楊劍鋒，許 暢，寧映霞，鄧宇傲，李 翔，李 程，陳 阿，崔迎紅

（1. 湖南師范大學(xué)醫(yī)學(xué)院，長(zhǎng)沙 410013；2. 廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院，廣州 510120；3. 深圳市人民醫(yī)院婦產(chǎn)科，深圳 518020）

白介素-8對(duì)SKOV3細(xì)胞系卵巢癌干樣細(xì)胞特性的影響

楊劍鋒1，許 暢1，寧映霞2，鄧宇傲3，李 翔1，李 程1，陳 阿1，崔迎紅1

（1. 湖南師范大學(xué)醫(yī)學(xué)院，長(zhǎng)沙 410013；2. 廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院，廣州 510120；3. 深圳市人民醫(yī)院婦產(chǎn)科，深圳 518020）

目的：研究白介素-8（IL-8）能否促成人卵巢癌SKOV3細(xì)胞系細(xì)胞腫瘤干細(xì)胞樣細(xì)胞特性。方法：用添加或未添加重組人IL-8（rhIL-8：10.0 ng/mL）的干細(xì)胞條件培養(yǎng)基處理SKOV3細(xì)胞。腫瘤球形成和瓊脂集落形成試驗(yàn)測(cè)定球形成率和集落形成率。蛋白質(zhì)印跡分析腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志蛋白CD133和CD44表達(dá)水平。結(jié)果：rhIL-8（10.0 ng/mL）顯著地增高SKOV3細(xì)胞腫瘤球形成率和瓊脂集落形成率。此外，rhIL-8（10.0 ng/mL）上調(diào)SKOV3細(xì)胞CD133和CD44蛋白表達(dá)。結(jié)論：rhIL-8具有促進(jìn)SKOV3細(xì)胞腫瘤干細(xì)胞樣細(xì)胞特性作用。

卵巢癌；腫瘤干細(xì)胞；白介素-8；自我更新；CD133；CD44

腫瘤生物學(xué)領(lǐng)域的新理論推定具有干細(xì)胞樣性質(zhì)的細(xì)胞亞群，亦稱為腫瘤干樣細(xì)胞（Cancer stem-like cells，CSLCs）驅(qū)使腫瘤發(fā)生和演進(jìn)［1］。我們先前的實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)SKOV3細(xì)胞系球細(xì)胞具有CSLCs性質(zhì)［2，3］。有研究提示白介素-8（IL-8）觸發(fā)STAT3信號(hào)傳導(dǎo)活化與卵巢癌致瘤潛能和多藥耐藥關(guān)聯(lián)［4，5］。特別重要的是大量研究結(jié)果證實(shí)IL-8參與腫瘤微環(huán)境與腫瘤干細(xì)胞交互作用，并能有效促成腫瘤干細(xì)胞特性［6-8］。本文的研究目的在于檢查和確定IL-8與人卵巢癌SKOV3細(xì)胞系細(xì)胞CSLCs特性的直接聯(lián)系。

1 材料與方法

1.1 試劑與細(xì)胞培養(yǎng) 重組人表皮生長(zhǎng)因子（EGF，Invitrogen公司，Carlsbad，CA，USA）、重組成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（bFGF，Invitrogen公司）、不含維生素A的B27添加物（Invitrogen公司）、牛血清白蛋白（BSA，Sigma-Aldrich公司）、胰島素（Sigma-Aldrich公司）、Accutase細(xì)胞分離溶液（德國(guó)PromoCell公司，）、DMEM/F12培養(yǎng)基（GIBCO公司，500mL/瓶，保存于2～8℃）、鼠抗人β-actin單克隆抗體源自美國(guó)Santa Cruz Biotechnology，Inc.公司（dilution，1：2000；cat. no. sc-7210；Santa Cruz Biotechnology，Inc. Dallas，TX，USA）；兔抗人CD133多克隆抗體源自美國(guó)Abcam，Inc. 公司（dilution，1：2000；no.ab66141；Abcam，Inc.Burlingame，CA，USA）；兔抗人CD44多克隆抗體源自美國(guó)Abcam，Inc. 公司（dilution，1：2000；no.ab41478；Abcam，Inc.Burlingame，CA，USA）；辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記兔抗鼠Ig G二抗源自中國(guó)碧云天生物技術(shù)研究所（dilution，1：2000；cat. no. A0216；Beyotime Institute of Biotechnology，中國(guó)上海市）；辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記山羊抗兔Ig G二抗源自中國(guó)碧云天生物技術(shù)研究所（dilution，1：2000；cat. no. A0239；Beyotime Institute of Biotechnology，中國(guó)上海市）；增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑購(gòu)美國(guó)Amersham Pharmacia Biotech公司（Piscataway，NJ，USA）。

人卵巢癌SKOV3細(xì)胞系細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞中心（中國(guó)上海市）。參照文獻(xiàn)［2，3］描述的方法和步驟，維持細(xì)胞生長(zhǎng)和進(jìn)行球細(xì)胞培養(yǎng)。

