熊婧 胡丹 張振濤 張兆輝

國家自然科學(xué)基金青年基金項目(項目編號為81501107)

430060 武漢大學(xué)人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)一科[熊婧 胡丹 張振濤 張兆輝(通信作者)]

甲氰菊酯聯(lián)合多巴胺對小鼠多巴胺能神經(jīng)通路的影響

熊婧 胡丹 張振濤 張兆輝

目的觀察甲氰菊酯(Fenpropathrin，F(xiàn)en)單獨腹腔注射及與多巴胺(Dopamine，DA)立體定向注射聯(lián)合使用對C57BL小鼠黑質(zhì)紋狀體多巴胺能神經(jīng)通路的影響。方法分別采用Fen腹腔注射、DA立體定向注射至紋狀體及DA預(yù)處理聯(lián)合Fen注射建立C57BL小鼠模型，觀察小鼠行為學(xué)變化，HPLC檢測腦組織內(nèi)Fen的含量；激光共聚焦顯微鏡觀察小鼠的黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元及紋狀體的TH染色。結(jié)果Fen及DA分別單獨使用及DA預(yù)處理聯(lián)合Fen注射均造成小鼠自主活動能力減少，HPLC檢測顯示小鼠腦組織中Fen的濃度與腹腔Fen給藥濃度成正比，TH染色發(fā)現(xiàn)Fen連續(xù)使用7 d和DA立體定向注射后第7 d的小鼠黑質(zhì)均出現(xiàn)神經(jīng)元中TH表達不均一，并且紋狀體出現(xiàn)斑片狀的TH染色丟失，其中DA預(yù)處理后使用Fen注射7 d組改變最明顯。結(jié)論Fen能夠透過小鼠血腦屏障，可以直接作用于小鼠黑質(zhì)紋狀體多巴胺能系統(tǒng)，并且可以明顯增強DA對黑質(zhì)紋狀體的損傷作用。

甲氰菊酯 帕金森病 多巴胺 酪氨酸羥化酶

甲氰菊酯(Fenpropathrin，F(xiàn)en)是一種常用的擬除蟲菊酯類農(nóng)藥，具有高效能、殺蟲譜廣、低殘留等特點，近年來被廣泛應(yīng)用于家庭防蚊和農(nóng)業(yè)除蟲。Fen對高等動物的毒性中等，但在魚類等水產(chǎn)生物中毒性可以蓄積，由于其在環(huán)境中半衰期較長，在河塘底泥中不易降解，因此Fen在我國已被禁用于水產(chǎn)業(yè)，然而仍有一些漁民將Fen用于池塘毒魚。我們曾收治了1例42歲的帕金森病(Parkinson’s disease,PD)患者，該患者曾在發(fā)病前約1年有間斷撿食魚塘中Fen毒殺的瀕死的魚，該過程長達半年之久，后來逐漸表現(xiàn)出PD樣癥狀。根據(jù)該患者獨特的既往史，我們推測Fen很可能與其發(fā)病有關(guān)。前期研究發(fā)現(xiàn)Fen可以在體外模型中模擬PD的部分發(fā)病機制及病理學(xué)特點[1]，本研究將進一步觀察Fen對C57BL小鼠行為學(xué)及黑質(zhì)紋狀體多巴胺能神經(jīng)通路的影響，以探明Fen與PD發(fā)病的相關(guān)性，為尋找PD新的病因提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要的儀器與試劑

甲氰菊酯(Fenpropathrin,Fen)購于浙江省東陽市金鑫化學(xué)工業(yè)公司，純度為92%；DA為鹽酸多巴胺注射液，20 mg/2 mL，購自廣州白云山明興藥業(yè)；兔抗酪氨酸羥化酶(tyrosine hydroxylase,TH)抗體購自美國Abcam公司；異硫氰酸熒光素(FITC)標記羊抗兔熒光二抗、Hoechst 33258染料購自ProteinTech Group 公司；高效液相色譜儀(Agilent 120，美國)，激光共聚焦顯微鏡(Zeiss公司，德國)，大鼠腦立體定向儀購自瑞沃德生命科技有限公司；實驗動物為健康雄性C57BL/6小鼠，體重18-22克，購自武漢大學(xué)動物實驗中心。

