薛偉紅 王友春 韓宏鋒 李志賓 楊 靜
乙型肝炎病毒感染與原發(fā)性肝癌的關(guān)聯(lián)性及危險因素分析
薛偉紅 王友春 韓宏鋒 李志賓 楊 靜
目的研究乙型肝炎病毒感染與原發(fā)性肝癌間關(guān)聯(lián)性,并對危險因素探討。方法慢性乙型肝炎病毒感染患者220例,其中慢性乙肝小三陽64例(小三陽組),慢性乙型肝炎大三陽62例(大三陽組),慢性乙型肝炎肝硬化50例(肝硬化組),乙型肝炎相關(guān)原發(fā)性肝癌44例(原發(fā)性肝癌組)。觀察4組乙肝病毒DNA不同含量(采用乙型肝炎病毒檢測試劑盒檢測)患者分布情況及表達(dá)水平;采用PCR擴(kuò)增方法檢測4組患者乙肝病毒DNA含量,采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗測定乙肝表面抗原。結(jié)果4組患者乙肝病毒DNA不同含量患者分布比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),小三陽組DNA不同含量患者分布與大三陽組、肝硬化組、原發(fā)性肝癌組比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。小三陽組乙肝病毒DNA表達(dá)水平高于大三陽組、肝硬化組和原發(fā)性肝癌組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),大三陽組乙肝病毒DNA表達(dá)水平高于肝硬化組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(q=3.884,P<0.05)。4組患者乙肝表面抗原水平差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),小三陽組與大三陽、肝硬化組和原發(fā)性肝癌組比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),大三陽組與肝硬化組和原發(fā)性肝癌組比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。原發(fā)性肝癌組5~15年、>15年吸煙率,>15年飲酒率高于肝硬化組,不良飲食、e抗原陽性發(fā)生率高于肝硬化組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論慢性乙肝小三陽、大三陽、肝硬化、原發(fā)性肝癌中,乙型肝炎病毒DNA水平和乙肝表面抗原呈下降趨勢,長期吸煙、飲酒,不良飲食習(xí)慣和e抗原陽性是原發(fā)性肝癌發(fā)病的危險因素。
乙型肝炎病毒;肝腫瘤;危險因素
(ThePracticalJournalofCancer,2017,32:1489~1493)
原發(fā)性肝癌位居全球癌癥死亡原因第2位,在亞太地區(qū)相關(guān)死亡中位居第3位,男性原發(fā)性肝癌的發(fā)病率顯著高于女性,在亞太地區(qū),慢性乙型肝炎仍然是除日本外亞太主要國家原發(fā)性肝癌的主要發(fā)病原因[1-2]。全球疾病負(fù)擔(dān)表明了慢性乙型肝炎病毒感染的高發(fā)病率和高死亡率,盡管過去有所減少[3]。雖然我國對原發(fā)性肝癌預(yù)防實施了改善風(fēng)險因素和有效篩查,但乙型肝炎發(fā)病率仍比較高,增加了原發(fā)性肝癌引起的病死率[4]。本研究對乙型肝炎病毒感染與原發(fā)性肝癌間關(guān)聯(lián)性分析及危險因素探討,以期對臨床和預(yù)防工作提供借鑒。
1.1 一般資料
選取2014年3月至2016年9月在我院住院治療的慢性乙型肝炎病毒感染患者220例,其中男性160例,女性60例;年齡35~63歲,平均年齡(54.2±6.8)歲;其中慢性乙肝小三陽64例(小三陽組),慢性乙型肝炎大三陽62例(大三陽組),慢性乙型肝炎肝硬化50例(肝硬化組),乙型肝炎相關(guān)原發(fā)性肝癌44例(原發(fā)性肝癌組)。4組患者一般資料比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。
表1 4組患者一般資料比較
注:*為χ2值,#為F值。
1.2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn)
納入標(biāo)準(zhǔn):①患者均符合“慢性乙型肝炎防治指南(2015年版)”[5]相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn);②年齡≥30歲;③患者和(或)家屬知情同意,簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn):①藥物性、代謝性、自身免疫性肝??;②其他類型病毒感染性肝炎、肝硬化或相關(guān)性肝癌;③繼發(fā)性肝癌;④近期使用免疫抑制劑、生物制劑等治療的患者;⑤患者和(或)家屬不同意進(jìn)行相關(guān)研究。
1.3 方法
