蔣臘梅，伍偉景，陳 勇，張 勇

（1.湖南師范大學(xué)醫(yī)學(xué)院，長(zhǎng)沙 410013；2.中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院，長(zhǎng)沙 410005；3.湖南省計(jì)劃生育研究所，長(zhǎng)沙 410008）

年齡相關(guān)聽力損失小鼠耳蝸和蝸核組織中MeCP2_BDNF的變化

蔣臘梅1，伍偉景2，陳 勇3，張 勇1

（1.湖南師范大學(xué)醫(yī)學(xué)院，長(zhǎng)沙 410013；2.中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院，長(zhǎng)沙 410005；3.湖南省計(jì)劃生育研究所，長(zhǎng)沙 410008）

目的：探討年齡相關(guān)性聽力損失小鼠聽覺系統(tǒng)中甲基化CpG結(jié)合蛋白2（MeCP2）和腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（BDNF）的表達(dá)隨月齡增長(zhǎng)的變化。方法：應(yīng)用蛋白免疫印跡、熒光定量逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈反應(yīng)方法，分別檢測(cè)3、6、12、18月齡鼠耳蝸和蝸核組織中MeCP2、BDNF的表達(dá)。結(jié)果：MeCP2、BDNF在4個(gè)不同月齡組小鼠耳蝸和蝸核組織中均有表達(dá)，隨著月齡增加，MeCP2蛋白表達(dá)及BDNF mRNA表達(dá)水平呈一致性下降趨勢(shì)，6、12、18月齡組均明顯低于3月齡組，各組間比較差異有顯著性。結(jié)論：年齡相關(guān)性聽力損失與聽覺系統(tǒng)中MeCP2及其相關(guān)基因BDNF的表達(dá)下調(diào)密切相關(guān)。

年齡相關(guān)性聽力損失；MeCP2；BDNF；聽覺系統(tǒng)；小鼠

由于年齡增長(zhǎng)使聽覺器官衰老、退變而出現(xiàn)的雙耳對(duì)稱、緩慢進(jìn)行性的感音神經(jīng)性聽力減退，稱為老年性耳聾或年齡相關(guān)性聽力損失，屬于生理性的自然老化過程，病理改變從外周的耳蝸毛細(xì)胞、螺旋韌帶、血管紋、螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞到中樞的蝸核、上橄欖核、外側(cè)丘系核、下丘核、內(nèi)側(cè)膝狀體核直至聽覺皮層均有累及。

年齡依賴性MeCP2減少與年齡相關(guān)的神經(jīng)退行性疾病和許多老化疾病有關(guān)［1-2］，筆者之前的研究暗示，MeCP2年齡依賴性的減少可能與聽覺系統(tǒng)老化及老年性耳聾相關(guān)［3-5］。但是，MeCP2是如何啟動(dòng)聽覺系統(tǒng)老化、導(dǎo)致老年性耳聾的？目前仍不清楚，發(fā)現(xiàn)MeCP2下游靶基因是理解MeCP2相關(guān)性疾病發(fā)病的關(guān)鍵性的一步，近來已發(fā)現(xiàn)BDNF是MeCP2的下游靶基因［6-7］，而BDNF與老年性耳聾的發(fā)病有直接關(guān)系［8-9］，可是其功能的關(guān)聯(lián)還未確定。本研究就年齡相關(guān)性聽力損失小鼠聽覺通路耳蝸和蝸核組織中MeCP2、BDNF的表達(dá)隨月齡增長(zhǎng)的變化作初步探討?，F(xiàn)將實(shí)驗(yàn)方法及結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 BALB/c小鼠由西安交通大學(xué)實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物中心SPF實(shí)驗(yàn)部提供，在SPF環(huán)境下飼養(yǎng)并純種傳代。分組：經(jīng)聽覺腦干電反應(yīng)（ABR）檢測(cè)，選擇有聽力下降的6月齡鼠（聽力閾值平均為（51.5±6.7）dB SPL）、12月齡鼠（聽力閾值平均為（92.5±7.5）dB SPL）、18月齡鼠（120 dB SPL刺激聲無誘發(fā)反應(yīng)）各20只，體重30～45 g；健康 3 月齡鼠20只，體重20～25 g，聽力閾值平均為（24.8±5.1）dB SPL。四組動(dòng)物均無噪聲暴露及藥物使用史，活殺時(shí)無中耳炎。

