中分別加入濃度為 0.5mg/ml的標(biāo)準(zhǔn)品 20μl、16μl、12μl、8μl、4μl、2μl、1μl、0μl，不足 20μl的孔用不含 PMSF 的細(xì)胞裂解液補(bǔ)足，每個樣品設(shè)置三個重復(fù)對照。根據(jù)不同量的標(biāo)準(zhǔn)品的OD值來繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。剩余的96孔板中依次加入待測樣品5μl，不足20μl的孔用不含PMSF的細(xì)胞裂解液補(bǔ)足。將待測版放入37℃的恒溫箱孵育30min。用酶標(biāo)儀測定A562的吸光度。根據(jù)OD值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出標(biāo)準(zhǔn)方程，計算樣品蛋白濃度。

1.2.4.3 SDS-PAGE電泳 取1.5mm厚制膠玻璃板，安裝好玻璃板，配制濃縮膠與分離膠，浸泡于電泳液中，電泳液充滿齒孔。20μg取相應(yīng)體積的蛋白樣品，加入1/4體積的5×SDS Loading Buffer，97℃變性8min，微離心30s。在1.5mm、10%SDS聚丙烯酰胺凝膠齒孔中加入蛋白樣品和26616蛋白Marker，在200V，30mA條件下進(jìn)行電泳。

1.2.4.4 轉(zhuǎn)膜 將PVDF膜浸泡在濃度為100%的甲醇溶液中進(jìn)行活化，放入預(yù)冷的轉(zhuǎn)膜液中浸泡待用。在預(yù)冷的轉(zhuǎn)膜液中準(zhǔn)備轉(zhuǎn)膜夾，由負(fù)極到正極依次放置毛氈、濾紙、PAGE凝膠、PADF膜、濾紙、毛氈。轉(zhuǎn)膜夾放于半干電轉(zhuǎn)儀槽中在600V、200Ma，冰浴條件下轉(zhuǎn)膜。

1.2.4.5 封閉孵育抗體 轉(zhuǎn)膜成功后，用TBS-T漂洗PVDF膜2次，用5%脫脂奶粉封閉，室溫?fù)u床孵育1-2h。封閉后用TBS-T漂洗PVDF膜2次，DYNLL2（1：1000稀釋）、GAPDH（1：10000稀釋）一抗，4℃孵育過夜。隔日將膜在室溫條件下孵育30min，TBS-T洗膜3次，用標(biāo)有辣根過氧化物酶的G-M二抗（1：10000稀釋）室溫孵育1-1.5h。TBS-T洗膜3次。

1.2.4.6 顯影 ECL發(fā)光檢測，拍攝圖片，使用ImageJ軟件分析灰度值。

1.2.5 統(tǒng)計學(xué)方法 利用SPSS16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示實(shí)驗數(shù)據(jù)。兩樣本均數(shù)的比較采用t檢驗，多組樣本的比較采用Kruskal-Wallis Test分析；P＜0.05表示有統(tǒng)計學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 miR-148a-3p靶基因預(yù)測 利用三種靶基因預(yù)測網(wǎng)站對miR-148a-3p的靶基因進(jìn)行預(yù)測并篩選，篩選至少兩個網(wǎng)站同時預(yù)測出來，分值較高的靶基因最后圈定DYNLL2.通過TargetScan預(yù)測mir-148a與靶基因DYNLL2之間可能的結(jié)合位點(diǎn)見圖1

2.2 qPCR驗證結(jié)果 DYNLL2在正常神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中的表達(dá)明顯高于在神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的表達(dá)，見圖2差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。DYNLL2在神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系miR-148a過表達(dá)組中的表達(dá)量明顯低于對照組中的表達(dá)，見圖3差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。DYNLL2在神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系miR-148a抑制表達(dá)組中的表達(dá)量明顯高于對照組中的表達(dá)，見圖4差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

圖1 TargetScan預(yù)測mir-148a與靶基因DYNLL2之間可能的結(jié)合位點(diǎn)

圖2 DYNLL2在神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞HA1800與神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U87，U251中的表達(dá)

圖3 DYNLL2在神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系miR-148a過表達(dá)組與對照組中的表達(dá)（P＜0.05）

圖4 DYNLL2在神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系miR-148a抑制表達(dá)組與對照組中的表達(dá)（P＜0.05）

2.3 Western Blot檢測DYNLL2的蛋白表達(dá)水平結(jié)果

DYNLL2的蛋白水平在正常角質(zhì)細(xì)胞中的表達(dá)量高于膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中的表達(dá)。各膠質(zhì)瘤細(xì)胞組與HA1800正常對照組之間的表達(dá)差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見圖5.

圖5 DYNLL2的蛋白在神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞與膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中的表達(dá)（P＜0.05）

3 討論

MiRNA通過堿基互補(bǔ)配對的方式識別靶基因的3’UTR區(qū)，并根據(jù)互補(bǔ)程度的不同指導(dǎo)沉默復(fù)合體降解靶mRNA或者阻遏靶mRNA的翻譯，miRNA與其靶基因之間形成的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)參與調(diào)控miRNA生物學(xué)功能，近年來研究miRNA與其靶基因之間的相互關(guān)系已經(jīng)成為一個熱點(diǎn)，也是疾病發(fā)生機(jī)制研究的關(guān)鍵因素。miRNA可以調(diào)控多個靶基因，一個靶基因也可以受多個miRNA的調(diào)控［2］。研究一個基因是否是某個miRNA的靶基因通常會選用生物信息學(xué)方法，對該靶基因進(jìn)行預(yù)測分析，利用生物信息學(xué)找尋miRNA靶基因是現(xiàn)階段最基本，最快速的手段之一，目前我們常用的生物信息學(xué)預(yù)測軟件包括miRanda、miRBase、TargetScan等。