1.2 實驗分組與給藥

本實驗共分為7組，隨機分為對照組、Fen 1 d組，F(xiàn)en 7 d組， DA立體定向注射后2 d組，DA 預(yù)處理+Fen 1 d組，DA立體定向注射后8 d組和DA 預(yù)處理+Fen 7 d組。Fen給藥方式為每日定時腹腔注射給藥，給藥劑量為47.8 mg·kg-1·d-1(0.2 LD50)；DA給藥方式為立體定向注射，劑量為20 μg，注射部位為小鼠右側(cè)紋狀體；DA預(yù)處理+Fen組為DA立體定向注射24 h后開始給予Fen腹腔注射。

1.3 HPLC檢測腦組織中Fen含量

檢測Fen 47.8 mg·kg-1·d-1(0.2 LD50)1 d組和Fen 95.6 mg·kg-1·d-1(0.4 LD50)1 d組中腦組織中Fen含量。小鼠于給藥后24 h斷頭取腦、稱重，并加入丙酮充分勻漿，隨后加入石油醚、2%硫酸鈉水溶液提取，之后干燥、吹干、凈化后使用Agilent 1260檢測儀檢測，檢測儀器類型為紫外(205 nm)，色譜柱為Hypersil 4.6×200 mm(5 μm)，柱溫為25 ℃，流動相為85%甲醇+15%水，流量為1 mL/min，檢測室溫為17 ℃。計算方法：外標法定量，保留時間定性。當標準品與樣品進樣體積相同時，計算公式為R=(C*V)/W，R為組織中Fen含量(μg/g)，C為樣品濃度(μg/mL)，W為標本重量(g)。

1.4 小鼠體重及行為學(xué)檢測

小鼠于給藥前及給藥后每日相同時間測量體重，行為學(xué)檢測包括小鼠總體行為學(xué)觀察、爬桿實驗及直立實驗。爬桿實驗：將小鼠放置于一根垂直于地面的長50 cm，粗1 cm的木桿頂上，其中桿頂固定有一個泡沫塑料小球，將小鼠雙后肢置于球上，呈尾部向上、頭部向下的姿勢，讓其爬下，然后記錄小鼠從桿頂向下爬至兩側(cè)前肢均觸及木桿底部平臺的時間，如小鼠3 min內(nèi)未爬下，時間記錄為最長時間180 s。直立實驗：將小鼠放入一個30 cm×30 cm×15 cm的有機玻璃盒，安靜環(huán)境下讓小鼠適應(yīng)10 min，隨后記錄小鼠5 mim內(nèi)自發(fā)站立的次數(shù)，分別記錄5次，計算均值。

1.5 免疫熒光染色觀察TH表達水平

用10%苯巴比妥鈉麻醉小鼠后4%的多聚甲醛灌注固定，斷頭取腦后腦組織置于4%多聚甲醛中固定，隨后使用蔗糖梯度脫水沉底，標本速凍后切片。冰凍切片使用0.1% Triton破膜，10%BSA室溫封閉2 h，再滴加TH(1∶500)抗體4 ℃孵育過夜，常溫下復(fù)溫30 min，滴加相應(yīng)FITC標記的羊抗兔抗體，37 ℃避光孵育1 h，Hoechst 33258室溫染色，隨后封片、固定，激光共聚焦顯微鏡下觀察。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 HPLC檢測到小鼠腦組織中有Fen殘留

HPLC檢測發(fā)現(xiàn)Fen 47.8 mg/kg和Fen95.6 mg/kg腹腔注射24 h后小鼠腦組織中均有Fen殘留，殘留量分別為0.97 μ/g和1.63 μ/g，殘留量與注射量成正比。