1.3.1 乙肝病毒DNA含量檢測 采用乙型肝炎病毒(DNA)檢測試劑盒(廈門海菲生物技術(shù)有限公司)。抽取患者清晨空腹肘靜脈血2 ml,置于滅菌的一次性非肝素抗凝試管中,取分離出的血清0.2 ml送檢。血清標(biāo)本在2 ℃~8 ℃可放置72 h,-70 ℃可長期保存,標(biāo)本不宜反復(fù)凍融。①標(biāo)本、對照品的處理和加樣:血清標(biāo)本、試劑盒內(nèi)陽性對照、陰性對照、YVDD對照、YIDD對照各取50 μl(凍存血清或?qū)φ掌肥褂们霸谑覝厝诮?,振蕩混?0 s),分別加入50 μl核酸提取液,振蕩10 s,99 ℃干浴或水浴10 min,13 000 r/min離心10 min,保留上清備用。處理后的樣品應(yīng)在3 h內(nèi)使用,或在-20 ℃~-80 ℃最長保存1個月(不宜反復(fù)凍融)。②DNA標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行10、100、1000倍梯度稀釋:取N×36 μl混合液與N×0.4 μl酶(Taq+UNG)混勻(N為反應(yīng)管數(shù)),3 000 r/min離心10 s,取36.4 μl上述PCR反應(yīng)混合液于適當(dāng)容量離心管中,然后將樣品、陽性對照、陰性對照、YVDD對照、YIDD對照處理上清液和梯度稀釋的HBV DNA標(biāo)準(zhǔn)品各4 μl分別加入離心管中,立即進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。③PCR擴(kuò)增:離心管置于定量熒光PCR儀上,ABI7000、MJ-II、ABI7900循環(huán)參數(shù)設(shè)置:37 ℃×2 min,94 ℃×2 min;再按93 ℃×15 s→60 ℃×60 s,循環(huán)40次;熒光檢測在60 ℃,反應(yīng)體系為40 μl,HBV DNA定量檢測選用FAM通道。④將定量標(biāo)準(zhǔn)品及各稀釋度拷貝數(shù)濃度輸入儀器軟件中。
1.3.2 乙肝表面抗原檢測 采用人乙型肝炎病毒表面抗原定量檢測試劑盒(藍(lán)圖生物科技有限公司)。采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗進(jìn)行測定。抽取患者清晨空腹肘靜脈血2 ml,使用不含熱原和內(nèi)毒素的試管,操作過程中避免任何細(xì)胞刺激,4 000 rpm條件下離心20 min,小心地分離出血清,保存在-20 ℃以下,避免反復(fù)凍融。有試劑和組分都先恢復(fù)到室溫,標(biāo)準(zhǔn)品、質(zhì)控品和樣品,建議做復(fù)孔。①按前面說明書描述的方法,配制好試劑盒各種組分的工作液。②從鋁箔袋中取出所需板條,剩余的板條用自封袋密封放回冰箱。③設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔、樣本孔和空白孔,標(biāo)準(zhǔn)品孔各加不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品50 μL。④樣本孔加待測樣本50 μL。⑤除空白孔外,標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔,加入辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的檢測抗體50 μL。⑥用封板膜蓋住反應(yīng)板,37 ℃水浴鍋或恒溫箱溫育120 min。⑦揭開封板膜,棄去液體,吸水紙上拍干,每孔加滿洗滌液,靜置1 min,甩去洗滌液,吸水紙上拍干,如此重復(fù)5次。若使用自動洗板機(jī),請按洗板機(jī)操作程序進(jìn)行洗板,添加浸泡30 s的程序,可以提高檢測的精度。洗板結(jié)束,加底物前,要在干凈不掉屑的紙上,充分拍干反應(yīng)板。⑧將底物A和B按1∶1體積充分混合,所有孔中加入底物混合液100 μL。用封板膜蓋住反應(yīng)板,37 ℃水浴鍋或恒溫箱溫育15 min。⑨所有孔加入終止液50 μL,在酶標(biāo)儀上讀取各孔吸光度(OD值)。
1.4 觀察指標(biāo)
①觀察4組乙肝病毒DNA不同含量患者分布情況及表達(dá)水平;②觀察4組患者乙肝表面抗原水平,并進(jìn)行相關(guān)性分析;③收集肝硬化組和肝癌組的臨床資料,對吸煙、飲酒、不良飲食習(xí)慣、e抗原陽性等危險因素進(jìn)行分析。
1.5 統(tǒng)計學(xué)分析
2.1 4組乙肝病毒DNA不同含量患者表達(dá)水平比較
4組患者乙肝病毒DNA不同含量患者分布比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(Hc=83.203,P<0.05),小三陽組DNA不同含量患者分布與大三陽組、肝硬化組、原發(fā)性肝癌組比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2值分別為39.044、99.663和50.243,P<0.05),其余3組比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2值分別為7.038、2.100和1.102,P>0.05)。小三陽組乙肝病毒DNA表達(dá)水平高于大三陽組、肝硬化組和原發(fā)性肝癌組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(q值分別為16.297、19.136和16.616,P<0.05),大三陽組乙肝病毒DNA表達(dá)水平高于肝硬化組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(q=3.884,P<0.05),原發(fā)性肝癌組乙肝病毒DNA表達(dá)水平與大三陽組、肝硬化組比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(q值分別為1.896、1.750,P>0.05)。見表2。
表2 4組乙肝病毒DNA不同含量患者分布情況及表達(dá)水平比較(例,%)
2.2 4組患者乙肝表面抗原水平比較