Mir-148a是mir-148/mir-152家族成員之一，其莖環(huán)結(jié)構(gòu)序列位于7號染色體負(fù)鏈上，共計68個核苷酸序列，通過調(diào)控不同的基因表達(dá)在多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。Mir-148a通過調(diào)控下游靶基因從而影響腫瘤生物學(xué)特征，有文獻(xiàn)報道，mir-148a通過抑制P27的表達(dá)促進(jìn)胃癌細(xì)胞AGS、SGC-7901、BGC-823的增殖［3］。我們應(yīng)用 miRBase、TargetScan 和 miRanda3種網(wǎng)站預(yù)測軟件對 miR-148a-3p的靶基因進(jìn)行了預(yù)測，綜合分析，最終選擇DYNLL2作為 miR-148a-3p的候選靶基因進(jìn)行研究，并對該預(yù)測結(jié)果進(jìn)行驗證，從而確定miR-148a與該基因的關(guān)系。DYNLL2（dynein light chain LC8-type 2）基因位于染色體17q22區(qū)域。cDNA為 1522bp（NM_080677.2）。DYNLL2 基因又稱做 Dlc2、DNCL1B、RSPH22，屬于SAPAP家族。DYNLL2富含于肌肉組織中，其定位于細(xì)胞膜。有研究表明DYNLL2位于細(xì)胞骨架，可能與其他蛋白形成蛋白復(fù)合體參與人體的免疫調(diào)節(jié)等［4］。Manneville等研究發(fā)現(xiàn)骨架蛋白 DYNLL2 能夠與 DLG4［5］、DLGAP1［6］、C12orf40［7］、MY05A［8］、BMF［9］共同調(diào)控靠近細(xì)胞皮層的微管動力學(xué)、微管形成，同時DYNLL2與DYNLL1都作為蛋白質(zhì)動力蛋白相互作用，參與調(diào)節(jié)微管泡和細(xì)胞器的功能，改變和維持細(xì)胞骨架的結(jié)構(gòu)和空間分布，改變基底細(xì)胞皮質(zhì)層微管動力學(xué)和結(jié)構(gòu)，進(jìn)而促使中心體的定位和細(xì)胞極性的改變［10，11］。

我們應(yīng)用實(shí)時熒光定量PCR與蛋白印跡實(shí)驗對預(yù)測結(jié)果進(jìn)行基因表達(dá)水平與蛋白表達(dá)水平的驗證，得到了一致的結(jié)果，并且通過構(gòu)建mir-148a過表達(dá)穩(wěn)定細(xì)胞系（pre-mir-148a）以及mir-148a抑制表達(dá)穩(wěn)定細(xì)胞系（anti-mir--148a），應(yīng)用實(shí)時熒光定量PCR分別驗證兩組穩(wěn)定細(xì)胞系與對照組的基因表達(dá)量，我們發(fā)現(xiàn)DYNLL2的基因表達(dá)量在mir-148a過表達(dá)的細(xì)胞系中表達(dá)明顯受到抑制，而在mir-148a抑制表達(dá)組中DYNLL2的表達(dá)明顯高于對照組，說明mir-148a對于DYNLL2基因的表達(dá)起到了抑制作用。蛋白印跡實(shí)驗同樣發(fā)現(xiàn)，與正常神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中的DYNLL2蛋白表達(dá)量相比，DYNLL2在神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的蛋白表達(dá)明顯下調(diào).q-PCR及蛋白印跡實(shí)驗均表明mir-148a對于DYNLL2的表達(dá)起到了調(diào)控作用，結(jié)合生物學(xué)預(yù)測軟件及相應(yīng)的生物分子學(xué)實(shí)驗我們可以相信，DYNLL2是受mir-148a調(diào)控的的一個靶基因，并且DYNLL2的表達(dá)量與mir-148a的表達(dá)量呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。

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Prediction and Verification of MiR-148a-3p Target Gene

Tang Xue-mei, Peng Xiao-ning
(Medical College,Hunan Normal University, Changsha 410013, China)

ObjectiveTo predict and verify the target gene of miR-148a-3p.MethodsThe putative target genes of miR-148a-3p were predicted by bioinformatics approach. Establishment of miR-148a overexpression and suppression of stable expression in glioma cell line U87/U251. QPCR experiments were used to verify the targeting relationship between miR-148a-3p and target genes. The target protein expression level was detected by Western Blot.ResultBioinformatics methods predict that dynein light chain LC8-type 2(DYNLL2) is one of the miR-148a-3p target genes, QPCR experiments showed that there were differences in the DYNLL2 expression of glioma cell line U87/U251 between glial cell line HA1800, There were differences in the over expression and inhibitory expression of miR-148a in glioma cells, The results of Western Blot showed that the protein expression of DYNLL2 was different in glial cell line HA1800 and glioma cell line U87/U251.ConclusionDYNLL2 was a target gene of miR-148a-3p, DYNLL2 is expressed both in glial cells and glioma cells. Compared with normal glial cells, the expression of DYNLL2 was down regulated in glioma cells including gene levels and protein levels, and miR-148a-3p could reversely regulate DYNLL2 expression.

MicroRNA; MiR-148a; DYNLL2

R737.14

A

1673-016X（2017）06-0003-06

2017-08-10

國家自然科學(xué)基金項目(NO．81472860)

彭小寧，E-mail：Pxiaoning@hunnu．edu．cn