1.1.2 主要器材 ERA1260 腦干誘發(fā)電位儀（丹麥Madsen公司）；XSS-40雙目手術(shù)顯微鏡（杭州醫(yī)用光學(xué)儀器廠）；超凈工作臺(tái)（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）；ELX800酶標(biāo)儀（BIO-TEK INSTRUMENT. INC）；高速冷凍離心機(jī)、DUR530核酸蛋白分析儀（Beckman公司）；凝膠成像分析系統(tǒng)、微型垂直平板電泳槽及其配套電轉(zhuǎn)移系統(tǒng)（Bio-Rad公司）；PCR儀、測(cè)序儀（美國(guó)ABI公司）。

1.1.3 主要試劑 兔抗鼠MeCP2單克隆抗體、丙烯酰胺（Sigma公司）；HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體（Gibco公司）；Tris堿（Serva公司）；十二烷基磺酸鈉（SDS）（天津天泰精細(xì)化學(xué)品公司）；低分子量蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)（上海華舜生物有限公司）；RT-PCR兩步法試劑盒（Promega公司）；引物（上海生工生物工程公司）；RNA提取試劑Trizol（Invitrogen公司）。

1.2 方法

1.2.1 腦干電反應(yīng)測(cè)聽（ABR） 小鼠用1%戊巴比妥鈉按50mg/kg行腹腔注射麻醉，待麻醉滿意后，在具有良好接地的隔音室內(nèi)〔環(huán)境溫度（25±3）℃〕應(yīng)用Madsen ERA1260腦干誘發(fā)電位儀測(cè)試。采用直徑0.38 mm、長(zhǎng)1.5寸的針灸針作電極。記錄電極放置在顱頂，參考電極及接地電極分別置于給聲耳及對(duì)側(cè)耳耳后皮下。刺激聲為8 kHz短純音，帶通濾波100～3000 Hz，重復(fù)率11次/s，疊加1024次，掃描時(shí)程10 ms。聲刺激強(qiáng)度從115 dB SPL開始，10 dB遞減，接近閾值時(shí)改為5 dB遞減，觀察Ⅲ波以確定閾值，取每只小鼠右耳結(jié)果進(jìn)行分析。

1.2.2 蝸核定位 按George Paxinos and Charles Watson制定的定位方法：耳蝸核位于延髓嘴側(cè)端的背外側(cè)面，包括背側(cè)核和腹側(cè)核。背側(cè)核呈半月形，斜跨小腦尾側(cè)腳的背側(cè)面，形成隆起的聽結(jié)節(jié)，完全被小腦覆蓋，其內(nèi)側(cè)端達(dá)到第四腦室的側(cè)緣，其外側(cè)端繞延髓外面向腹側(cè)和嘴側(cè)伸展，與腹側(cè)核相連續(xù)。腹側(cè)核形狀較圓，位于延髓嘴側(cè)端三叉神經(jīng)脊束的表面，與背側(cè)核相連并部分被背側(cè)核迭蓋。

1.2.3 標(biāo)本的預(yù)處理 按蝸核定位方法于手術(shù)顯微鏡下取出雙側(cè)蝸核，隨后取出雙側(cè)聽泡，分離出耳蝸。立即用4℃ 0.1 mol/L PBS緩沖液（pH 7.4）洗凈血跡，迅速放入液氮中保存待測(cè)。

1.2.4 蛋白免疫印跡（Western blot） ①各月齡組耳蝸及蝸核組織標(biāo)本總蛋白的制備 各實(shí)驗(yàn)組液氮下碾碎50mg左右組織標(biāo)本，加入預(yù)冷的三去污裂解液200～500μL，充分混勻，冰浴30min，4℃下13 000rpm離心20min，上清液即為細(xì)胞蛋白提取液，以牛血清白蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)品，Bradford方法進(jìn)行蛋白質(zhì)定量，將所有蛋白樣品調(diào)至等濃度，分裝后儲(chǔ)于-70℃?zhèn)溆?。②電泳及電轉(zhuǎn)移 SDS-聚丙烯酰胺（SDS-PAGE）電泳凝膠配制，分離膠Tris溶液為 1.5 mol/LTris（pH8.8），積層膠Tris溶液為1.0 mol/L Tris（pH6.8）；各實(shí)驗(yàn)組以40μg總蛋白上樣，以起始電壓80 V電泳，待樣品電泳至分離膠，電壓調(diào)至120 V，電泳結(jié)束后，取下凝膠進(jìn)行電轉(zhuǎn)移（100V/400mA 電轉(zhuǎn)移1.5 h）。③封閉及雜交 將PVDF膜用PBST漂洗后，浸入封閉液中，緩慢振蕩1h；PBST洗膜15min×3次；加入MeCP2一抗（1∶1000），4℃搖床孵育過夜；PBST洗膜15min×3次；加入羊抗兔IgG/HRP二抗（1∶10000）室溫孵育1.5 h；PBST洗膜15min×3次；將PVDF膜置于HRP-ECL化學(xué)發(fā)光試劑中反應(yīng)1～3 min。暗室中使X光片曝光，常規(guī)方法顯影定影。④圖像分析 將X光片上的目的蛋白條帶在Gel DoC 2000凝膠成像系統(tǒng)中掃描存檔，通過目的蛋白與內(nèi)參照β-actin的光密度比值來衡量表達(dá)情況。