2.2 小鼠體重改變

Fen腹腔注射1 d及7 d組小鼠均未出現(xiàn)異常行為學(xué)變化，注射后小鼠攝食減少，體重進行性減輕，在前3 d明顯，后來體重緩慢增加，與對照組體重增長速度比較有明顯差異(P<0.05)。DA立體定向組，小鼠第2 d體重一過性下降，第3 d開始增長正常，與對照組比較無明顯差異，而Fen+DA共同作用7 d組小鼠體重進行性下降，約到第4 d出現(xiàn)體重穩(wěn)定，此后緩慢增長，體重增長速度與對照組比較，有明顯差異(P<0.05)(圖1)。

圖1 不同藥物處理后小鼠體重的變化

2.3 小鼠行為學(xué)改變

爬竿實驗中Fen 7 d組，DA 立體定向注射后8 d組及DA 預(yù)處理+Fen 7 d組爬竿時間均延長，與對照組比較有明顯差異(P<0.05)(圖2),但是在爬桿實驗過程中藥物注射組的小鼠缺乏下桿的動作及部分小鼠停留在桿頂，從而檢測時間異常延長。在直立實驗中Fen 7 d組及DA預(yù)處理+Fen 7 d組5 min內(nèi)直立次數(shù)分別減少至對照組的38.34%和32.33%，與對照組比較有明顯差異(P<0.05)(圖2)。

圖2 小鼠行為學(xué)變化 A為爬竿實驗；B為直立實驗；Control組為對照組；Fen組為Fen7d組；DA組為DA立體定向注射后8d組；Fen+DA組為DA預(yù)處理+Fen7d組。與Control組比較，?P<0．05

2.4 小鼠黑質(zhì)TH染色

對照組小鼠黑質(zhì)神經(jīng)元中TH染色均勻分布于胞漿及突起中，神經(jīng)元胞體飽滿，突起染色明顯(圖3)，F(xiàn)en 1 d組(圖3)、DA立體定向注射2 d組(圖3)及DA預(yù)處理+Fen1 d組(圖3)TH染色顯示黑質(zhì)神經(jīng)元TH分布均一，細胞形態(tài)改變不大，與對照組比較無明顯差異，而Fen7 d組(圖3)、DA注射后8 d組(圖3)及DA預(yù)處理+Fen7 d組(圖3)TH染色顯示黑質(zhì)神經(jīng)元胞漿TH染色不均勻，形態(tài)欠飽滿，尤其是在DA預(yù)處理+Fen7 d組小鼠黑質(zhì)TH染色陽性細胞較對照組明顯變少，并且細胞中TH染色不均。

圖3 黑質(zhì)神經(jīng)元TH染色(×20倍) A為對照組；B為Fen1d組；C為DA立體定向注射后2d組；D為DA預(yù)處理+Fen1d組；E為Fen7d組；F為DA立體定向注射后8d組；G為DA預(yù)處理+Fen7d組

2.5 小鼠紋狀體TH染色

對照組小鼠紋狀體TH染色較均一(圖4)，然而DA立體定向注射后2 d組TH染色顯示紋狀體中存在斑片狀TH染色缺失(圖4)，并且DA預(yù)處理+Fen 1 d組(圖4)，F(xiàn)en 7 d組(圖4)，DA立體定向注射后8 d組(圖4)及DA預(yù)處理+Fen7 d組(圖4)紋狀體TH染色的熒光強度較對照組均減弱。

3 討 論

PD病因不明，目前認為散發(fā)型PD是遺傳因素、年齡老化以及環(huán)境毒素等多因素共同作用的結(jié)果。農(nóng)藥是一種常見的環(huán)境毒素，在生產(chǎn)生活中廣泛應(yīng)用，與PD發(fā)病的關(guān)聯(lián)性已在部分農(nóng)藥中得到證實[2-3]。Fen作為一種上個世紀中期才研發(fā)出來的一種新型的擬除蟲菊酯類農(nóng)藥，它與PD的相關(guān)性研究尚很少。本課題組在前期研究中發(fā)現(xiàn)Fen