4組患者乙肝表面抗原水平差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),小三陽組與大三陽組、肝硬化組和原發(fā)性肝癌組比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(q值分別為56.787,125.644、123.697,P<0.05),大三陽組與肝硬化組和原發(fā)性肝癌組比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(q值分別為71.527、71.557,P<0.05),原發(fā)性肝癌組與肝硬化組比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(q=2.4662,P>0.05),見表3、圖1。
表3 4組患者乙肝表面抗原水平比較
圖1 4組患者乙肝表面抗原水平分布圖
2.3 肝硬化組和原發(fā)性肝癌組危險因素分析
原發(fā)性肝癌組5~15年、>15年吸煙率,>15年飲酒率高于肝硬化組,不良飲食、e抗原陽性發(fā)生率高于肝硬化組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),見表4。
表4 肝硬化組和原發(fā)性肝癌組危險因素分析(例,%)
肝細(xì)胞癌是人類主要死亡原因之一,而乙型肝炎病毒是世界上肝癌最常見的病因,尤其在亞洲、非洲、東歐和中歐南部乙型肝炎病毒流行的地區(qū)表現(xiàn)尤為突出[6-10]。芝加哥-美國臨床腫瘤學(xué)會年會上公布的研究結(jié)果顯示,與丙肝患者相比,乙肝患者更易在較年輕時發(fā)展為肝癌,且多為侵襲性、低分化腫瘤,往往生長較快,門靜脈血栓形成,腫瘤大于5 cm,50%以上癌癥在肝臟,α甲胎蛋白較高和診斷時即為晚期[11]。因此研究乙型肝炎病毒感染與原發(fā)性肝癌間的關(guān)系及危險因素十分重要。
血清中乙肝病毒DNA水平是乙肝病毒復(fù)制的可靠定量指標(biāo),患者的病毒載量會隨時間的推移而變化,這取決于患者的年齡和感染“階段”,如處于"活動"期的患者,病毒載量升高,表現(xiàn)出肝損害癥狀,此類患者需要治療[12-15]。Bell等[16]對186位免疫活性較高的乙型肝炎患者進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn),38位患者進(jìn)行了肝臟活檢,22位谷丙轉(zhuǎn)氨酶超過正常上限2倍的患者中有12位、18位乙肝DNA>20 000 IU/mL的患者中有11位中重度肝炎或纖維化,說明HBV DNA升高增加晚期肝纖維化風(fēng)險。本研究發(fā)現(xiàn),4組患者乙肝病毒DNA不同含量患者分布比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),小三陽組DNA不同含量患者分布與大三陽組、肝硬化組、原發(fā)性肝癌組比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。小三陽組乙肝病毒DNA表達(dá)水平高于大三陽組、肝硬化組和原發(fā)性肝癌組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),大三陽組乙肝病毒DNA表達(dá)水平高于肝硬化組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。說明慢性乙型肝炎病毒DNA水平并不是判定乙型肝炎肝臟相關(guān)疾病進(jìn)展的標(biāo)準(zhǔn),但可以作為輔助手段判定乙型肝炎病毒相關(guān)性肝癌的傳染性,但不能直接反應(yīng)病情進(jìn)展情況。
血清中乙肝表面抗原定量檢測的意義在于,它不僅反應(yīng)了病毒與宿主免疫應(yīng)答的平衡,同時乙肝表面抗原的水平也取決于cccDNA轉(zhuǎn)錄能力;此外,乙肝表面抗原水平的升高還標(biāo)志著新的感染或再發(fā),乙肝表面抗原水平的降低意味著T淋巴細(xì)胞的活力起作用[17-19]。對于非活動期的HBV攜帶者而言,乙肝表面抗原水平可以作為1個附加的工具,將e抗原陰性、肝功能正常的但卻有高復(fù)發(fā)風(fēng)險的人群與非活動期的攜帶者區(qū)分開來。Tseng等[19]對2 688 例B或C基因型慢性HBV感染但非肝硬化初治患者進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn),e抗原陽性、高水平HBV DNA以及高水平丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶均與原發(fā)性肝癌高發(fā)病率相關(guān),同時研究還發(fā)現(xiàn),HBsAg水平與原發(fā)性肝細(xì)胞癌風(fēng)險具有量效相關(guān)性。本研究發(fā)現(xiàn),4組患者乙肝表面抗原水平差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),小三陽組與大三陽、肝硬化組和原發(fā)性肝癌組比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),大三陽組與肝硬化組和原發(fā)性肝癌組比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),原發(fā)性肝癌組與肝硬化組比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),原發(fā)性肝癌組5~15年、>15年吸煙率,>15年飲酒率高于肝硬化組,不良飲食、e抗原陽性發(fā)生率高于肝硬化組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。這與上述研究結(jié)果相近。同時Chien等[20]研究發(fā)現(xiàn),診斷肝硬化時年齡較大、HBeAg 陽性、rs671 AA/AG 基因型、ALT、AFP和HBsAg水平升高是慢性乙型肝炎肝硬化患者發(fā)生肝癌的風(fēng)險預(yù)測因素。