1.2.5 逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈反應(yīng)（RT-PCR） ①引物設(shè)計(jì) 根據(jù)Bdnf、β-actin的mRNA序列（genebank序列號(hào)NM_007540、NM_007393），應(yīng)用在線引物設(shè)計(jì)軟件primer3設(shè)計(jì)，相關(guān)引物由上海生工生物工程公司合成純化。Bdnf PCR引物設(shè)計(jì)如下：

目的基因 引物序列（5’-3’） 大小（bp）循環(huán)次數(shù)Bdnf 正義鏈：atgagacccggttccttcaa反義鏈：tcgtcgtcagacctctcgaa退火條件（℃）341 60 32 β-actin 正義鏈：caactgggacgacatggaga反義鏈：aaccgctcgttgccaatagt 534 60 32

2 結(jié)果

2.1 各月齡組小鼠耳蝸和蝸核組織MeCP2的Western blot分析 MeCP2在不同月齡小鼠耳蝸和蝸核組織中均有表達(dá)，并隨月齡增長(zhǎng)MeCP2蛋白表達(dá)水平均逐漸下降，耳蝸及蝸核組織的MeCP2蛋白表達(dá)OD比值（MeCP2/β-actin）在3、6、12、18月齡組分別為 0.7816±0.049、0.4008±0.059、0.1806±0.029、0.051±0.011（見圖 1）及 0.7964±0.036、0.6356±0.022、0.2941±0.030、0.1287±0.029（見圖2）。6、12、18月齡組小鼠耳蝸及蝸核的MeCP2蛋白表達(dá)量均明顯低于3月齡組，進(jìn)行組間兩兩比較，其差異均有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

圖1 各組耳蝸中MeCP2蛋白表達(dá)電泳圖

圖2 各組蝸神經(jīng)核中MeCP2蛋白表達(dá)電泳圖

2.2 各月齡組小鼠耳蝸和蝸核組織BDNF mRNA的表達(dá) BDNF在不同月齡組小鼠耳蝸和蝸核組織中均有表達(dá)，并隨月齡增長(zhǎng)BDNF基因表達(dá)逐漸減弱，耳蝸及蝸核組織的BDNF mRNA表達(dá)OD比值（Bdnf/β-actin）在3、6、12、18月齡組分別為0.3759±0.037、0.310±0.023、0.201±0.028、0.132±0.021（見圖 3）及0.4156±0.032、0.3331±0.032、0.2264±0.031、0.1031±0.029（見圖4）。6、12、18月齡組小鼠耳蝸及蝸核組織的BDNF mRNA表達(dá)量均比3月齡組明顯減少，且組間兩兩比較均存在顯著差異（P＜0.01）。

圖3 各組耳蝸中Bdnf mRNA表達(dá)電泳圖

圖4 各組蝸神經(jīng)核中Bdnf mRNA表達(dá)電泳圖

2.3 PCR產(chǎn)物測(cè)序及BLAST比較分析 分別用合成的引物對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，運(yùn)用DNASTAR軟件中的Seqman Ⅱ?qū)y(cè)序結(jié)果進(jìn)行分析，證實(shí)RT-PCR產(chǎn)物與目的基因Bdnf mRNA序列完全一致（見圖5）。

3 討論

老年性耳聾的發(fā)病率很高，人類40歲以后隨年齡增長(zhǎng)聽力逐漸減退。12月齡小鼠相當(dāng)于人類60～65歲，開始進(jìn)入初老階段。BALB/c純種小鼠易患年齡相關(guān)性聽力損失，表現(xiàn)為進(jìn)行性的高頻聽力損失，其聽力下降的模式與人類相似，而且鼠與人類的遺傳基因組非常相似，適用于老年性耳聾的研究。