1.2 球形成率測(cè)定 細(xì)胞用添加或未添加rhIL-8（10.0 ng/mL）的無(wú)血清干細(xì)胞條件培養(yǎng)基懸浮細(xì)胞，以2000個(gè)/mL的密度每孔0.5 mL接種于24孔超低粘附培養(yǎng)板，培養(yǎng)6天，計(jì)數(shù)每孔腫瘤球數(shù)。球形成率計(jì)算公式：球形成率（%）=每孔球均數(shù)/接種活細(xì)胞總數(shù)（1000個(gè)細(xì)胞）×100%。

1.3 瓊脂集落形成率測(cè)定 取35mm直徑細(xì)胞培養(yǎng)皿，用含0.8% 瓊脂糖的20% FBS（GIBCO公司）DMEM/F12培養(yǎng)基每皿1.0 mL預(yù)先包被皿底，然后，配制含0.4% 瓊脂糖和 1000 個(gè)細(xì)胞以及 rhIL-8（10.0 ng/mL）添加或未添加rhIL-8（10.0 ng/mL）的無(wú)血清干細(xì)胞條件培養(yǎng)基的上層培養(yǎng)體系，每皿1.0 mL接種底層0.8%瓊脂糖之上。培養(yǎng)14天，計(jì)數(shù)每孔集落數(shù)。集落形成率計(jì)算公式：集落形成率（%）=每皿集落均數(shù)/接種活細(xì)胞總數(shù)（1000個(gè)細(xì)胞）×100%。

1.4 蛋白質(zhì)印跡 參照先前發(fā)表文獻(xiàn)［2，3］的方法和步驟完成蛋白質(zhì)印跡分析。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 各組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)錄入Spss 20.0 for windows evaluation 軟件建立數(shù)據(jù)庫(kù)，用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±SD）表示，采用One Way ANOVA方差分析；首先進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，在方差齊性情況下，多組均數(shù)間比較采用LSD法，在方差不齊情況下，多組均數(shù)間比較采用Tukey's檢驗(yàn)。P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 IL-8增強(qiáng)卵巢癌SKOV3細(xì)胞系自我更新能力

圖1顯示：與干細(xì)胞條件培養(yǎng)基培養(yǎng)的SKOV3細(xì)胞比較，添加rhIL-8（10.0 ng/mL）干細(xì)胞條件培養(yǎng)基培養(yǎng)的SKOV3細(xì)胞球形成率增高（P＜0.05）。

2.2 IL-8促進(jìn)卵巢癌SKOV3細(xì)胞瓊脂集落形成能力

圖2可見(jiàn)：與干細(xì)胞條件培養(yǎng)基培養(yǎng)的SKOV3細(xì)胞比較，添加rhIL-8（10.0 ng/mL）干細(xì)胞條件培養(yǎng)基培養(yǎng)的SKOV3細(xì)胞瓊脂集落形成能力增強(qiáng)（P＜0.05）。

2.3 IL-8上調(diào)卵巢癌SKOV3細(xì)胞CD133蛋白表達(dá)

圖3表明：與干細(xì)胞條件培養(yǎng)基培養(yǎng)的SKOV3細(xì)胞比較，添加rhIL-8（10.0 ng/mL）干細(xì)胞條件培養(yǎng)基培養(yǎng)的SKOV3細(xì)胞CD133蛋白表達(dá)明顯上調(diào)（P＜0.05）。

圖1 IL-8對(duì)SKOV3細(xì)胞系腫瘤球形成能力的影響（Mean±SD，n=3）*P＜0.05，vs.干細(xì)胞條件培養(yǎng)基培養(yǎng)的SKOV3細(xì)胞。

圖2 IL-8對(duì)SKOV3細(xì)胞系瓊脂集落形成能力的影響（Mean±SD，n=3）*P＜0.05，vs.干細(xì)胞條件培養(yǎng)基培養(yǎng)的SKOV3細(xì)胞。

圖3 IL-8對(duì)SKOV3細(xì)胞CD133蛋白表達(dá)的影響（Mean±SD，n=3）*P＜0.05，vs.干細(xì)胞條件培養(yǎng)基培養(yǎng)的SKOV3細(xì)胞。

2.4 IL-8增高卵巢癌SKOV3細(xì)胞CD44蛋白表達(dá)水平 圖4展示出：添加rhIL-8（10.0 ng/mL）干細(xì)胞條件培養(yǎng)基培養(yǎng)的SKOV3細(xì)胞CD133蛋白表達(dá)水平顯著的增高（P＜0.05）。

圖4 IL-8對(duì)SKOV3細(xì)胞CD44蛋白表達(dá)的影響（Mean±SD，n=3）*P＜0.05，vs.干細(xì)胞條件培養(yǎng)基培養(yǎng)的SKOV3細(xì)胞。