圖4 紋狀體TH染色(×10倍) A為對照組；B為Fen1d組；C為DA立體定向注射后2d組；D為DA預(yù)處理+Fen1d組；E為Fen7d組；F為DA立體定向注射后8d組；G為DA預(yù)處理+Fen7d組

在體外模型中可以模擬PD的部分發(fā)病機制及病理學(xué)改變[1]，而體內(nèi)環(huán)境是多種因素共同作用的結(jié)果，遠比單一的體外環(huán)境復(fù)雜，因此本研究進一步探討Fen單獨及聯(lián)合高DA水平對小鼠黑質(zhì)紋狀體系統(tǒng)的作用。

血腦屏障是機體中樞神經(jīng)系統(tǒng)的一個特殊結(jié)構(gòu)，可以阻止外周血液中的有害物質(zhì)進入顱內(nèi)，是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的特殊防御結(jié)構(gòu)。本研究使用HPLC檢測腹腔注射Fen的小鼠腦組織中Fen的含量，證實Fen可以透過血腦屏障，直接作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，且顱內(nèi)Fen的濃度與外周Fen給藥濃度呈正比。Fen等擬除蟲菊酯類農(nóng)藥不溶于水或難溶于水，但可溶于有機溶劑，具有很強的脂溶性，可經(jīng)消化道、呼吸道及皮膚黏膜進入人體，可以改變細胞表面各種離子通道的電位，影響各種細胞功能，有研究發(fā)現(xiàn)氯氰菊酯[4]和溴氰菊酯[5]等農(nóng)藥可以透過血腦屏障，干擾中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能，尤其長期氯氰菊酯暴露可以減少大鼠黑質(zhì)紋狀體系統(tǒng)中DA的含量，造成多巴胺能神經(jīng)元死亡[6]。預(yù)實驗中我們觀察DA預(yù)處理后的小鼠在24 h后加用Fen 95.6 mg·kg-1·d-1腹腔注射時小鼠很快出現(xiàn)抽動，隨后死亡，考慮2個藥物連用明顯增加了對小鼠的毒性作用，因此后續(xù)試驗中使用Fen 47.8 mg·kg-1·d-1為Fen腹腔注射濃度。

帕金森病典型的病理改變是黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元的進行性丟失和路易小體的形成。黑質(zhì)紋狀體多巴胺能神經(jīng)通路相對于別的腦區(qū)還有更高濃度的DA水平。DA作為一種內(nèi)源性神經(jīng)遞質(zhì)，在PD及某些神經(jīng)精神疾病中發(fā)揮重要作用，然而DA也是一種內(nèi)源性神經(jīng)毒素，它能夠誘導(dǎo)神經(jīng)細胞內(nèi)生成活性氧(ROS)，加重氧化應(yīng)激反應(yīng)，并可以誘導(dǎo)蛋白質(zhì)構(gòu)象異常[7]，選擇性增加DA能神經(jīng)細胞死亡[8]。本研究通過立體定向注射DA到小鼠紋狀體，增加黑質(zhì)紋狀體DA含量，觀察Fen與DA分別作用及DA預(yù)處理后聯(lián)合Fen使用對黑質(zhì)紋狀體的影響，結(jié)果顯示DA預(yù)處理+Fen7 d組的小鼠與單獨Fen 7 d組的小鼠比較，體重持續(xù)下降，且不可恢復(fù)，而DA立體定向組只有短暫的體重下降，并且行為學(xué)檢測發(fā)現(xiàn)Fen7 d組和DA預(yù)處理+Fen7 d組小鼠的自由活動能力明顯低于對照組，并且DA預(yù)處理+Fen7 d組低于Fen7 d組，而DA單獨使用組無明顯異常。Fen7 d組小鼠的黑質(zhì)神經(jīng)元中TH染色沒有明顯的改變，而DA 8 d組和DA預(yù)處理+Fen7 d組均看到黑質(zhì)神經(jīng)元胞漿和紋狀體TH染色減弱，并且DA預(yù)處理+Fen7 d組中TH染色較對照組改變最明顯。這提示Fen對動物存在毒性作用，與DA聯(lián)合使用時可以加重DA對黑質(zhì)神經(jīng)元的損傷。