老年性耳聾是人體老化在聽覺器官中的表現(xiàn)，聽覺系統(tǒng)的老化不僅累及耳蝸外周，而且多級(jí)聽覺中樞均受到影響。MeCP2年齡依賴性的減少是普遍老化所共有的，年齡依賴性的MeCP2減少亦可能與聽覺系統(tǒng)的老化密切相關(guān)。而MeCP2啟動(dòng)聽覺系統(tǒng)老化、導(dǎo)致老年性耳聾的關(guān)鍵點(diǎn)，可能是通過調(diào)控其下游靶基因BDNF的表達(dá)來實(shí)現(xiàn)的。

近年研究［6-7］發(fā)現(xiàn)，BDNF是MeCP2的下游靶基因，腦中MeCP2的缺乏已顯示出降低了BDNF的全面表達(dá)，但MeCP2缺乏引起B(yǎng)DNF表達(dá)的全面下調(diào)是一個(gè)謎。Abuhatzira等［10］報(bào)道，在人和小鼠腦中MeCP2的缺乏引起兩個(gè)神經(jīng)元基因轉(zhuǎn)錄抑制子REST（RE1 silencing transcription factor，REST）和CoREST表達(dá)的增加，MeCP2與其結(jié)合并卷入Rest和CoRest啟動(dòng)子的抑制中；在MeCP2缺乏鼠的腦中增高的REST和CoREST水平導(dǎo)致BDNF的下調(diào)，顯然是依靠它們（MeCP2和BDNF）與RE1成分的結(jié)合，RE1定位于BDNF基因開始的兩個(gè)啟動(dòng)子之間。有趣的是，編碼BDNF受體TrkB的NTRK2基因在MeCP2缺乏的人和小鼠腦中過表達(dá)，或直接地、或作為一代償企圖補(bǔ)償BDNF的不足。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果，年齡相關(guān)聽力損失小鼠耳蝸和蝸核組織中MeCP2的表達(dá)隨增齡明顯減少，同時(shí)BDNF的表達(dá)亦隨增齡明顯減少，其機(jī)制有可能涉及上述假說。

BDNF，是與神經(jīng)元的生存、分化和突觸的可塑性有關(guān)的腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，對(duì)聽覺和前庭系統(tǒng)神經(jīng)的發(fā)育和存活有重要作用，與感音神經(jīng)性老年性耳聾的發(fā)病有直接關(guān)系。內(nèi)耳感覺上皮中前體細(xì)胞為BDNF合成細(xì)胞，前庭與耳蝸神經(jīng)元以及支配內(nèi)耳的自主神經(jīng)與傳出神經(jīng)的分化、發(fā)育與存活均可能受某些神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子NTs（如BDNF）及其受體（如TrkB）調(diào)節(jié)。BDNF為可塑性反應(yīng)受動(dòng)器，成熟期神經(jīng)元可塑性降低，認(rèn)為是與BDNF水平下降有關(guān)。近來研究［8-9］發(fā)現(xiàn)，在老化時(shí)高頻段的耳蝸神經(jīng)元和毛細(xì)胞中的BDNF表達(dá)減少，表明BDNF與老年性耳聾的發(fā)病有關(guān)。

而MeCP2是BDNF的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)者，MeCP2的缺乏引起兩個(gè)神經(jīng)元基因轉(zhuǎn)錄抑制子REST和CoREST表達(dá)的增加，并依靠MeCP2和BDNF與RE1成分的結(jié)合，導(dǎo)致BDNF表達(dá)的全面下調(diào)。BDNF對(duì)聽覺系統(tǒng)神經(jīng)的發(fā)育和存活有重要作用，年齡依賴性的BDNF表達(dá)減少與感音神經(jīng)性老年性耳聾的發(fā)病有直接關(guān)系。本研究結(jié)果，年齡相關(guān)聽力損失小鼠耳蝸和蝸核組織中MeCP2及BDNF的表達(dá)水平隨增齡呈一致性下降趨勢(shì)，暗示年齡依賴性的MeCP2減少亦或致BDNF表達(dá)下調(diào)而與老年性聾相關(guān)。

因此我們推測(cè)，年齡相關(guān)性聽力損失可能與聽覺系統(tǒng)中MeCP2及其相關(guān)基因BDNF的表達(dá)下調(diào)密切相關(guān)，為進(jìn)一步尋找一種直接、有效、可行的防治老年性耳聾的方法打下基礎(chǔ)。

圖5 Bdnf基因RT-PCR產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果

［1］ Richardson B. Impact of aging on DNA methylation［J］. Ageing Res Rev, 2003, 2(3): 245-261.