3 討論

IL-8是一種具有促進(jìn)中性粒細(xì)胞趨化和脫顆粒相關(guān)的促炎性趨化因子。該趨化因子激活兩種細(xì)胞表面G蛋白偶聯(lián)受體（CXCR1和CXCR2）下游多條細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路。在腫瘤細(xì)胞，內(nèi)皮細(xì)胞，浸潤(rùn)嗜中性粒細(xì)胞和腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞，已鑒定IL-8和/或其受體的表達(dá)明顯增加，提示IL-8可能是腫瘤微環(huán)境中重要調(diào)節(jié)因子。Tsuyada等［7］報(bào)道乳腺癌細(xì)胞分泌多種細(xì)胞因子（包括IL-8）激活乳腺癌相關(guān)成纖維細(xì)胞STAT3，依次，乳腺癌相關(guān)成纖維細(xì)胞分泌趨化因子（CC基序）配體2（CCL2）誘導(dǎo)乳腺癌腫瘤干細(xì)胞特征，構(gòu)成一個(gè)“癌-間質(zhì)-癌”信號(hào)回路。然而，IL-8是否能直接促成卵巢癌SKOV3細(xì)胞系細(xì)胞CSLCs特性還有待實(shí)驗(yàn)研究驗(yàn)證。為了確定IL-8是否與卵巢癌SKOV3細(xì)胞CSLCs功能和特性直接因果性聯(lián)系，我們通過(guò)對(duì)比檢測(cè)在干細(xì)胞條件培養(yǎng)基中添加rhIL-8和干細(xì)胞條件培養(yǎng)基處理的SKOV3細(xì)胞腫瘤球形成率和軟瓊脂集落形成率。結(jié)果證明：rhIL-8顯著地增強(qiáng)SKOV3細(xì)胞體外致瘤性，包括CSLCs的自我更新和錨定非依賴性生長(zhǎng)潛能。

特別重要的是，添加rhIL-8的干細(xì)胞條件培養(yǎng)基明顯上調(diào)腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志蛋白CD133和CD44表達(dá)。因此，我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果提供了清楚的證據(jù)表明：IL-8能夠直接導(dǎo)致SKOV3細(xì)胞CSLCs特性獲得。本文的研究成果為深入研究腫瘤細(xì)胞、腫瘤干樣細(xì)胞自分泌以及與腫瘤細(xì)胞或腫瘤干樣細(xì)胞交互作用的腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞或腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞分泌IL-8誘導(dǎo)卵巢癌CSLCs特性獲得的分子機(jī)制提供了參考性依據(jù)。

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［2］ Ning Y, Luo C, Ren K, et al. FOXO3a-mediated suppression of the self-renewal capacity of sphere-forming cells derived from the ovarian cancer SKOV3 cell line by 7-difluoromethoxyl-5, 4'-di-n-octyl genistein［J］. Mol Med Rep.2014, 9(5): 1982-1988.

［3］ Ning YX, Li QX, Ren KQ, et al. Cao JG.7-difluoromethoxyl-5, 4'-din-octyl genistein inhibits ovarian cancer stem cell characteristics through the downregulation of FOXM1［J］. Oncol Lett.2014, 8(1):295-300.

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Effect of interleukin-8 on characteristics of cancer stem-like cells derived from human ovarian cancer cancer SKOV3 cell line

Yang Jian-Feng1, Xu Chang1, Ning Ying-Xia2, Deng Yu-ao3, Li Xiang1, Li Cheng1, Chen A1, Cui Ying-Hong1
(1. Medical College, Hunan Normal University, Changsha 410013, China;2. Gynaecology and Obstetrics, The First Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University, Guangzhou 510120, China;3. Department of Gynecology and Obstetrics, Shenzhen People’s Hospital, Shenzhen 518020, China)

ObjectiveTo investigate whether interleukin-8(IL-8) could promote the characteristics of cancer stem-like cells from ovarian cancer SKOV3 cell line.MethodsSKOV3 cells were treated with and without stem cell condition medium addition with recombination human IL-8(rhIL-8: 10.0 ng/mL). Sphere forming ratio and clone forming ratio was detected using sphere forming assay and clone forming assay. The expression of cancer stem cell marker proteins including CD133 and CD44 was analyzed using western blot.ResultsrhIL-8(10.0 ng/mL) significantly increased sphere forming ratio and clone forming ratio in SKOV3 cells. Moreover, the expression of CD133 and CD44 was up-regulated by rhIL-8(10.0 ng/mL).ConclusionrhIL-8 could promote the cancer stem like cells characteristics in SKOV3 cells.

ovarian cancer; cancer stem cell; IL-8; self-renewal; CD133; CD44

A

1673-016X（2017）06-0001-03

2017-08-09

國(guó)家自然青年基金 (No．81301894), 廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目(No．2014A020211028)，廣州市教育系統(tǒng)科研項(xiàng)目(No．1201410508)；廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目(2014A020242128)

李程，E-mail:1263770390@qq．com