綜上所述,慢性乙肝小三陽、大三陽、肝硬化、原發(fā)性肝癌中,乙型肝炎病毒DNA水平和乙肝表面抗原呈下降趨勢,長期吸煙、飲酒,不良飲食習(xí)慣和e抗原陽性是原發(fā)性肝癌發(fā)病的危險因素。
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(編輯:吳小紅)
CorrelationofHepatitisBVirusInfectionandPrimaryLiverCancerandRiskFactors
XUEWeihong,WANGYouchun,HANHongfeng,etal.
LuoyangCentralHospitalAffiliatedtoZhengzhouUniversity,Luoyang,471000
ObjectiveTo study the relationship between hepatitis B virus infection and primary liver cancer,and to explore the risk factors.Methods220 patients with chronic hepatitis B virus infection were selected,including 64 cases of chronic hepatitis(positive group),62 cases of chronic hepatitis B HBeAg(HBeAg positive group),50 cases of chronic hepatitis B cirrhosis(cirrhosis group),44 cases of hepatitis B primary hepatocellular carcinoma(PHC).PCR amplification method was used to detect hepatitis B virus DNA content of the 4 groups,and DAS-ELISA was used to detect hepatitis B surface antigen.ResultsDistribution of patients with different hepatitis B virus DNA content of the 4 groups had statistically significant difference(P<0.05),Distribution of patients with different hepatitis B virus DNA content of positive group and the other groups had statistically significant difference(P<0.05).Hepatitis B virus DNA expression level of positive group was higher than the other groups,the difference was statistically significant(P<0.05),the expression level of hepatitis B virus DNA of HBeAg positive group was higher than cirrhosis group,the difference was statistically significant(q=3.884,P<0.05).The difference was statistically significant in hepatitis B surface antigen levels among the 4 groups(P<0.05),positive group and the other groups had statistically significant difference(P<0.05),HBeAg positive group and liver cirrhosis group and HCC group had statistically significant difference(P<0.05).The rate of smoking was 5 years and >15 years in the primary liver cancer group,and the drinking rate was higher in the >15 group than that in the liver cirrhosis group.The incidence of adverse diet and e antigen was higher than that of the liver cirrhosis group,the difference was statistically significant(P<0.05).ConclusionIn chronic hepatitis,HBeAg,cirrhosis,hepatocellular carcinoma,hepatitis B virus DNA and hepatitis B surface antigen gradually decrease,long-term smoking,drinking,unhealthy eating habits and e antigen are risk factors of primary liver cancer.
Hepatitis B virus;Liver neoplasms;Risk factors
471000 鄭州大學(xué)附屬洛陽中心醫(yī)院
10.3969/j.issn.1001-5930.2017.09.028
R735.7
A
1001-5930(2017)09-1489-05
2017-04-05
2017-06-12)