［2］ Maeqawa S, Hinkal G, Kim HS, et al. Widespread and tissue specific age-related DNA methylation changes in mice［J］. Genome Res, 2010,20(3): 320-340.

［3］ 蔣臘梅, 張勇, 葛圣雷, 等. 小鼠增齡過程中耳蝸MeCP2的變化［J］.激光生物學(xué)報(bào), 2011, 20(1): 7-10.

［4］ 蔣臘梅, 伍偉景, 彭斌, 等. 不同月齡小鼠蝸神經(jīng)核中甲基化CpG結(jié)合蛋白2的表達(dá)及臨床意義［J］. 中國(guó)老年學(xué)雜志, 2011, 31(20):3966-3968.

［5］ 蔣臘梅, 伍偉景, 陳勇. 年齡相關(guān)聽力損失小鼠耳蝸組織中甲基化CpG結(jié)合蛋白2的變化［J］. 醫(yī)學(xué)臨床研究, 2016, 33(12): 2312-2314.

［6］ Chen WG, Chang Q, Lin Y, et al. Derepression of BDNF transcription involves calcium-dependent phosphorylation of MeCP2［J］. Science.2003, 302(5646): 885-889.

［7］ Im, H. -I. , Hollander, J. A. , Bali, P. , & Kenny, P. J. . MeCP2 controls BDNF expression and cocaine intake through homeostatic interactions with microRNA-212. Nature Neuroscience, 2010, 13(9), 1120–1127.

［8］ Rüttiger L, Panford-Walsh R, Schimmang T, et al. BDNF mRNA expression and protein localization are changed in age-related hearing loss［J］. Neurobiol Aging, 2007, 28(4): 586-601.

［9］ 李玉茹, 劉得龍, 張媛媛, 等. 腦衍生的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子及其受體trk B在老年性大鼠耳蝸中的表達(dá)［J］. 臨床耳鼻咽喉科雜志.2006,20(19): 894-895.

［10］ Abuhatzira L, Makedonski K, Kaufman Y. MeCP2 deficiency in the brain decreases BDNF levels by REST/CoREST - mediated repression and increases TRKB production［J］. Epigenetics.2007, 2(4): 214-222.

Changes of MeCP2 and BDNF in the cochlea and cochlear nuclei of BALB/c mice with age- related hearing loss

Jiang La-mei1, Wu Wei-jing2, Chen Yong3, Zhang Yong1
(1. The Medicine College of Hunan Normal University, Changsha 410013, China; 2. Second Xiangya Hospital of Central South University,Changsha 410005, China; 3. Hunan Family Planning Research Institute, Changsha 410008, China)

ObjectiveTo investigate the changes of methyl-CpG-binding protein 2(MeCP2), and brain-derived neurotrophic factor (BDNF) expressions in the auditory system of BALB/c mice with age-related hearing loss.MethodsThe levels of MeCP2 protein in the cochlea and cochlear nuclei of BALB/c mice among four age groups (3-, 6-, 12- and 18-month-old) were detected and compared via Western blot assay. Detection and analysis of the expression of BDNF mRNA in the cochlea and cochlear nuclei were carried out by reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) on 3-, 6-, 12- and 18-month- oldBALB/c mice, respectively.ResultsMeCP2 and BDNF were expressed in both cochlea and cochlear nuclei of BALB/c mice in four age groups. Western blot assay showed that the levels of MeCP2 protein in the cochlea and cochlear nuclei tissues of mice gradually decline with the increase of age.Resultsof RT-PCR demonstrated that the mRNA expression of BDNF decreased as the age increasing. The optical density (OD) ratio of MeCP2 and BDNF were significantly lower in 6-, 12- and 18-monthold mice than in 3-month-old mice, there was a statistically significant difference between each two groups.ConclusionThe age-related hearing loss is close related to the consistent age-relatedly down-regulated expression of MeCP2 and its correlation genes BDNF in auditory system.

age-related hearing loss; MeCP2; BDNF; auditory system; BALB/c mice

R764.436

A

1673-016X（2017）06-0008-05

2017-06-12

湖南省教育廳科學(xué)研究重點(diǎn)項(xiàng)目（13A061）；湖南省財(cái)政廳教育支出立項(xiàng)課題（湘財(cái)教指〔2015〕199號(hào)）

蔣臘梅，E-mail：1421129082@qq．com