Fen誘導(dǎo)黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元損傷的機制未明。一方面Fen可以降解為氰化物和醛，氰化物可以干擾線粒體呼吸鏈，加重細胞氧化應(yīng)激損傷。有研究發(fā)現(xiàn)擬除蟲菊酯類農(nóng)藥能夠抑制動物線粒體呼吸鏈復(fù)合體Ⅰ的活性[9]及細胞色素C氧化酶的活性，從而增加ROS的生成和線粒體損傷。在富含DA的黑質(zhì)紋狀體系統(tǒng)中氧化應(yīng)激反應(yīng)尤為明顯，DA可以氧化NADH，加重線粒體損傷，增加活性氧釋放，參與PD的發(fā)病[7]，由此本研究推測氧化應(yīng)激反應(yīng)在Fen誘導(dǎo)的神經(jīng)細胞損傷中有重要作用。在溴氰菊酯[10]及氯氰菊酯[11]的大鼠模型中均證實該類農(nóng)藥可以增加神經(jīng)系統(tǒng)脂質(zhì)過氧化水平，增加氧化應(yīng)激反應(yīng)；另一方面Fen可以作用于昆蟲或動物細胞膜上的鈉離子通道，增加Na+內(nèi)流，從而延長鈉離子通道開放的時間[12]。多巴胺轉(zhuǎn)運體(Dopamine transporter，DAT)是多巴胺能細胞表面的重要蛋白，它可以將突觸間隙的DA再攝取至細胞內(nèi)，它受Na+/Cl-離子依賴型轉(zhuǎn)運蛋白基因家族編碼[13]，因此Fen可能作用于DAT蛋白，增加DA的再攝取，加重多巴胺能神經(jīng)元內(nèi)DA的毒性反應(yīng)，從而使Fen與DA聯(lián)用的黑質(zhì)紋狀體系統(tǒng)的損傷尤為明顯。

綜上所述，F(xiàn)en與DA聯(lián)用可以增加DA對DA能神經(jīng)通路的損傷，但具體機制還需進一步探討。由于本研究采取的是Fen及DA急性短期作用模型，在研究中未檢測到黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元數(shù)目的明顯減少及典型的PD樣行為學(xué)改變，很多神經(jīng)系統(tǒng)改變可能是對環(huán)境毒素的延遲反應(yīng)，因此Fen對黑質(zhì)多巴胺神經(jīng)系統(tǒng)的長期毒性作用仍需進一步觀察。

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Thetoxiceffectoffenpropathrinanddopamineondopaminergicsystemofmice

XiongJing,HuDan,ZhangZhentao,etal.

DepartmentofNeurology,RenminHospitalofWuhanUniversity,Wuhan430060

ObjectiveTo explore and compare the effects of fenpropathrin intraperitoneal injection or combined with DA stereotacical injection on dopamine system of mice.MethodsFenpropathrin was injected intraperitoneally or combined with the DA stereotactically injected at the striatum of the mouse brain.The behaviors features of animals were investigated using pole jumping test and head up test.HLPC was used to detect the fenpropathrin in the mice brain after fenpropathrin intraperitoneal injection. The immunoreactivity of tyrosine hydroxylase in the brains were observed by immunohistochemistry.ResultsBehavior investigation indicated that both fenpropathrin intraperitoneal injection or combined with the DA stereotactically injection could decrease the mice's activity.Fenpropathrin was dectected in the brain by HPLC.Immunohistochemistry study suggested that the tyrosine hydroxylase immunoreactivity were decreased in striatum of fenpropathrin combined with the DA group.DAT immunoreactivity were increased in the striatum after fenpropathrin exposure.ConclusionFenpropathrin could cross the blood brain barrier,enhanced the toxicity of DA on dopamine system.

Fenpropathrin Parkinson's disease Dopamine Tyrosine hydroxylase

R742.5

A

1007-0478(2017)05-0393-05

10.3969/j.issn.1007-0478.2017.05.003

(2017-03-04收稿)